琥珀酰辅酶A转移酶的表达纯化及抗体制备

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[ Abstr act] Objective: SCOT( succinyl CoA: 3- oxoacid CoA transferase 1) which mediates the rate- determining step of ke- tolysis in extrahepatic tissues is a key enzyme for ketone body catabolism. Hereditary SCOT deficiency in humans causes episodes of severe ketoacidosis. To further study the function of SCOT gene, the polyantibody against SCOT were prepared. Methods: The antigenic of SCOT was analyzed and the half length of SCOT gene was cloned to the pET- 28b plasmid. Then the recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli BL21(DE3) and the expressed recombinant protein was purified by His.BindTM column. The purified recombinant protein was injected to generate the polyantibody. Then the anti- body was analyzed by Western blot. Results: Based on the experiments, the polyantibody was obtained. The Western blot results showed that the antibody could recognize SCOT from chicken, mouse and human tissues specifically. Conclusion: The polyantibody against SCOT were prepared successful, which supplied a good tool for further studying on SCOT. [ Key wor ds] succinyl CoA: 3- oxoacid CoA transferase 1(SCOT)V protein expressionV antibody preparationV Western blot
琥珀酰辅酶 A 转移酶( succinyl CoA: 3- oxoacid CoA trans- ferase 1, SCOT) 是 酮 体 代 谢 过 程 中 的 关 键 限 速 酶[1], 此 酶 基 因 缺 陷 的 患 者 可 患 有 轻 至 重 度 酮 症 酸 中 毒[2, 3], 临 床 上 命 名 为 遗 传 性 SCOT 缺乏, 表现为持续性酮症和间歇性酮症酸中毒。SCOT 是最 先被发现的在酮体利用中起作用的酶, 其酶活性广泛存在于非 肝脏组织中, 其中以心脏组织中的酶活性最高, 在骨骼肌中也有 较高活性, 在肝脏中无活性[4]。
根 据 NCBI 提 供 的 序 列 , 选 定 需 要 克 隆 表 达 的 区 域 , 设 计 引 物如下, 上下游引物分别引入 EcoRⅠ、XhoⅠ酶 切 位 点 和 保 护 碱 基。引物合成及序列测定由上海生工生物技术有限公司完成。 上游引物: 5' - CCGGGAATTCGATGGCGGCGTACAAATTCCTGCTG- 3' ; 下游引物: 5' - CCGCTCGAGGTGACGACCATCAAACTCTCGAACC- 3' 。
[ 摘要] 目的: 琥珀酰辅酶 A 转移酶( SCOT) 是酮体代谢过程中的关键限速酶, 此酶缺陷多 由 SCOT 基 因酸中毒表现。为了进一步研究 SCOT 的功能, 采用原核表达系统表达并纯化重组 SCOT, 制备 SCOT 多克隆抗体。方
法: 选择蛋鸡、肉鸡模式生物为研究对象, 通过生物信息学对其抗原性和属间同源性进行分析, 通过 RT- PCR 从鸡的骨骼肌
将 引 物 PCR 扩 增 产 物 用 EcoRⅠ /XhoⅠ 双 酶 切 后 连 接 到 pET28b 原核表达载体, 经酶切和 PCR 鉴定后对所获得的阳性克 隆进一步测序验证。测序结果表明, 重组质粒 pET- 28b- SCOT 读 码框正确, 无碱基突变, 可用于融合蛋白的表达。 1.3 重组 SCOT 的诱导表达
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文章编号:1009- 0002(2007)03- 0426- 04
生物技术通讯 LETTERS IN BIOTECHNOLOGY Vol.18 No.3 May, 2007
研究报告
琥珀酰辅酶 A 转移酶的表达纯化及抗体制备
张勤, 朱大海 中国医学科学院基础医学研究所 /中国协和医科大学基础医学院 生化与分子生物学系医学分子生物学国家重点实验室, 北京 100005
以 50 mg 重组 SCOT 免疫雄性 5~6 周的 BALB /c 小鼠, 免疫 周期为 0、15、31 d。第 1 次免疫用弗氏完全佐剂, 其余 2 次用弗 氏 不 完 全 佐 剂 。 第 3 次 免 疫 1 周 后 摘 眼 球 取 血 , 4℃过 夜 , 5 000 rpm /min 离心 10 min 分离血清。 1.6 SCOT 抗体的特异性鉴定
分别从鸡、小鼠和人的心脏、骨骼肌和肝脏中提取总蛋白 ( 参 照 《分 子 克 隆 实 验 指 南 》中 的 蛋 白 提 取 方 法 操 作 ) , 电 泳 进 行 Western 印 迹 检 测 , 抗 体 稀 释 率 为 1∶1 000, 并 用 ECL( 化 学 发 光 法 ) 检 测 , 根 据 条 带 的 位 置 是 否 符 合 预 期 SCOT 的 大 小 及 在 各 种 组织中的表达情况, 判断抗体的特异性。
ZHANG Qin, ZHU Da- hai
National Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sci- ences and Peking Union Medical College, Beijing 100005, China
将诱导后的菌液以 5 000 rpm /min 离心 10 min, 收集菌体, 用 PBS ( 16 mmol /L Na2HPO4, 4 mmol /L NaH2P04, 150 mmol /L NaC1, pH7.4) 洗 2 次 , 用 8 mol /L 尿 素 重 悬 菌 体 沉 淀 , 冰 浴 中 超 声 破 碎 菌 体 。 超 声 后 的 产 物 以 12 000 rpm /min 于 4℃离 心 30 min, 收集沉淀并用镍离子金属螯合柱( Ni- NTA) 纯化重组 SCOT, 收集洗脱液, 待 SDS- PAGE 分析后, 合并纯度较高的洗脱蛋白质 的组分。 1.5 SCOT 抗体的制备
[ 文献标识码] A
Expr ession, Pur ification of Recombinant Succinyl CoA: 3- Oxoacid CoA Tr ansfer ase 1(SCOT) and Pr epar ation of the Specific Antibody Against SCOT
cDNA 中扩增了 SCOT 基因 N 端半长片段, 克隆到表达载体 pET28b 中, 在大肠杆菌 BL21( DE3) 中诱导表达, 并用镍离子螯
合柱( Ni- NTA) 纯化重组 SCOT; 用纯化的重组 SCOT 免疫小鼠后得到多克隆抗体。结果: Western 印迹表明, 制备的 SCOT 抗
蛋鸡、肉鸡经过长期的遗传选育, 在 生 长 发 育 上 有 着 根 本 的 差异, 尤其是在骨骼肌的生长发育方面, 肉鸡的生长速度远远高 于 蛋 鸡 。本 实 验 室 利 用 蛋 鸡 、肉 鸡 作 为 研 究 骨 骼 肌 生 长 发 育 的 动 物模型, 探讨肌肉发生的分子机制。肌肉的生长离不开能量的供 应 , 机体产能依靠三大代谢, 即糖、蛋白质和脂 肪 的 代 谢 , 而 酮 体 产能是脂肪代谢的一部分, SCOT 又是非肝外组织 利 用 酮 体 的 关 键 酶 , 所 以 蛋 鸡 、肉 鸡 骨 骼 肌 的 差 异 可 能 与 SCOT 基 因 有 一 定 关
张勤等: 琥珀酰辅酶 A 转移酶的表达纯化及抗体制备
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1 材料和方法
1.1 材料 大 肠 杆 菌 DH5α和 BL21( DE3) 株 由 本 实 验 室 保 存 ; 原 核 表
达 载 体 pET28b 购 自 Novagen 公 司 ; 雄 性 BALB /c 小 鼠 购 自 北 京 维通利华实验动物中心。高保 真 DNA 聚 合 酶 、 限 制 性 内 切 酶 、 T4 DNA 连接酶、DNA Marker 等购自 NEB 和上海生工生物工程 公 司 ; DNA 回 收 试 剂 盒 购 自 上 海 华 舜 生 物 工 程 公 司 ; HRP 标 记 的 山 羊 抗 兔 IgG 购 自 中 杉 生 物 技 术 有 限 责 任 公 司 ; ECL 试 剂 盒 购自 Amersham 公司; 尿素等其他试剂购自北京化学试剂公司。 1.2 原核融合表达载体的构建
将 pET- 28b- SCOT 重组质粒转化大肠杆菌 BL21( DE3) 感受 态 细 胞 , 挑 取 单 菌 落 接 种 到 5 mL LB 培 养 液 中 于 37℃培 养 过 夜, 次日以 2%的接种量转 至 10 mL LB 培 养 液 中 , 在 D595nm 值 达 到 0.6 后 , 加 入 IPTG 至 终 浓 度 为 1 mmol /L, 诱 导 4 h 后 取 出 1 mL 菌液, 离心收集菌体 细 胞 并 超 声 破 碎 , 用 12% SDS- PAGE 检 测重组 SCOT 的表达量, 并分析蛋白的可溶性。 1.4 重组 SCOT 的纯化
联。为研究 SCOT 在蛋鸡、肉鸡骨骼肌生长发育差异中的功能, 在 生 物 信 息 学 预 测 SCOT 抗 原 性 , 以 及 SCOT 在 鸡 、小 鼠 和 人 中 的 同源性的基础上, 选取预测抗原性较高 、与 已 知 其 他 蛋 白 同 源 性 低, 并且在种属间同源性较高的片段, 采用原核表达的方法表达 相应蛋白, 免疫小鼠, 制备出 SCOT 多克隆抗体。Western 印迹检 测鸡、人和鼠中相应组织总蛋白, 结果 获 得 的 多 抗 不 仅 可 以 识 别 鸡的 SCOT, 还能识别人和鼠的相应的 SCOT。SCOT 多克隆抗体 的 制 备 为 进 一 步 研 究 SCOT 在 肌 肉 发 生 与 能 量 代 谢 中 的 功 能 奠 定了基础。
体具有较高的特异性, 可特异性识别鸡的 SCOT 蛋白, 同时可特异性识别小鼠和人的相应 SCOT 蛋白。结论: SCOT 多克隆抗
体的制备为后续在鸡、鼠和人中研究 SCOT 基因提供基础。
[ 关键词] 琥珀酰辅酶 A 转移酶; 原核表达; 抗体制备; Western 印迹
[ 中图分类号] Q78V R392
[ 收稿日期] 2007- 01- 08 [ 基金项目] 国家自然科学基金重点项目( 30330430) ;
港澳青年学者合作研究基金项目( 30429002) [ 作者简介] 张勤( 1975- ) , 女, 研究实习员, 硕士研究生 [ 通讯作者] 朱大海, ( E- mail) dhzhu@pumc.edu.cn
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