第二章(7)植物体细胞遗传学

第二章（7）植物体细胞遗传学

1 体细胞遗传学研究的内容

体细胞遗传学是遗传学、细胞学和组织培养学相结合的产物。一般的细胞遗传学研究的内容是染色体在减数分裂过程中的行为及其遗传后果。体细胞遗传学主要研究离体培养的体细胞在有丝分裂过程中的遗传规律。

2 体细胞遗传学分类

2.1 种间体细胞遗传学研究不同物种体细胞融合后异核体的遗传行为，对人工合成体细胞杂种有重要的指导意义。

2.2 种内体细胞遗传学对来自同一物种的体细胞进行研究，通过对细胞进行诱变、选择和互补分析等，不但可以获得新的基因型，而且有助于对某些一般性问题的了解，如基因的结构和功能，基因的表达和调控，细胞分化与发育的机制等。

3 物种分类

3.1 非体细胞多倍体物种(non-polysomatic species)

裸子植物、10%的被子植物、向日葵、胡萝卜、麝香百合等。

3.2 体细胞多倍体物种(polysomatic species)

90%的被子植物、豌豆、烟草、芍药等。

4 离体培养中的遗传与变异

4.1 离体培养中的遗传稳定性

离体培养的细胞学基础是有丝分裂。有丝分裂的DNA半保留复制和染色体均等分裂机制，从理论上可以保证离体培养物在一般情况下的遗传稳定性。在准确选择培养方式的前提下，离体无性繁殖可以具有较高的遗传稳定性（Phillip等，1994）。正是基于这一理论，利用离体培养技术建立了多种植物的无性繁殖体系。

4.2 离体培养条件下遗传变异的特点

4.2.1 普遍性植物种类、培养方式、培养类型.

4.2.2 局限性

从表型上看，在不同植物类型中经常发生的体细胞变异主要是植株形态（株高、叶形、叶色等）、生长势、育性、某些抗性等性状的变异。

从生理生化特性上看，容易出现同功酶谱、次生代谢的消长等变异。

4.2.3 嵌合性

嵌合性是指同一有机体中同时存在有遗传组成不同的细胞，它是组织培养中常见的现象。在自然界中，染色体数的嵌合性是由杂种或新近合成的多倍体的遗传不稳定性造成的。这种混倍体现象的出现表明，再生植株可能是由愈伤组织中一个以上细胞起源的。

5 影响体细胞遗传与变异的因素

5.1 供体植物供体植物倍性水平、植物的基因型、外植体细胞分化程度。

5.2 培养基及培养方式

Torrey(1961)，通过改变培养基成分，可有选择地诱导和保持倍性较高的细胞分裂。

豌豆根段：基本培养基+ 2，4-D 二倍体细胞发生分裂

基本培养基+ 2，4-D+激动素+酵母浸出液有选择地诱导四倍体细胞发生分裂。

5.3 继代培养的次数

一般来讲，继代时间越长，继代次数越多，细胞变异的几率就越高。

6 体细胞变异的细胞遗传学基础

6.1 DNA核内重复复制

DNA在核内重复复制（endoreduplication）但不发生细胞分裂，其结果是染色体组数增加，形成同源多倍体。如果这种DNA重复复制多次发生，细胞内DNA含量就会不断上升。

6.2 染色体断裂与重组

染色体断裂与重组是离体培养中染色体结构变异的主要原因之一，也是体细胞变异中经常发生的现象。

染色体结构变异的细胞学特征是：分裂中期出现断裂的染色体片段以及染色体桥，其结果是在体细胞中出现染色体易位、缺失、倒位等多种类型的结构变异。

6.3 非正常有丝分裂

离体培养中，染色体除了整倍性变异外，还可观察到大量的非整倍性变异，这种愈伤组织往往分化能力低下，再生植株大多生长不正常，有性繁殖的遗传稳定性差。

7 体细胞变异的分子遗传学基础

7.1 碱基突变

碱基突变是指DNA序列中碱基的改变。如果改变碱基的DNA序列处于结构基因的位置或调控序列的位置，就可能导致遗传状态的改变。碱基突变是产生体细胞变异的重要途径之一。对于单基因控制的遗传性状，大多数碱基突变可以稳定遗传，而且符合孟德尔遗传分离规律，这一点已在水稻、烟草和玉米的体细胞变异中得以证实（张春义和杨汉民，1994）。

7.2 DNA序列的选择性扩增与丢失

在许多植物中均观察到，DNA分子中一些重复序列在培养条件下发生了扩增。在许多植物种类中还观察到，在组织培养过程中，以及经组织培养再生的植株，甚至在这些植株的后代中，有时也会发生DNA序列丢失的现象。

7.3 转座子活化

转座子(transposon)：在基因组中可以移动的一段DNA序列。转座子首先是由McClintock在玉米中发现的，现已证实它是引起许多遗传不稳定现象的重要原因。

7.4 DNA甲基化

DNA甲基化（methylation）在基因表达调控中具有重要作用。离体培养再生植株的甲基化变化首先在玉米体细胞无性系再生植株中发现。胡萝卜、番茄、马铃薯等多种植物的培养细胞或再生植株中，均报道发现了因DNA甲基化改变而产生的体细胞变异（刁现民和孙敬三，1994）。

8 体细胞无性系变异的诱导与选择

8.1 体细胞变异诱导材料的选择

8.1.1 目标性状的可行性

体细胞突变的频率虽然较高，但对于某一个体来讲，变异的性状是个别的，因此选择

综合性状良好的植物品种材料，通过诱变改变个别不良性状，是体细胞突变系选择的目的。

8.1.2 试验材料的细胞培养技术

必需充分考虑试验植物的细胞培养技术水平，只有对起始材料有良好的培养技术，才有可能制定完满的诱变及选择方案。如果起始细胞的培养技术不成熟，不能再生整株，则不能进行后续的各项操作。

8.1.3 合适的细胞类型适当的细胞类型亦是提高体细胞突变系筛选效率的重要条件。8.2 培养细胞的诱变

8.2.1 物理诱变物理诱变主要是通过射线、磁场以及温度等对培养物进行一定处理，然后对处理后的培养物进行培养筛选。常用的射线处理包括X射线、γ射线、快中子、紫外线等。

8.2．2 化学诱变

常用的化学诱变剂主要有：烷化剂（硫酸二乙酯 DES，乙基磺酸乙酯 EES，甲基黄酸乙酯 EMS，环氧乙烷EO，乙烯亚胺 EI等），此类诱变剂有一个或多个活化烷基，可与DNA 分子中的碱基或磷酸基结合，改变DNA的结构而引起突变。

8.2.3 复合因子诱变

诱变处理可以是单因子处理，亦可以是复合因子诱变。一般来说，复合诱变的效果比单因子诱变好。

8.2.4 转座子插入诱变

可以独立插入通过其转座功能诱导变异。利用这一途径已在苜蓿、马铃薯、番茄、甘蓝等多种植物上获得可利用的体细胞变异植株。

9 体细胞突变体的筛选

9.1 直接筛选法

直接筛选法是在设计的选择条件下，能使培养细胞或再生个体获得直接感官上的差异，因此能将突变个体和非突变个体分离。

最直接的做法是用一种含有特定物质的选择培养基，在此培养基上只有突变细胞能够生长，而非突变细胞不能生长，从而直接筛选出突变体。如抗除草剂、抗盐碱突变体的筛选，均可直接在培养基中加入一定浓度的除草剂或增加渗透压的物质。

9.2 间接筛选法

间接选择法是一种借助于与突变表现型有关的性状作为选择指标的筛选方法。当缺乏直接选择表型指标或直接选择条件对细胞生长不利时，可考虑采用间接筛选法。