两性霉素B缓释微球的制备及缓释性能研究

26卷3期2007年6月
中　国　生　物　医　学　工　程　学　报
Chinese Journal o f Biomedical Engineering V ol.26　N o.3
June 2007
收稿日期:2005207211,修回日期:2007201210。

基金项目:上海市科委纳米专项基金(0452nm059);同济大学工科基金。

3通讯作者。

　E 2mail :renjie @
两性霉素B 缓释微球的制备及缓释性能研究
郁　晓　任杰3
　任天斌　袁　华
(上海同济大学材料学院纳米与生物高分子研究所,上海　200092)
摘　要:为了更好地研究药物载体材料对药物微球缓释性能的影响,本研究将可完全生物降解的共聚物作为壁材以相分离法制备含抗真菌药物两性霉素B 的微球,研究了不同溶剂Π非溶剂、不同分子量共聚物、不同配比共聚物、不同表面活性剂及其不同用量等因素对微球的粒径大小、分布、药物包封率和药物体外释放等性能的影响。

使用透射电镜(TE M )和原子力显微镜(AF M )观察微球的表面形貌,使用激光粒度分析仪测试微球的粒径大小及分布,使用紫外分光光度计测定药物的包封率。

研究发现,聚合物特性粘度和分子量越大,聚合物中LA :PEG 的配比越大,微球粒径越大,分布越宽;微球粒径越大,包封率也较大;Am B ΠP LA 2PEG 微球具有缓释性能,且含药微球的释放性能与微球的粒径,包封率等因素有关。

关键词:聚乳酸2聚乙二醇共聚物;微球;相分离法;缓释
Preparation and in vitro R elease B ehavior of Amphotericin B
Loaded P LA 2PEG Microspheres
Y U X iao RE N Jie 3　RE N T ian 2Bin Y UAN Hua
(Institute o f Nano and Bio 2Polymeric Materials ,School o f Material Science and Engineering ,Tongji Univer sity ,Shanghai 200092)
Abstract :Am photericin B (Am B )2loaded poly (lactic acid )2poly (ethylene glycol )(P LA 2PEG )m icrospheres were prepared by phase separation.The effect of the solvent Πnonsolvent system ,the com position of copolymer and the dosage of the T ween 280on the size ,the entrapment efficiency and the release behavior of the Am B loaded m icrospheres were investigated.The m orphology of m icrospheres was characterized by atom ic force m icroscopy (AFM )and transm ission electron m icroscopy (TE M )respectively.The average particle size and size distribution were measured by laser light scattering technique.The entrapment ratio of Am B by m icrospheres was measured by UV spectrophotometer.It was found the m icrospheres size increased w ith the increase of LA ΠPEG weight ratio and the m olecular weight of PEG segment in the P LA 2PEG.The entrapment efficiency of Am B in P LA 2PEG m icrospheres became higher and release rate became slower w ith the increase of LA ΠPEG ratio and addition of T ween 280.K ey w ords :P LA 2PEG copolymer ,m icrosphere ,nanoprecipitation ,controlled release
中图分类号　R318108 文献标识码　A 文章编号025828021(2007)0320445207
引言
两性霉素B (Am photericin B ,Am B )是目前用于
治疗深部真菌感染的首选药物,其作用机制是通过抑制易感真菌细胞膜功能而引起细胞代谢紊乱,细
胞成分丢失,最后死亡[1]。

为了有效地发挥Am B 的药性并降低其毒性,目
前临床应用的是将Am B 制备成脂质体纳米粒子[2-4]。

大部分临床或者动物实验是对Am B 不同剂型,不同产品治疗效果和急性毒性进行研究。

但是,为了更安全有效地使药物透过血脑屏障(BBB ),
人们仍然在尝试许多新的载药系统[5-7]。

本实验采用聚乳酸及其共聚物为药物载体成功地制备了Am B 纳米级载药微球,并且研究了载药微球的体外
释放性能。

聚乳酸材料具有优良的生物相容性和血液相容性,聚乳酸及其共聚物能够在体内逐步降解从而使微球内部药物缓慢释放出来,起到药物缓释的作用。

用聚乳酸类材料包裹Am B后可降低药物的毒性,有效缓解Am B的肝毒性和肾毒性,对于扩大Am B的应用有较大的意义。

目前制备微球的方法有很多[8-11]。

本研究采用的是相分离法制备载药微球。

相分离法虽然需要消耗有机溶剂,但可得到球形良好的微球,且操作简单,易于工业化生产。

P LA为疏水性物质,与亲水性药物相容性较差,不利于得到较高包封率的微球,故本实验采用了P LA2PEG的嵌段共聚物以改善囊材与药物的相容性从而提高药物包封率。

1　材料和方法
1.1　材料
P LA2PEG(PEG分子量分别为2000,4000,6000, 8000,10000;P LA∶PEG分别为4∶1,5∶1,8∶1,12∶1, 15∶1),采用本体聚合方法制得,Am B(上海先锋药业),其它试剂均为市售商品。

112　微球制备
采用丙酮和水为溶剂Π非溶剂,加入一定量的共溶剂,用相分离法制备含药微球[12]。

113　粒径的测定
将所得的微球悬浮液置于超声振荡器中使其分散均匀,然后用激光粒度分析仪(LS230,C oulter, US A)测定粒径。

114　原子力显微镜(AFM)
将所得的微球悬浮液用蒸馏水稀释后,置于超声振荡器中使其分散均匀,用滴管吸取少量悬浮液滴于载玻片上,待悬浮液自然风干后放于图像分析仪(Leica Q600;Leica Ltd1,Milton K eynes,UK)和原子力显微镜(SPA2300H V,Japan)载物台上,观察微球形态。

1.5　透射电镜(TEM)
日立H2600型透射电镜,加速电压75K V。

将含药微球乳液置于超声振荡器中使其分散均匀,铜网蘸取微球乳液,用1%磷钨酸溶液染色。

1.6　包封率的测定
1.6.1　标准曲线的测定
精密称取经干燥至恒重的Am B粉末,用二甲亚砜溶解,此溶液在415nm处有最大吸收,空白溶液此处无吸收干扰。

选用(415±1)nm为测定波长,再精密称取适量Am B粉末,用二甲亚砜溶解,分别吸取210m L,410m L,610m L,810m L,1010m L稀释至25m L,用紫外分光光度计(U21860,HIT ACHI)于(415±1)nm 测定吸光度,将浓度C对吸光度A进行回归,得出标准曲线方程:
C(mgΠm L)=-2175337×10-5+0102879A
(r=019993)(1) 11612　包封率的计算
将经过透析的含药微球加入二甲亚砜溶液,使微球中所含的药物溶解、过滤,吸取滤液于(415±1) nm测定吸光度A,根据标准曲线方程计算出浓度C,按下式求出颗粒中药物的含量(即包封率):
包封率=
C(mgΠm L)×提取液总容量(m L)×稀释倍数
投药量(mg)
×100% 117　微球体外药物释放
11711　标准曲线的测定
标准曲线的测定方法同11511,得标准曲线方程:
C(mgΠm L)=-3189604×10-4+0108332A
(r=019984)(2) 11712　缓释曲线的测定
精密称取药和含药微球适量,装入透析袋中,以pH714磷酸盐缓冲溶液为释放介质,放入37℃恒温水浴槽中,以一定时间间隔取样,同时加入新鲜的释放介质保持”漏槽状态”,样品于(409±1)nm处测定吸光度,根据标准曲线方程来计算释药量。

2　结果与讨论
211　不同参数对微球粒径和包封率的影响
Am B易溶于二甲亚砜及甲醇,微溶于水,而P LA -PEG易溶于丙酮不溶于水,所以本实验探索了采用不同共溶剂对Am BΠP LA2PEG微球包封率、粒径以及稳定性的影响。

21111　不同共溶剂的影响
根据Am B性质及之前对P LA2PEG共聚物的溶解性的研究,本实验为了提高药物的包裹量选用了二甲亚砜,无水甲醇为共溶剂,以期得到较小的粒径和较高的包封率。

另外,考虑到T ween280在体内作用时有助于穿越血脑屏障[13-15],实验研究了加入T ween280后对选定溶剂的影响。

实验中的各组微球均是以聚合物Π丙酮溶液与Am B的溶液为油相,以T ween280溶液为水相,采用水油比1∶1,投药浓度为0105mgΠm L制得。

对实验制得的微球采用了激光粒度分析和包封率测定,得到的具体数据见表1。

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表1　不同共溶剂对粒径和包封率的影响T ab.1　E ffect of different cosolvent on p article size and
entrapment efficiency
类型共溶剂表面活性剂粒径(nm)包封率(%)空白微球无无114±16
空白微球M eOH T ween280130±18
空白微球DMS O T ween280118±18
载药微球M eOH无131±172316载药微球M eOH T ween280133±173615载药微球DMS O无120±174215载药微球DMS O T ween280122±165017
从表1可以看出,共溶剂对Am BΠP LA2PEG微球粒径的影响不大,分布均较窄,粒径范围在110nm～150nm之间。

由于DMS O对Am B良好的溶解性,只需要少量的有机溶剂就可以得到较高的包封率,这对后期的动物实验很有意义。

另外,T ween280作为一种良好的表面活性剂,加入后对形成的微球起到了稳定作用,但是因为微球表面吸附着一些T ween2 80,所以粒径略微有增大,但也正因为表面活性剂的加入,降低了油水相的表面张力,使聚合物更好地包覆到了药物表面,提高了包封率。

因此,在后面的实验中,均采用了DMS O为共溶剂。

21112　不同表面活性剂量的影响
本实验通过改变表面活性剂的用量探讨它对Am BΠP LA2PEG微球粒径和分布的影响。

选用的表面活性剂是T ween280,因为在前期的实验中发现加入T ween280制得的含药微球粒径较小,包封率较高,且比较稳定,放置一周以上药物不会析出。

由图1可见,加入表面活性剂T ween280后,微球的平均粒径减小,分布变宽。

且T ween280用量为三滴(约01024g)以上后,增加用量对微球粒径及分布基本无影响。

说明仅少量分散剂便可达到较好的分散效果,这是由于少量T ween280分散在水中,可使水的表面张力明显降低,达到某一极限即临界胶束浓度
(C MC)后,继续增加用量表面张力粒径变化很小。

故丙酮Π水体系中可加少量的分散剂以获得粒径较小的微球。

21113　不同PEG分子量共聚物对微球性质的影响为了系统研究不同聚合物对微球性质的影响,实验中固定LA和PEG的配比为5∶1,改变PEG分子量制备了一组微球,投药浓度为012mgΠm L得到的粒径数据见图2,测得的包封率数据见图3。

由图2
图1　不同表面活性剂量对微球粒径的影响Fig.1　E ffect of the dosage of surfactant on p
article size
可见,聚合物特性粘度越大,扩散系数越小,油相粘度变大,扩散慢,因而得到的微球粒径也较大。

同时,随着聚合物平均分子量的增大,含药微球的平均粒径也会相应变大。

由图3可见,当PEG分子量在2000～10000时,Am BΠP LA2PEG微球的包封率变化不大。

因为PEG链段长度适中时,嵌入P LA链段后能很好地改善共聚物的亲水性和柔性,故而微球的药物包封率较高。

图2　PEG分子量聚合物对粒径影响(LA∶PEG=5∶1) Fig.2　E ffect of PEG molecular w eight on p article size (LA∶PEG=5∶1)
21114　不同聚合物共聚比对微球性质的影响PEG的分子量固定时,改变LA和PEG的配比也会对Am B载药微球的粒径和包封率等性质产生一定的影响。

实验中对PEG分子量为4000的一组聚合物作了对比。

由图4可见,Am B微球粒径随聚合物中PEG所占比例的减小而增加。

如前分析, PEG所占比例较小时共聚物分子链较长、分子量较大,更利于包裹药物形成粒径较大的微球,因而所形成的药物微球粒径也较大。

但这种共聚比例对药物微球粒径大小及分布的影响并十分明显,微球粒径
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3期郁晓等:两性霉素B缓释微球的制备及缓释性能研究
图3　不同PEG 分子量聚合物对包封率的影响(LA ∶
PEG=5∶1)
Fig.3　E ffect of PEG molecular w eight on entrapment efficiency (LA ∶PEG=5∶1)
变化趋势较小,各种微球粒径均在100nm 左右,且分
布均较窄。

由图5可知,几组微球的粒径呈现递增趋势,微球对药物的包封率也相应呈现递增趋势。

图4　不同配比聚合物微球粒径分布图(PEG 4000)
Fig.4　E ffect of LA ΠPEG ratio on p article size of microsphere (PEG 4000)
2.2　微球表面形貌21211　表面形貌宏观分析
实验还采用透射电镜对微球形貌进行分析,采用的共聚物组成PEG 8000,LA 与PEG 配比为5∶1,分别将微球放大5万倍和10万倍拍照。

如图6所示,用相分离法制备的微球成球性较好,粒径和分散较均匀,平均粒径在100nm 左右。

此外,实验还采用原子力显微镜对含药物微球进行了粒度和形貌的分析。

由图7可以看出,含Am B ΠP LA 2PEG 微球成球性较好,表面光滑。

微球的
粒径大概在100nm 左右。

图5　不同配比聚合物对包封率的影响(PEG 4000)
Fig.5　E ffect of LA ΠPEG ratio on the entrapment efficiency (PEG
4000)
图6　微球的表面形貌(TEM)(PEG 4000,LA ∶PEG =
5∶1)(a)放大五万倍;(b)放大十万倍
Fig.6　TEM morphology of drug loaded microspheres (PEG 8000,LA ∶PEG=5∶1)(a)50000×;(b)100000
×
图7　微球的AFM 立体图
Fig.7　AFM morphology of drug loaded microspheres (PEG 8000,LA ∶PEG=5∶1)
8
44中　国　生　物　医　学　工　程　学　报26卷
213　药物体外释放实验
21311　不同配比聚合物微球的体外释放比较
影响药物的释放主要和药物载体的结构,药物和载体的结合方式以及药物的性质有关。

最佳的释放是匀速释放,但在大多数情况下情况较为复杂,通常包含两个释放阶段,初始阶段的突释和后期与扩散,降解有关的稳定释放阶段。

本组实验中将两组PEG 分子量相同而LA ΠPEG 配比不同的微球进行了体外缓释性能的比较,并将得到的数据绘制成缓释曲线,
如图8。

图8　不同配比聚合物微球体外释放比较
Fig.8　E ffect of LA :PEG ratio on release property of microsphere
由图8可见,随着聚合物配比的提高,药物的释放速率逐渐下降。

在释放初期的突释结束后,微球呈现了长达50h 平稳缓慢的释放。

与配比为8∶1的共聚物制备的微球在10h 内释放了37%相比,配比为15∶1的共聚物制备的微球相同的时间仅释放了20%,可见随着配比提高,释放的速度变慢。

突释效
应主要是由于Am B 的快速扩散和微球表面的PEG 链段造成的。

配比越高,聚合物的亲水性越差,减缓了药物从微球载体向外扩散的速度。

随着配比变大,微球粒径的变大也是一个因素(图4),因为随着微球粒径变大,微球的表面积变小,造成了缓慢的释放。

21312　不同分子量聚合物微球的体外释放比较
本组实验固定LA ∶PEG 的配比为5∶1,通过改变PEG 的分子量制备一系列微球,PEG 分子量越大,配
比一定时,共聚物分子量也越大,对其进行了体外缓释的比较,缓释曲线见图9。

图9为不同PEG 分子量的微球的释放曲线,随着PEG 分子量降低,药物的释放速度也变得缓慢。

因为随着PEG 分子量的变大
,聚合物的分子量、微
图9　不同分子量聚合物体外释放比较
Fig.9　E ffect of PEG molecular w eight on release property of microsphere
球的粒径及表面积变大,导致释放的缓慢表面活性
剂对药物微球缓释性能产生影响。

21313　表面活性剂对药物微球缓释性能的影响2131311　含不同种类表面活性剂的微球的缓释比较
本组实验研究了三种不同表面活性剂T ween 280,S pan 280和1%PVA 对微球体外缓释性能的影响。

各组表面活性剂加入量均为4滴(约01103g ,得到的缓释曲线见图10。

分别加入三种不同的表面活性剂制得的微球在体外缓释方面区别较小。

加入S pan 280制得的微球药物随时间增加逐步释放,无明
显的台阶阶段,最先达到释药平衡。

而加入T ween 2
80和1%PVA 制得的微球体外释放曲线相似,在包封率和粒径方面也相近,显示出三种不同表面活性剂在亲水亲油性上的差别。

S pan 280亲油性较好而亲水性不如T ween 280和PVA ,所以对于亲水性药物两性霉素B 而言,它的包封率最低,释放最快。

而T ween 280与1%的PVA 相近,两种微球性质也相似。

2131312　含T ween 280和不含T ween 280的微球体外缓释比较
本组实验主要研究了加入表面活性剂T ween 280后对含药微球体外缓释性能的影响。

实验中采用相同条件下不加表面活性剂的一组微球作为对比,得到的缓释曲线如图11。

包含T ween 280的药物微球在释放时相对无T ween 280微球更为平稳,释放均匀。

这主要是由于
加入表面活性剂T ween 280后微球粒径较小且分布
均匀,因而释放平稳。

此外,加入T ween 280后,微球的包封率有所提高,所以在前五个小时内,未加入T ween 280的微球释放百分比达到40%,而加入
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443期郁晓等:两性霉素B 缓释微球的制备及缓释性能研究
图10　不同表面活性剂对药物体外释放的影响
Fig.10　E ffect of kind of surfactant on release property of
microspheres
图11　含Tw een 280和不含Tw een 280微球的体外释放比较
Fig.11　E ffect of Tw een 280on release property of microsphere
T ween 280后,释放百分比只在20%左右。

这一现象
再次说明在缓释的第一阶段,P BS 溶出的主要为未被微球包裹的药物,同时此阶段的释放比也能在一定程度上反映出微球包封率和粒径上的差别。

之后,药物随微球的降解逐步释放出来,释放过程较为平稳。

当微球完全崩解以后,释放达到100%,即释放基本完成。

2131313　含不同量表面活性剂的微球的缓释比较
本组实验选用T ween 280为表面活性剂,通过改变加入量来反映不同量T ween 280对微球体外缓释性能的影响,得到的缓释曲线见图12。

虽然加入T ween 可以使包封率有所提高,但是对药物的释放没有太大的影响,当添加012%,018%和114%的T ween 280时,载药微球的释放行为类似。

图12　不同表面活性剂量对含药微球体外释放的影响
Fig.12　E ffect of dosage of Tw een 280on release property of microspheres
3　结论
采用本体开环聚合的方法,成功制备一系列不
同P LA ΠPEG 共聚比及共聚比一定时不同PEG 分子量的P LA 2PEG 嵌段共聚物,并以此聚合物为原料用改进后的相分离法成功制备出两性霉素B 可生物降解缓释微球。

实验中得出以下结论:
11将溶剂相滴入非溶剂相是一种较好的制备微球的操作方法,由此法制备出的微球不仅粒径很小(达到纳米级),成球性好,而且粒径分布较窄,颗
粒分散性较好,是一种理想的微球制备操作方法。

同时证明了丙酮Π水是一组较好的溶剂Π非溶剂体系。

21聚合物分子量,特性粘数共同影响Am B ΠP LA 2PEG 微球粒径及其分布,但对包封率影响不明显。

微球粒径随聚合物中LA 与PEG 配比的增大而增大,同时药物包封率也相应提高。

31表面活性剂的加入有利于减小微球的粒径,但当加入量过多时影响变得不明显。

此外,由透射电镜和原子力显微镜对微球表面的观察可知,加入表面活性剂后微球具有更好的成球性且分散性较好。

41Am B ΠP LA 2PEG 微球具有较好的缓释效果。

Am B ΠP LA 2PEG 微球降解速率随着聚合物中PEG 含量的降低而减小,且聚合物中亲水PEG 链段所占比例较大时,药物微球较先达到释药平衡。

此外,聚合物中PEG 分子量也影响药物微球释药性,随着聚合物中PEG 分子量的减小,聚合物降解速率加快,药物微球较早达到释药平衡。

加入表面活性剂T ween 280后含药微球的释放比同等条件下未加T ween 280
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的微球平稳。

参考文献
[1]W alsh T J,Pizz o A1T reatment of system ic fungal in fections:recent
progress and currentproblems[J].Eur J Clin M icrobiol In fect Dis,
1988,7:460-475.
[2]K assab R,Parrot2Lopez H.M olecular recognition by kluyveromyces
of am photericin B2loaded,galactose2tagged,polylactic acid
m icrospheres[J].Bioorg M ed Chem,2002,10:1767-1775. [3]Adler2M oore J,Proffitt RT.Am Bis ome:lipos omalformulation,
structure,mechanism of action and pre2clinical experience[J].J
Antim icrob Chem other,2002,49:21-30.
[4]K oike FH,Saheki T.A novel delivery system for am photericin B
with lipid nano2sphere(LNS○R)[J].Int J Pharm,2003,265:37-
45.
[5]赵荣生,严宝霞,侯新朴.两性霉素B脂质体的研制及其质
量评价[J].中国药学杂志,2000,9(35):593-595.
[6]Adams M L,G len S.K w on.Relative aggregation state and
hem olytic activity of am photericin B encapsulated by poly(ethylene
oxide)2block2poly(N2hexyl2L2aspartam ide)2acyl conjugate
m icelles:effects of acyl chain length[J].J C ontroll Rel,2003,
87:23-32.
[7]G ulyaev AE,G elperina SE,Skidan IN,et al.S ignificant transport
of of dox orubicin into the brain with polys orbate802coated
nanoparticles[J].Pharm Res,1999,16(10):1564-1569. [8]Johns on O L,Jaw orowicz W,Ctetand JL,et al.The stabilization
and encapsutation of human growth horm one into biodegradable
m icrosphere[J].Pharm Res,1997,14:730-736.
[9]Sacchetti C,Artusi M,Santi P,et al.Caffeine m icroparticles for
nasal adm inistration obtained by spray drying[J].Internati J of
Pharm,2002,242:335-339.
[10]任杰,宋金星,洪海燕.生物可降解P LA2PEG共聚物微球的
制备及表征[J].同济大学学报(自然科学版),2003,31(2):
191-195.
[11]Jung J,Perrut M.Particle design using supercritical fluids:
Literature and patent survey[J].Supercritical Fluids,2001,20
(3):179-219.
[12]Fessi H,Puisieux F,Devissageut JP,et al.Nanocapsule formation
by interfacial deposition following s olvent displacement[J].Int J
Pharm,1989,55:R12R4.
[13]K euter J,Alyautdin RN,K harkevich DA,et al.Passage of
peptides through the blood brain barrier with colloidal polymer
particles(nanoparticles)[J].Brain Res,1995,674:171-174. [14]G ulyaev AE,G elperina SE,Skidan IN,et al.S ignificant transport
of dox orubicin into the brain with polys obate802coated nanoparticles
[J].Pharm Res,1999,16(10):1564-1569.
[15]Schroeder U,S ommerfeld P,Ulrich S,et al.Nanoparticle
technology for delivery of drugs across the blood2brain barrier[J].J
Pharm Sci,1998,87(11):1305-1307.
154
3期郁晓等:两性霉素B缓释微球的制备及缓释性能研究。