响应面试验优化绿豆凝集素提取工艺_黄泽华

本研究采用响应面法优化了绿豆凝集素的提取工艺，并用 硫酸铵双重盐析的方法取代一步层析操作，减小了凝集素 活性的损失，起到了很好的纯化效果并降低了成本。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂 绿豆 大连白桦粮谷加工有限公司；兔血为健康成
年大白兔耳缘静脉血；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠 辽宁 泉瑞试剂有限公司；戊二醛50%溶液 上海生化试剂公 司；胰蛋白酶 上海原叶生物科技有限公司；硫酸铵 天津市大茂化学试剂厂。
(1. College of Food Science, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China; 2. Agri-Food Processing and Engineering Technology Research Center of Heilongjiang Province, Daqing 163319, China)
依据参考文献[15-16]，对凝集素提取过程影响较大 的因素有料液比（g/mL）、NaCl浓度、浸提时间等[17]，
通过实验探讨其对绿豆凝集素凝集凝集活性的影响，设
计三因素三水平响应面试验；并通过单因素试验确定绿
豆粉碎粒度、浸提温度最佳参数。准确称取5 g 绿豆粉
（60～80 目），以料液比1∶10，采用最佳浸提缓冲溶
在单因素试验的基础上采用三因素三水平的响应面 分析方法[18-19]，分别以A、B、C代表料液比、NaCl浓度、
浸提时间3 个因素，试验设计见表1。采用Design-Expert
设计Box-Behnken试验。17 个试验点可分为两类：一类 为析因点，自变量取值在A、B、C所构成的三维顶点， 共有12 个析因点；另一类为零点，为区域的中心点，零 点试验重复5 次，用以估计试验误差。
※工艺技术
食品科学
2014, Vol.35, No.20 31
响应面试验优化绿豆凝集素提取工艺
黄泽华1，王倩雯1，张 贺1，李育楠1，李庆波1，曹龙奎1,2,*
（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江 大庆 163319；2.黑龙江省农产品加工工程技术研究中心，黑龙江 大庆 163319）
摘 要：凝血法检测绿豆凝集素活性，并改进凝集活性检测兔血红细胞处理条件，在单因素试验的基础上设计响应 面Box-Behnken试验，优化绿豆凝集素提取工艺条件。结果表明，凝集活性检测兔血红细胞的处理最佳条件为戊二 醛体积分数0.15%、25 ℃处理血细胞20 min；胰蛋白酶添加量25 U/mL、25 ℃处理15 min，优化条件下提高了兔血 红细胞凝集灵敏度且延长了兔血红细胞保存时间。磷酸盐缓冲溶液为绿豆凝集素最佳浸提溶液，绿豆凝集素优化工 艺条件为料液比1∶9.09（g/mL）、NaCl浓度0.3 mol/L、浸提时间4.16 h，在此条件下最大绿豆凝集素比活力预测和 验证值分别为134.91 U/mg和139.02 U/mg。 关键词：绿豆凝集素；响应面法；优化；提取
液，在20 ℃条件下100 r/min摇床振荡浸提4 h，测定浸
提液凝集活性。固定其他条件，分别对绿豆粉碎粒度
（40～120 目及120 目以上）、浸提温度（5～50 ℃）、
料液比（1∶4～1∶12）、NaCl浓度（பைடு நூலகம்～0.6 mol/L）及浸
提时间（2～10 h）进行考察。
1.3.5 绿豆凝集素浸提响应面优化
maximum activity of mung bean lectin by response surface analysis. The maximum activity of mung bean lectin was
predicted to be 134.91 U/mg and observed to be 139.02 U/mg under the optimum extraction conditions: solid-to-liquid ratio,
1.3.3 最佳浸提缓冲溶液的确定
采用0.2 mol/L、pH 7.2 磷酸盐缓冲液浸提，0.9%
生理盐水浸提，0.1 mol/L、pH 6.0柠檬酸缓冲溶液，
0.1 mol/L、pH 9.51碳酸缓冲溶液浸提以及蒸馏水在相同
条件下浸提，分别测定提取液凝集活性，确定最佳提取 缓冲溶液[14]。
1.3.4 绿豆凝集素浸提条件单因素试验
0
ᠺҼ䟋փ〟࠶ᮠ 0% 0.05% 0.10% 0.15%
50 100 150 200 250 300 ‫؍‬ᆈᰦ䰤/h
图 1 戊二醛处理兔血红细胞对其4 ℃保存稳定性的影响
Fig.1 Effect of glutaraldehyde treatment on the stability rabbit red
Abstract: The experiment was designed to use erythrocytes for assaying the agglutinating activity of mung bean lectin,
and to improve the processing conditions for glutaraldehyde- and trypsin-treated rabbit red blood cells. Rabbit red blood
Table 1
表 1 响应面试验因素与水平 Coded levels for independent variables used in response
surface analysis (RSA)
因素
A 料液比（g/mL） B NaCl浓度/（mol/L）
C 浸提时间/h
水平
－1
0
1
1∶8
1∶10
中图分类号：R284.2
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2014）20-0031-06
doi:10.7506/spkx1002-6630-201420007
绿豆凝集素具有细胞凝集作用[1]，新鲜兔血红细胞凝 血法检测的可重复性差，对红细胞进行戊二醛固定、胰 蛋白酶处理，可以提高红细胞的感受性和稳定性，从而 增加检测的灵敏度和可重复性[2]。绿豆凝集素是由4 个亚 基构成四聚体的糖蛋白，分子质量约为160 kD，是绿豆 中主要的抗营养因子之一，由Charles等[3]分离得到。饱和 硫酸铵沉淀[4]、羧甲基纤维素离子交换层析[5]和凝胶过滤[6] 是绿豆凝集素的纯品制备的主要方法，但是这种方法采 用了两次层析步骤，分离效率低，造成大量凝集素活性 损失，成本高并且耗时。纯化手段的不足限制了凝集素 在生物学[7]、医学[8]和动物营养学[9]等领域的应用，因此 需要寻找新的简便且可整合的分离纯化凝集素的方法。
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食品科学
※工艺技术
1.2 仪器与设备
T6新世纪紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪
器有限责任公司；TD5A型离心机 长沙英太仪器有限
公司；AR2100型电子天平 奥斯豪国际贸易有限公司；
HD-9707电脑紫外检测仪 上海精科实业有限公司。
1.3 方法
1.3.1 绿豆凝集素的凝集素活力检测 凝血法测定绿豆凝集素活性[10]。兔血红细胞的处理
收稿日期：2013-10-31 基金项目：“十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAD34B0205） 作者简介：黄泽华（1988—），男，硕士研究生，研究方向为农产品加工。E-mail：huangzehua1988@ *通信作者：曹龙奎（1965—），男，教授，博士，研究方向为农产品加工。E-mail：caolongkui2013@
1:9.09 (g/mL); NaCl concentration, 0.3 mol/L; and extraction time, 4.16 h.
Key words: mung bean lectin; response surface analysis; optimization; extraction
※工艺技术
食品科学
2014, Vol.35, No.20 33
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了其保存时间；但当戊二醛达到0.20%时，处理20 min 会使兔血红细胞泥的颜色变黑，并且红细胞间黏着性
空，作为对照。凝集活性滴度，指在96 孔凝血板上使兔 血红细胞凝集的最小稀释倍数，2n。凝集素活力单位和
比活力计算见公式（1）、（2）。
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25 µLhࠍ䳶㍐㋇ᨀ⏢㳻ⲭ䍘⎃ᓖ ࠍ䳶⍫ᙗ┤ᓖ˄2n˅
（1）
∄⍫࣋/˄U/mg˅˙
1 mgh1 000 ࠍ䳶㍐⍫࣋অս
（2）
1.3.2 蛋白质含量测定 采用Lowry法，以牛血清蛋白作为标准[13]。
将双重硫酸铵盐析后的蛋白质沉淀配成10 mg/mL溶 液1 mL，上已经平衡好的Sephadex G-75层析柱，以流速 0.7 mL/min生理盐水进行洗脱，用核酸蛋白检测仪进行检 测，自动收集器进行接样，4 min/管[21]。
2 结果与分析
2.1 兔血红细胞处理方法优化
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19.5 17.5 15.5 13.5 11.5 9.5 7.5 5.5 3.5 1.5 ˉ0.5
cells (RBC) were fixed with 0.15% (V/V) glutaraldehyde at 25 ℃ for 20 min, and the RBC were treated with trypsin
(25 U/mL) at 25 ℃ for 15 min to increase the assay activity and extend their preservation time. In the investigation, we
found that the most suitable extraction solvent for mung bean lectin was phosphate buffer solution. Based on the results of
single-factor experiments, a Box-Behnken design (BBD) of three variables at three levels each was carried out to obtain
blood cells stored at 4 ℃
从图1可知，未经戊二醛固定处理的新鲜兔血红细胞 及以体积分数为0.05%～0.10%的戊二醛处理的兔血红细 胞在4 ℃保存时，10 d内均发生溶血，凝集活性失去或降 低，说明溶液中的戊二醛的醛基不能与全部兔血红细胞 表面的氨基发生交联反应使红细胞得以固定，戊二醛添 加量不足。以0.15%戊二醛处理的在第10天依然没有凝集 活性降低，事实上在第30天依然具有良好的凝集活性， 说明0.15%戊二醛能够使全部的红细胞得以固定，延长
参考Turner[11]、彭建宗[12]等的报道，并改进25 ℃时戊二
醛及胰蛋白酶对兔血红细胞处理的浓度和时间，以适用
于绿豆凝集素的检测。在96 孔凝血板上系列倍比稀释
（从前一孔吸取25 μL液体，放入下一孔内，充分混合后
取25 μL液体放入下一孔内，如此操作至倒数第2个孔)， 每一排第一孔稀释两倍（21），留下每一排的最后一
1∶12
0.2
0.3
0.4
2
4
6
1.3.6 绿豆凝集素的盐析提取 对绿豆凝集素浸提液进行两次30%～70%的梯
度硫酸铵盐析[20]。第1次盐析分别收集30%～40%、 40%～50%、50%～60%和60%～70%硫酸铵饱和度盐析 沉淀，测定凝集活性，将凝集活性最高的硫酸铵盐析沉 淀混合后，同样方法进行第2次硫酸铵盐析。收集凝集活 性最高的盐析沉淀物用于层析纯化。 1.3.7 葡聚糖凝胶层析对绿豆凝集素浸提液进行纯化
Response Surface Methodology to Optimize the Extraction Process of Mung Bean Lectin
HUANG Ze-hua1, WANG Qian-wen1, ZHANG He1, LI Yu-nan1, LI Qing-bo1, CAO Long-kui1,2,*