那他霉素发酵工艺的研究(本科毕业)

那他霉素发酵工艺的研究

摘要：该实验以钠他霉素为菌种进行一系列的发酵，通过其单因素实验和正交实验，来确定了其最佳的培养基配方及发酵条件:葡萄糖 3.5%，大豆蛋白胨1.85%，酵母粉0.40%，初始pH值7.0，接种3%，50mL放入的250mL的三角瓶中，25℃，转速300r/min，发酵120h。最终在此配方和发酵条件下，纳他霉素产量可达到1.2g/L。

关键字：纳他霉素培养基发酵优化

前言

纳他霉素（Natamycin），也称游链霉素，是一种天然的多烯大环内酯类抗生素[1]。它是由纳塔尔链霉菌（Streptomyces Natalensis）经过发酵得到的一种次级代谢产物，能够有效抑制酵母菌和丝状真菌的生长及真菌毒素的产生，作为一种无毒害、低剂量的生物防腐剂，已被广泛应用于食品防腐和真菌引起的疾病的治疗[2]。目前，国际上已许可使用的生物防腐剂仅为乳酸链球菌素（Nisin）、纳他霉素（Natamycin）及聚赖氨酸（ε-poly-lysine）三种[3]。我国目前允许使用的仅为乳酸链球菌素和纳他霉素。钠他霉素作为一种新型的防腐剂，因为有其高效的杀菌效果以及无毒无害的安全保证，因此被各个行业所亲睐[4]。近几年在全球经济的发展迅速，人们的生活水平普遍提高了，因此对那些无毒无害的食品越来越亲睐，从而促进了各个行业开始寻找这种防腐剂。又因为钠他霉素高效的杀菌效果以及无毒无害的安全，所以钠他霉素就孕育而生。目前有30 多个国家已经将钠他霉素作为天然食品添加剂和防腐剂使用。

1 材料与方法

1．1材料

1.1．1菌种

生产菌株:褐黄抱链霉菌S.giLvosPoreus，ATCC13326。

1.1.2主要药品

无水葡萄糖分析纯上海生工生物工程有限公司

麦芽浸粉 RT 天津市化学试剂一厂

琼脂粉生化试剂大五化学株式公社

牛肉蛋白胨微生物培养基用北京化学试剂公司

大豆蛋白胨生化试剂北京市海淀区微生物培养基制品厂

酵母浸粉生化试剂成都市彭县丽春化学厂

糊精分析纯北京市海淀区微生物培养基制品厂

可溶性淀粉分析纯天津市化学试剂批发部经销

麦芽糖生化试剂天津市化学试剂一厂

蔗糖分析纯天津化学试剂批发部监制

氯化钠分析纯天津市化学试剂一厂

分析纯天津市塘沽化学试剂厂

MgSO

4

HCl 分析纯天津化学试剂部监制

磷酸分析纯天津化学试剂三厂

1.1.3主要仪器

LDS一10型离心机上海安亭科学仪器厂

TGL一16B高速台式离心机北京医用离心机厂

电热恒温培养箱湖北省黄石市医疗器械厂

DFG801型电热鼓风机天津式实验仪器厂

HKCB一3型恒控磁力搅拌器格兰仕

电子分析天平瑞士

超纯水器北京普析通用仪器有限责任公司

微波炉温州市医疗电器厂

超净工作台苏州净化设备厂

1.1.4培养基

活化液体培养基(g/L):葡萄糖15克蛋白胨5克麦芽浸粉8克酵母粉7克PH7.0

斜面保存培养基(g/L):葡萄糖15克酵母粉4克蛋白胨5克琼脂

粉10克麦芽浸粉2克 PH7.O

分离培养基(g/L) :葡萄糖20克蛋白胨5克酵母粉3克麦芽浸粉2克

琼脂粉10克 PH7.0

种子培养基(g/L):葡萄糖20克蛋白胨6克酵母粉4克 NaCl8克 PH 7.0

发酵培养基(g几):大豆蛋白分离物20克酵母粉3克 PH 7.0

葡萄糖(50%葡萄糖单独灭菌)7克

以上培养基灭菌条件:115℃，灭菌30min

1.2 试验方法

1.2.1 菌种的活化

从锥形瓶中接种一环装有10mL液体的活化培养基接种于25OmL的三角瓶中，于25℃，300r/min振荡培养48h，转接于保藏斜面，25℃恒温培养120h，当斜面几乎完全被孢子覆盖，这事放入冰箱(4℃)中保存以备用。

1.2.2 菌种的分离

取0.3ml孢子悬浮液接种于装有20ml培养基的平板上，连涂5块平板，25℃恒温培养120h。然后根据菌落的形态，大小等因素来挑选不同典型形态的单菌落，用D=10mm的打孔器打10个孔，将单菌落琼脂块放入D=100mm的培养皿中，并将平板于25℃恒温培养24h，当发现边缘出现清晰的抑菌圈时，这时就用抗生素效价仪测定抑菌圈得大小[5]。挑选抑菌圈较大的菌落并转接于保藏斜面，25℃恒温培养120h。

1.2.3种子培养

吸取5ml孢子悬浮液接种于装有50ml的种子培养基的250mL三角瓶中，25℃，300r/min振荡培养48h，使菌体能迅速到达生长期。

1.2.4摇瓶发酵培养

以3%的接种量接种种子液到装有50ml的液量的250ml三角瓶中，25℃、

300r/min回转式摇床发酵120h。

1.2.5 生产菌的测定-干重法[6]

首先先将滤纸放于100℃的烘箱下烘至恒重，称重后并记下数据然后在放入布氏漏斗。取10ml的发酵液，3000r/min离心30min，把上面的清液倒掉收集其沉淀，用无菌水洗涤两次，将洗涤后的沉淀洗入布氏漏斗中抽滤，将滤纸和菌体在

50℃的烘箱中干燥至恒重，称量并计算菌体的干重。

2结果与讨论

2．1培养基的优化

2.1.1种子培养基的优化

表1 种子培养基（g/100ml）

种子培养基1# 2# 3#

生长状况比较差一般最好

由上表可以看出#3种子培养基配方能使种子液的菌丝浓度更高，生长状态更好。因此将种子培养基确定为:淀粉1.0%，酪蛋白陈0.6%，玉米浆0.6%，葡萄糖1.0%，黄豆饼粉1.0%，七水硫酸镁0.1%，磷酸二氢钾0.05%，碳酸钙0.5%,氯化钠0.2%，pH7.0。

2.1.2斜面培养基的优化

斜面培养基的优化，主要是考察了碳源、氮源等因素对纳他霉素生产菌抱子生长的影响。初始斜面培养基配方为:葡萄糖1.0%，酵母抽提物0.3%，麦芽抽提物1.0%，琼脂0.5%，pH7.0。在该培养基上培养时发现菌落长得不够厚密，而且孢子的量也比较少，为了得到更多的孢子因而设计了以下六种斜面培养基进行试