琥珀酰辅酶A转移酶的表达纯化及抗体制备

［ Ａｂｓｔｒ ａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ： ＳＣＯＴ（ ｓｕｃｃｉｎｙｌ ＣｏＡ： ３－ ｏｘｏａｃｉｄ ＣｏＡ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １） ｗｈｉｃｈ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｔｈｅ ｒａｔｅ－ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｓｔｅｐ ｏｆ ｋｅ－ ｔｏｌｙｓｉｓ ｉｎ ｅｘｔｒａｈｅｐａｔｉｃ ｔｉｓｓｕｅｓ ｉｓ ａ ｋｅｙ ｅｎｚｙｍｅ ｆｏｒ ｋｅｔｏｎｅ ｂｏｄｙ ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ． Ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ＳＣＯＴ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ ｃａｕｓｅｓ ｅｐｉｓｏｄｅｓ ｏｆ ｓｅｖｅｒｅ ｋｅｔｏａｃｉｄｏｓｉｓ． Ｔｏ ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ＳＣＯＴ ｇｅｎｅ， ｔｈｅ ｐｏｌｙａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ＳＣＯＴ ｗｅｒｅ ｐｒｅｐａｒｅｄ． Ｍｅｔｈｏｄｓ： Ｔｈｅ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｏｆ ＳＣＯＴ ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｈａｌｆ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ＳＣＯＴ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｐＥＴ－ ２８ｂ ｐｌａｓｍｉｄ． Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３） ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｙ Ｈｉｓ．ＢｉｎｄＴＭ ｃｏｌｕｍｎ． Ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｔｈｅ ｐｏｌｙａｎｔｉｂｏｄｙ． Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ａｎｔｉ－ ｂｏｄｙ ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ． Ｒｅｓｕｌｔｓ： Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ， ｔｈｅ ｐｏｌｙａｎｔｉｂｏｄｙ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ． Ｔｈｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｕｌｄ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ ＳＣＯＴ ｆｒｏｍ ｃｈｉｃｋｅｎ， ｍｏｕｓｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｔｉｓｓｕｅｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ： Ｔｈｅ ｐｏｌｙａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ＳＣＯＴ ｗｅｒｅ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ， ｗｈｉｃｈ ｓｕｐｐｌｉｅｄ ａ ｇｏｏｄ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｏｎ ＳＣＯＴ． ［ Ｋｅｙ ｗｏｒ ｄｓ］ ｓｕｃｃｉｎｙｌ ＣｏＡ： ３－ ｏｘｏａｃｉｄ ＣｏＡ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １（ＳＣＯＴ）V ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎV ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎV Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ
琥珀酰辅酶 Ａ 转移酶（ ｓｕｃｃｉｎｙｌ ＣｏＡ： ３－ ｏｘｏａｃｉｄ ＣｏＡ ｔｒａｎｓ－ ｆｅｒａｓｅ １， ＳＣＯＴ） 是 酮 体 代 谢 过 程 中 的 关 键 限 速 酶［１］， 此 酶 基 因 缺 陷 的 患 者 可 患 有 轻 至 重 度 酮 症 酸 中 毒［２， ３］， 临 床 上 命 名 为 遗 传 性 ＳＣＯＴ 缺乏， 表现为持续性酮症和间歇性酮症酸中毒。ＳＣＯＴ 是最 先被发现的在酮体利用中起作用的酶， 其酶活性广泛存在于非 肝脏组织中， 其中以心脏组织中的酶活性最高， 在骨骼肌中也有 较高活性， 在肝脏中无活性［４］。
根 据 ＮＣＢＩ 提 供 的 序 列 ， 选 定 需 要 克 隆 表 达 的 区 域 ， 设 计 引 物如下， 上下游引物分别引入 ＥｃｏＲⅠ、ＸｈｏⅠ酶 切 位 点 和 保 护 碱 基。引物合成及序列测定由上海生工生物技术有限公司完成。 上游引物： ５＇ － ＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣＧＡＴＧＧＣＧＧＣＧＴＡＣＡＡＡＴＴＣＣＴＧＣＴＧ－ ３＇ ； 下游引物： ５＇ － ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧＴＧＡＣＧＡＣＣＡＴＣＡＡＡＣＴＣＴＣＧＡＡＣＣ－ ３＇ 。
［ 摘要］ 目的： 琥珀酰辅酶 Ａ 转移酶（ ＳＣＯＴ） 是酮体代谢过程中的关键限速酶， 此酶缺陷多 由 ＳＣＯＴ 基 因酸中毒表现。为了进一步研究 ＳＣＯＴ 的功能， 采用原核表达系统表达并纯化重组 ＳＣＯＴ， 制备 ＳＣＯＴ 多克隆抗体。方
法： 选择蛋鸡、肉鸡模式生物为研究对象， 通过生物信息学对其抗原性和属间同源性进行分析， 通过 ＲＴ－ ＰＣＲ 从鸡的骨骼肌
将 引 物 ＰＣＲ 扩 增 产 物 用 ＥｃｏＲⅠ ／ＸｈｏⅠ 双 酶 切 后 连 接 到 ｐＥＴ２８ｂ 原核表达载体， 经酶切和 ＰＣＲ 鉴定后对所获得的阳性克 隆进一步测序验证。测序结果表明， 重组质粒 ｐＥＴ－ ２８ｂ－ ＳＣＯＴ 读 码框正确， 无碱基突变， 可用于融合蛋白的表达。 １．３ 重组 ＳＣＯＴ 的诱导表达
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文章编号：１００９－ ０００２（２００７）０３－ ０４２６－ ０４
生物技术通讯 ＬＥＴＴＥＲＳ ＩＮ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ Ｖｏｌ．１８ Ｎｏ．３ Ｍａｙ， ２００７
研究报告
琥珀酰辅酶 Ａ 转移酶的表达纯化及抗体制备
张勤， 朱大海 中国医学科学院基础医学研究所 ／中国协和医科大学基础医学院 生化与分子生物学系医学分子生物学国家重点实验室， 北京 １００００５
以 ５０ ｍｇ 重组 ＳＣＯＴ 免疫雄性 ５～６ 周的 ＢＡＬＢ ／ｃ 小鼠， 免疫 周期为 ０、１５、３１ ｄ。第 １ 次免疫用弗氏完全佐剂， 其余 ２ 次用弗 氏 不 完 全 佐 剂 。 第 ３ 次 免 疫 １ 周 后 摘 眼 球 取 血 ， ４℃过 夜 ， ５ ０００ ｒｐｍ ／ｍｉｎ 离心 １０ ｍｉｎ 分离血清。 １．６ ＳＣＯＴ 抗体的特异性鉴定
分别从鸡、小鼠和人的心脏、骨骼肌和肝脏中提取总蛋白 （ 参 照 《分 子 克 隆 实 验 指 南 》中 的 蛋 白 提 取 方 法 操 作 ） ， 电 泳 进 行 Ｗｅｓｔｅｒｎ 印 迹 检 测 ， 抗 体 稀 释 率 为 １∶１ ０００， 并 用 ＥＣＬ（ 化 学 发 光 法 ） 检 测 ， 根 据 条 带 的 位 置 是 否 符 合 预 期 ＳＣＯＴ 的 大 小 及 在 各 种 组织中的表达情况， 判断抗体的特异性。
ＺＨＡＮＧ Ｑｉｎ， ＺＨＵ Ｄａ－ ｈａｉ
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉ－ ｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｐｅｋｉｎｇ Ｕｎｉｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １００００５， Ｃｈｉｎａ
将诱导后的菌液以 ５ ０００ ｒｐｍ ／ｍｉｎ 离心 １０ ｍｉｎ， 收集菌体， 用 ＰＢＳ （ １６ ｍｍｏｌ ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４， ４ ｍｍｏｌ ／Ｌ ＮａＨ２Ｐ０４， １５０ ｍｍｏｌ ／Ｌ ＮａＣ１， ｐＨ７．４） 洗 ２ 次 ， 用 ８ ｍｏｌ ／Ｌ 尿 素 重 悬 菌 体 沉 淀 ， 冰 浴 中 超 声 破 碎 菌 体 。 超 声 后 的 产 物 以 １２ ０００ ｒｐｍ ／ｍｉｎ 于 ４℃离 心 ３０ ｍｉｎ， 收集沉淀并用镍离子金属螯合柱（ Ｎｉ－ ＮＴＡ） 纯化重组 ＳＣＯＴ， 收集洗脱液， 待 ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ 分析后， 合并纯度较高的洗脱蛋白质 的组分。 １．５ ＳＣＯＴ 抗体的制备
［ 文献标识码］ Ａ
Ｅｘｐｒ ｅｓｓｉｏｎ， Ｐｕｒ ｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｓｕｃｃｉｎｙｌ ＣｏＡ： ３－ Ｏｘｏａｃｉｄ ＣｏＡ Ｔｒ ａｎｓｆｅｒ ａｓｅ １（ＳＣＯＴ） ａｎｄ Ｐｒ ｅｐａｒ ａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｇａｉｎｓｔ ＳＣＯＴ
ｃＤＮＡ 中扩增了 ＳＣＯＴ 基因 Ｎ 端半长片段， 克隆到表达载体 ｐＥＴ２８ｂ 中， 在大肠杆菌 ＢＬ２１（ ＤＥ３） 中诱导表达， 并用镍离子螯
合柱（ Ｎｉ－ ＮＴＡ） 纯化重组 ＳＣＯＴ； 用纯化的重组 ＳＣＯＴ 免疫小鼠后得到多克隆抗体。结果： Ｗｅｓｔｅｒｎ 印迹表明， 制备的 ＳＣＯＴ 抗
蛋鸡、肉鸡经过长期的遗传选育， 在 生 长 发 育 上 有 着 根 本 的 差异， 尤其是在骨骼肌的生长发育方面， 肉鸡的生长速度远远高 于 蛋 鸡 。本 实 验 室 利 用 蛋 鸡 、肉 鸡 作 为 研 究 骨 骼 肌 生 长 发 育 的 动 物模型， 探讨肌肉发生的分子机制。肌肉的生长离不开能量的供 应 ， 机体产能依靠三大代谢， 即糖、蛋白质和脂 肪 的 代 谢 ， 而 酮 体 产能是脂肪代谢的一部分， ＳＣＯＴ 又是非肝外组织 利 用 酮 体 的 关 键 酶 ， 所 以 蛋 鸡 、肉 鸡 骨 骼 肌 的 差 异 可 能 与 ＳＣＯＴ 基 因 有 一 定 关
张勤等： 琥珀酰辅酶 Ａ 转移酶的表达纯化及抗体制备
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１ 材料和方法
１．１ 材料 大 肠 杆 菌 ＤＨ５α和 ＢＬ２１（ ＤＥ３） 株 由 本 实 验 室 保 存 ； 原 核 表
达 载 体 ｐＥＴ２８ｂ 购 自 Ｎｏｖａｇｅｎ 公 司 ； 雄 性 ＢＡＬＢ ／ｃ 小 鼠 购 自 北 京 维通利华实验动物中心。高保 真 ＤＮＡ 聚 合 酶 、 限 制 性 内 切 酶 、 Ｔ４ ＤＮＡ 连接酶、ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ 等购自 ＮＥＢ 和上海生工生物工程 公 司 ； ＤＮＡ 回 收 试 剂 盒 购 自 上 海 华 舜 生 物 工 程 公 司 ； ＨＲＰ 标 记 的 山 羊 抗 兔 ＩｇＧ 购 自 中 杉 生 物 技 术 有 限 责 任 公 司 ； ＥＣＬ 试 剂 盒 购自 Ａｍｅｒｓｈａｍ 公司； 尿素等其他试剂购自北京化学试剂公司。 １．２ 原核融合表达载体的构建
将 ｐＥＴ－ ２８ｂ－ ＳＣＯＴ 重组质粒转化大肠杆菌 ＢＬ２１（ ＤＥ３） 感受 态 细 胞 ， 挑 取 单 菌 落 接 种 到 ５ ｍＬ ＬＢ 培 养 液 中 于 ３７℃培 养 过 夜， 次日以 ２％的接种量转 至 １０ ｍＬ ＬＢ 培 养 液 中 ， 在 Ｄ５９５ｎｍ 值 达 到 ０．６ 后 ， 加 入 ＩＰＴＧ 至 终 浓 度 为 １ ｍｍｏｌ ／Ｌ， 诱 导 ４ ｈ 后 取 出 １ ｍＬ 菌液， 离心收集菌体 细 胞 并 超 声 破 碎 ， 用 １２％ ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ 检 测重组 ＳＣＯＴ 的表达量， 并分析蛋白的可溶性。 １．４ 重组 ＳＣＯＴ 的纯化
联。为研究 ＳＣＯＴ 在蛋鸡、肉鸡骨骼肌生长发育差异中的功能， 在 生 物 信 息 学 预 测 ＳＣＯＴ 抗 原 性 ， 以 及 ＳＣＯＴ 在 鸡 、小 鼠 和 人 中 的 同源性的基础上， 选取预测抗原性较高 、与 已 知 其 他 蛋 白 同 源 性 低， 并且在种属间同源性较高的片段， 采用原核表达的方法表达 相应蛋白， 免疫小鼠， 制备出 ＳＣＯＴ 多克隆抗体。Ｗｅｓｔｅｒｎ 印迹检 测鸡、人和鼠中相应组织总蛋白， 结果 获 得 的 多 抗 不 仅 可 以 识 别 鸡的 ＳＣＯＴ， 还能识别人和鼠的相应的 ＳＣＯＴ。ＳＣＯＴ 多克隆抗体 的 制 备 为 进 一 步 研 究 ＳＣＯＴ 在 肌 肉 发 生 与 能 量 代 谢 中 的 功 能 奠 定了基础。
体具有较高的特异性， 可特异性识别鸡的 ＳＣＯＴ 蛋白， 同时可特异性识别小鼠和人的相应 ＳＣＯＴ 蛋白。结论： ＳＣＯＴ 多克隆抗
体的制备为后续在鸡、鼠和人中研究 ＳＣＯＴ 基因提供基础。
［ 关键词］ 琥珀酰辅酶 Ａ 转移酶； 原核表达； 抗体制备； Ｗｅｓｔｅｒｎ 印迹
［ 中图分类号］ Ｑ７８V Ｒ３９２
［ 收稿日期］ ２００７－ ０１－ ０８ ［ 基金项目］ 国家自然科学基金重点项目（ ３０３３０４３０） ；
港澳青年学者合作研究基金项目（ ３０４２９００２） ［ 作者简介］ 张勤（ １９７５－ ） ， 女， 研究实习员， 硕士研究生 ［ 通讯作者］ 朱大海， （ Ｅ－ ｍａｉｌ） ｄｈｚｈｕ＠ｐｕｍｃ．ｅｄｕ．ｃｎ