《动物病毒学》课件：第八章 病毒病的实验室诊断
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“两对半”检查结果的临床意义
Hepatitis B Virus
➢促凝血和抗凝血用途有何不同？ 采集有何不同？
病毒感染的临床过程与诊断
细胞免疫
临 床 表 现
康复或 死亡
体液免疫
核酸检测/病毒分离 抗原检测
潜伏期
抗体检测
症状期
恢复期
不同的实验室诊断方法各具优点，针对 不同的感染时相和临床标本
8.1 常规实验诊断
8.1.1、病原学诊断（etiology diagnostics）
病毒分离 病毒在细胞培养中增殖的判定 病毒理化特性的测定 病毒感染力/毒力的测定
病毒分离
➢动物接种
—实验动物:小鼠、兔、豚鼠 —本体动物:自然宿主（PRRSV等）
➢鸡胚培养
―正粘/副粘病毒，痘病毒，脑炎病毒 等
病毒理化特性测定的判断标准
➢以试验组的TCID50 （或PFU），比对照组低2个 对数以上判为阳性，1-2个对数之间判为可疑，1
个对数以上判为阴性。
试验组 对照组 结果判定
TCID50/0.1mL 10-2
10-5
10-3.5 10-5
阳性ห้องสมุดไป่ตู้可疑
10-4.1
10-5
阴性
病毒的数量与感染性的测定
➢ 半数组织培养感染剂量 (50% tissue culture infectious dose ，TCID50 ) 测定病毒能使50%的组织培养细胞发生感染的 最小量
➢组织培养细胞：病毒分离鉴定中的最常用
的方法（一般需要盲传3代以上）
病毒在细胞培养中增殖的判定
➢细胞病变( Cytopathic effect , CPE) ➢病毒抗原/蛋白的测定 ➢电子显微镜---形态学观察
➢细胞病变
(Virus-mediated cytopathic effect , CPE）
➢半数鸡胚致死量ELD50
(egg 50% lethal dose) ➢半数鸡胚感染量EID50
(egg 50% infective dose)
(一)蚀斑(PFU)测定
➢是一种检查和准确滴定病毒感染性的方法。 ➢将稀释的病毒悬液加入单层细胞培养瓶中。病毒吸附后，再
覆盖一层融化的半固体营养琼脂，使病毒在单层细胞培养中 有限扩散。结果是每一个有感染性的病毒在单层细胞中可产 生一个局限性的感染灶。用活性染料 (如中性红，结晶紫) 染色，则活细胞着色，受病毒感染而破坏的细胞不着色，形 成肉眼可见的蚀斑(plaque)。
一些标本（样品）材料中相应病毒比较 少时显得更为重要 ➢准确 准确是诊断的关键 ➢快速、敏感、准确于一体，是诊断的基 本原则
实验室检测标本的采集与送检---―临床疑似病例样本 ―样品采集、保存、处理
采集样品尽量无菌、新鲜、病毒 含量多的组织、器官；
因病毒在高温中易失活，样品应低温保 存并尽快送检。
不同病毒感染细胞产生的细胞病变不同
―口蹄疫病毒(BHK-21)：细胞肿大变圆； ―麻疹病毒、RSV：形成典型合胞体； ―有些病毒感染细胞形成特征性包涵体。
重组杆状病毒接种Sf9细胞
PRV感染的PK15 细胞
➢病毒抗原/蛋白的测定
― (间接)免疫荧光(indirect/immunofluorescence)
➢药物抑制试验(病毒核酸类型鉴定)
原理：5-氟/碘/溴脱氧尿苷(F/I/Br UDR)是嘧啶的 卤化物，进入细胞后发生磷酸化，掺入 新合成的DNA以代替胸腺嘧啶，产生无 功能分子，从而抑制DNA的合成。
常用浓度: 50ug/ml F/I/Br UDR
通过药物处理前后病毒感染细胞情况比较：如果病 毒复制受到影响，说明该病毒的核酸类型为DNA
― SDS-PAGE & western blot
针对病毒的 不同编码蛋 白进行检测
―Western-Blotting分子杂交
➢电子显微镜----形态学观察
猪流行性腹泻病毒
Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV)
病毒理化特性的测定
➢病毒核酸类型鉴定(药物抑制试验) ➢病毒囊膜的确定(脂溶剂敏感性试验) ➢胰蛋白酶敏感试验 ➢耐酸性试验 ➢耐热性试验 ➢病毒粒子大小测定
➢脂溶剂敏感性试验（病毒囊膜的确定）
―乙醚敏感试验
用终浓度20%乙醚处理病毒(4℃内作用24h),离心 取病毒液;同时设对照。测定两组病毒的感染力.
―氯仿敏感性试验
用 终 浓 度 4.8% 的 氯 仿 处 理 病 毒 (4℃ 振 荡 混 合 10min),离心取病毒液;同时设对照。测定两组病毒 的感染力. 通过处理前后病毒感染力的差别显示病毒对脂溶剂 是否敏感性，若敏感表明病毒粒子为有囊膜的病毒
―核酸检测（Direction detection of nucleic acids） ―核酸杂交（ Nucleic acid Hybridization） ―核酸扩增（Nucleic acid amplication）
诊断的基本原则
➢快速 尤其对一些急性、烈性传染病 ➢敏感 所使用的方法要保证敏感，尤其对
病毒材料的处理
对本身带有杂菌 (如咽拭子、粪便) 或易受污染的 样品，进行病毒分离培养时，应使用抗生素
免疫学诊断标本的采取应在发病初期和 病后2～3w内各取1份血清，以便对比双 份血清抗体效价的动态变化
避免杂菌污染
病毒学诊断
采集病变明显部位
标本的采集和送检六原则 标本必须新鲜
分离病毒前抗生素处理
采集不同期不同标本 运送时注意低温保存
➢ 蚀斑形成单位(plaque forming unit, PFU) A virus particle able to initiate a productive infection is termed a plaque forming unit, PFU
➢半数感染量(50% infectious dose, ID50) ➢半数致死量(50% lethal dose, LD50)
➢每个蚀斑是由一个感染性病毒颗粒形成的，称作蚀斑形成单 位 (plaque forming unit,PFU)。病毒悬液中的感染性病 毒量的滴度可用PFU／ml表示。
检测结果必须结合临床症状体征、病程 和标本来源综合分析
第八章 病毒病的实验室诊断
本章内容
8.1.常规实验诊断
―病原学诊断（etiology diagnostics） ―免疫学诊断（immunology diagnostics ）
8.2.分子病毒学诊断(molecular diagnostics)
Hepatitis B Virus
➢促凝血和抗凝血用途有何不同？ 采集有何不同？
病毒感染的临床过程与诊断
细胞免疫
临 床 表 现
康复或 死亡
体液免疫
核酸检测/病毒分离 抗原检测
潜伏期
抗体检测
症状期
恢复期
不同的实验室诊断方法各具优点，针对 不同的感染时相和临床标本
8.1 常规实验诊断
8.1.1、病原学诊断（etiology diagnostics）
病毒分离 病毒在细胞培养中增殖的判定 病毒理化特性的测定 病毒感染力/毒力的测定
病毒分离
➢动物接种
—实验动物:小鼠、兔、豚鼠 —本体动物:自然宿主（PRRSV等）
➢鸡胚培养
―正粘/副粘病毒，痘病毒，脑炎病毒 等
病毒理化特性测定的判断标准
➢以试验组的TCID50 （或PFU），比对照组低2个 对数以上判为阳性，1-2个对数之间判为可疑，1
个对数以上判为阴性。
试验组 对照组 结果判定
TCID50/0.1mL 10-2
10-5
10-3.5 10-5
阳性ห้องสมุดไป่ตู้可疑
10-4.1
10-5
阴性
病毒的数量与感染性的测定
➢ 半数组织培养感染剂量 (50% tissue culture infectious dose ，TCID50 ) 测定病毒能使50%的组织培养细胞发生感染的 最小量
➢组织培养细胞：病毒分离鉴定中的最常用
的方法（一般需要盲传3代以上）
病毒在细胞培养中增殖的判定
➢细胞病变( Cytopathic effect , CPE) ➢病毒抗原/蛋白的测定 ➢电子显微镜---形态学观察
➢细胞病变
(Virus-mediated cytopathic effect , CPE）
➢半数鸡胚致死量ELD50
(egg 50% lethal dose) ➢半数鸡胚感染量EID50
(egg 50% infective dose)
(一)蚀斑(PFU)测定
➢是一种检查和准确滴定病毒感染性的方法。 ➢将稀释的病毒悬液加入单层细胞培养瓶中。病毒吸附后，再
覆盖一层融化的半固体营养琼脂，使病毒在单层细胞培养中 有限扩散。结果是每一个有感染性的病毒在单层细胞中可产 生一个局限性的感染灶。用活性染料 (如中性红，结晶紫) 染色，则活细胞着色，受病毒感染而破坏的细胞不着色，形 成肉眼可见的蚀斑(plaque)。
一些标本（样品）材料中相应病毒比较 少时显得更为重要 ➢准确 准确是诊断的关键 ➢快速、敏感、准确于一体，是诊断的基 本原则
实验室检测标本的采集与送检---―临床疑似病例样本 ―样品采集、保存、处理
采集样品尽量无菌、新鲜、病毒 含量多的组织、器官；
因病毒在高温中易失活，样品应低温保 存并尽快送检。
不同病毒感染细胞产生的细胞病变不同
―口蹄疫病毒(BHK-21)：细胞肿大变圆； ―麻疹病毒、RSV：形成典型合胞体； ―有些病毒感染细胞形成特征性包涵体。
重组杆状病毒接种Sf9细胞
PRV感染的PK15 细胞
➢病毒抗原/蛋白的测定
― (间接)免疫荧光(indirect/immunofluorescence)
➢药物抑制试验(病毒核酸类型鉴定)
原理：5-氟/碘/溴脱氧尿苷(F/I/Br UDR)是嘧啶的 卤化物，进入细胞后发生磷酸化，掺入 新合成的DNA以代替胸腺嘧啶，产生无 功能分子，从而抑制DNA的合成。
常用浓度: 50ug/ml F/I/Br UDR
通过药物处理前后病毒感染细胞情况比较：如果病 毒复制受到影响，说明该病毒的核酸类型为DNA
― SDS-PAGE & western blot
针对病毒的 不同编码蛋 白进行检测
―Western-Blotting分子杂交
➢电子显微镜----形态学观察
猪流行性腹泻病毒
Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV)
病毒理化特性的测定
➢病毒核酸类型鉴定(药物抑制试验) ➢病毒囊膜的确定(脂溶剂敏感性试验) ➢胰蛋白酶敏感试验 ➢耐酸性试验 ➢耐热性试验 ➢病毒粒子大小测定
➢脂溶剂敏感性试验（病毒囊膜的确定）
―乙醚敏感试验
用终浓度20%乙醚处理病毒(4℃内作用24h),离心 取病毒液;同时设对照。测定两组病毒的感染力.
―氯仿敏感性试验
用 终 浓 度 4.8% 的 氯 仿 处 理 病 毒 (4℃ 振 荡 混 合 10min),离心取病毒液;同时设对照。测定两组病毒 的感染力. 通过处理前后病毒感染力的差别显示病毒对脂溶剂 是否敏感性，若敏感表明病毒粒子为有囊膜的病毒
―核酸检测（Direction detection of nucleic acids） ―核酸杂交（ Nucleic acid Hybridization） ―核酸扩增（Nucleic acid amplication）
诊断的基本原则
➢快速 尤其对一些急性、烈性传染病 ➢敏感 所使用的方法要保证敏感，尤其对
病毒材料的处理
对本身带有杂菌 (如咽拭子、粪便) 或易受污染的 样品，进行病毒分离培养时，应使用抗生素
免疫学诊断标本的采取应在发病初期和 病后2～3w内各取1份血清，以便对比双 份血清抗体效价的动态变化
避免杂菌污染
病毒学诊断
采集病变明显部位
标本的采集和送检六原则 标本必须新鲜
分离病毒前抗生素处理
采集不同期不同标本 运送时注意低温保存
➢ 蚀斑形成单位(plaque forming unit, PFU) A virus particle able to initiate a productive infection is termed a plaque forming unit, PFU
➢半数感染量(50% infectious dose, ID50) ➢半数致死量(50% lethal dose, LD50)
➢每个蚀斑是由一个感染性病毒颗粒形成的，称作蚀斑形成单 位 (plaque forming unit,PFU)。病毒悬液中的感染性病 毒量的滴度可用PFU／ml表示。
检测结果必须结合临床症状体征、病程 和标本来源综合分析
第八章 病毒病的实验室诊断
本章内容
8.1.常规实验诊断
―病原学诊断（etiology diagnostics） ―免疫学诊断（immunology diagnostics ）
8.2.分子病毒学诊断(molecular diagnostics)