几丁质酶抑制检测

平板透明圈法测定几丁质酶抑制率

一、实验原理

几丁质酶在节肢动物蜕皮过程中发挥了极为重要作用，通过抑制几丁质酶的活性，阻止幼虫和蛹蜕皮起到杀虫作用。几丁质酶抑制化合物筛选平板含有胶体几丁质和琼脂。在平板上打孔加入酶液。几丁质酶能分解平板中的胶体几丁质而产生透明圈。用相同量的酶液与待测液混合是，与对照相比，透明圈越小表明受抑制程度越高。

二、试剂和仪器

1、几丁质酶液：0.5U/ml 几丁质酶溶于磷酸缓冲液中。

2、PBS缓冲液：溶液A Na2HPO4浓度0.2mmol/ml，71.6g Na2HPO4溶于1L蒸馏水中；

溶液B NaH2PO4浓度0.2mmol/ml，31.2g NaH2PO4溶于1L蒸馏水中；

取A 37.5ml、B 62.5ml混合PH=6.6 4℃保存，一周使用完。

3、几丁质胶配置：取粉状几丁质2g置于烧杯中，加入40ml浓盐酸搅拌，几丁质被浓盐酸溶解成糊状物质，加入200ml去离子水，不断搅拌至乳白色胶体析出，将胶体用200目纱布过滤，倒去滤液。在胶体中加入200ml去离子水搅拌过滤，重复此步骤至PH﹥5，再用磷酸缓冲液冲洗胶体至中性左右。4℃密封保存备用。试验前取出定量胶体几丁质，加去离子水溶解，配置成浓度为0.5%的溶液，进行超声处理，使溶液成为均质絮状胶体溶液。

4、平板配置：取胶态几丁质5g，琼脂粉2g，用蒸馏水定容至100ml，在250ml三角瓶中加热搅拌至沸腾，室温冷却至60℃，摇匀倒平板，冷却至培养基凝固。

三、试验步骤

用内径为D=8mm打孔器在制备好的平板上对称打4个孔。

四、计算

透明质酸酶抑制率（%）=(D对照- D样品）/ D对照×100%

试中：D对照—对照组的透明圈直径

D样品—测试组的透明圈直径