结构生物学(生物大分子解析方法)

如1997 年底,应用X 射线单晶衍射方法完 成了有关核小体 (nucleosome) 的核 心颗粒分辨率为 0128nm的精细空间结 构的测定,每个核小 体的盘状核心含有8 个组蛋白形成的八面 体、外绕146 个碱基 对组成的DNA ,这一 杰出的成就对了解基 因转录、DNA复制与 修复的动态过程都很 重要.
结构生物学的发展
起源：1950s, Waston, Crick 发现了 DNA双螺旋结构，建立 DNA的双螺旋模型。 • 60年代 当时的开文迪许实验室的M.Perutz J.Kendrew 用X-射 线晶体衍射技术获得了球蛋白的结构.由于X射线晶体衍射技术 的应用，使我们可以在晶体水平研究大分子的结构，在分子原 子基础上解释了大分子. • 由于他们开创性的工作，Waston ,Crick获得了1962年的诺贝 尔生理学与医学奖,M. Perutz和J.Kendrew获得了同年的化学 奖. • 从那时起，技术的发展就成为结构生物学发展最重要的决定因 素。
1 | F(hkl) | exp[2 i(hx ky lz) i(hkl)] V h k l
k
为电子密度，xyz 为实空间坐标
V 为晶胞体积
|F(hkl)|2 = I(hkl)，I 代表衍射点的强 度，hkl 为衍射点坐标 代表初始相角
h
f(x) = A cos(2x – )
X-ray测定生物大分子结构的原理
为什么要用X-射线
d
假设原子的尺度为d
l >> d
ld
只有光源波长与障碍物尺度相当，或者光源波长小于障碍物尺度的时候 才能探测到障碍物的信息。
X-ray
Protein Crystal
X-射线的波长与原子以及化学键的尺度相当，都在Å的数量级。因此可以 被用来探测蛋白质分子内部的结构。
解决相位问题的方法：
同晶置换法 最原始的方法，包括多对同晶置换法和单对同晶置换法。需 要在蛋白质晶体中引入重原子，并且要求引入了重原子的晶体与 未引入重原子的晶体的晶型基本相同。解析过程需要未引入重原 子、引入了重原子，甚至引入了不同重原子的多颗晶体的多套衍 射数据。
反常散射法 包括多波长反常散射法和单波长反常散射法。通常需要引入 具有较强反常散射能力的原子，如硒原子。不需要多颗晶体但往 往需要同一颗晶体在不同波长X-射线照射下的多套衍射数据。随 着技术的进步，目前蛋白质自身的硫原子也开始被用来作为反常 散射源。 分子置换法 需要同源性较高的蛋白质分子结构模型，不需要多颗晶体， 不需要多套衍射数据，方便快捷，但不能用来解析全新的结构。
蛋白质结晶技术：
整批结晶法 液液扩散法 透析法 气相扩散法 a. 悬滴法 b. 座滴法
悬滴法
1ml 蛋白溶液
1ml 结晶溶液
结晶溶液池
座滴法
1ml 蛋白溶液 1ml结晶溶液
结晶溶液池
无论是悬滴法还是座滴法，当达到蒸汽平衡的时候，蛋白质所在液滴里的 结晶溶液组分的浓度将会接近于池液的浓度。
以蛋白质为例,它的二级结构如α螺旋,β 折叠、转角、环形和卷曲等,体现了蛋白质 分子主链原子在三维空间各种不同的排列 规律性. 位于不同二级结构域的原子核间 距,原子核间的相互作用以及多肽段的动态 特性,都直接反映蛋白质三维结构的特征. 这些具有不同结构特征的原子核间距、肽 键二面角、肽键的动态特性等都具有特征 的核磁共振谱线. 因此,我们分析核磁共振 谱就可以获得蛋白质的三维结构. 1H,13C,15N是核磁共振检测的主要对象,各有 不同的共振频率,从而形成核磁共振氢谱、 碳谱和氮谱三部分.
•60-70年代,在同一实验室的他们又发展了电子晶体 学技术，当时的研究对象主要是有序的,对称性高的 生物体系，如二维的晶体和对称性很高的三维晶体。 •70-80年代，多维核磁共振波谱学的发明使得在水溶 液中研究生物大分子成为可能,水溶液中的生物大分 子更接近于生理状态. •80年代到本世纪初,冷冻电子显微镜的发明,这种技 术的发明使我们不仅能够研究生物大分子在晶体状态 和溶液状态的结构，而且能够研究研究复杂的大分子 体系超分子体系，这就是细胞器和细胞. 可见结构生物学的发展过程经历了从结晶到溶液再到 大分子体系,超分子体系,如核糖体(ribosome),病毒, 溶酶体(lysosome),线粒体等.
此外,应用X 射线单晶衍射技术测定蛋白质和核酸的 晶体结构并结合分子模拟技术,已经为新药物的设计 提供了一个全新的方向,大大缩短了新药的研制过程. 新药的设计和开发,要求对这些药物靶标( drug target ) 的结构、性能有精确的了解,由于迄今对 其了解甚少,现有临床药物绝大多数是通过尝试筛选 获得的,导致研制一个新药常常需十多年,甚至几十 年的时间. 通过对爱滋病病毒(HIV) 蛋白酶 的精细结构测定,并以此为靶标 设计酶的抑制剂作为治疗爱滋病 的有效药物获得巨大成功,已显 著减少爱滋病死亡数量.
X- 射线晶体衍射方法
• X射线单晶衍射技术是由H. W. 布拉格和W.L. 布拉格父子于 1912 年提出和发展起来的. 此技术最先用于无机晶体分析,后 来到1953 年,沃森和克里克用于DNA 晶体分析,至60 年代,肯德 鲁和佩鲁兹用于研究血红蛋白和肌红蛋白,逐渐成为生物大分子 晶体结构研究的重要手段,直至今天仍占据统治地位。 • 优点是分辨率高,达到原子分辨率,既可研究水溶性蛋白、也可 研究膜蛋白和大分子组装体与复合体。它能给出生物大分子的 分子结构和构型,确定活性中心的位臵和结构,从分子水平理解 蛋白质如何识别和结合客体分子,如何催化,如何折叠和进化等 生命的基本过程,进而阐明生命现象。
=0
0
1
2
3
4
x
= /2
0
1
2
3
4
x
= -
0
1
2
3
4
x
0
0
对于一束X-射线 f(x) = A cos(2x – )来说，无论它的初始相角是多少，它在接收 屏上所形成的曝光点都是相同的。反之，我们只根据接收屏上的曝光点也是无法得 知造成该曝光点的X-射线的初始相角信息的。 初始相角无法直接测量得到，但它又是求解电子密度时所必需的信息。这就是X-射 线晶体衍射法解析物质结构时所需要解决的核心问题——相位（相角）问题。
主要技术流程图
蛋白质结晶的必要条件
蛋白质分子必须均一（纯化）
均一的蛋白质分子
不均一（不纯）的蛋白质分子
沉淀剂的作用
沉淀 沉 淀 剂 浓 度 未饱和
成核区 过饱和区
蛋白质浓度
获得蛋白质晶体的方法 由于蛋白质分子体积大，分子表面情况复杂， 极性不明显，分子间作用力弱等原因，蛋白质 分子在达到过饱和的时候不容易有序排列形成 晶体，而是容易随机聚合形成沉淀。因此需要 针对不同蛋白质筛选各自的结晶条件。
为什么要用衍射
把透镜 换成X射线 透镜
把光源换 成X射线
到目前为止人类还没有发现什么方法能够让X-射线发生折射。所以当前 只能通过衍射这种不那么直观的方法来研究蛋白质分子内部构造。
什么是晶体
晶体在宏观上呈现 出规则的几何形状
二维排列ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
Cl Na Cl Na Cl Na Na Cl Na Cl Na Cl Cl Na Cl Na Cl Na Na Cl Na Cl Na Cl Cl Na Cl Na Cl Na Na Cl Na Cl Na Cl Cl Na Cl Na Cl Na Na Cl Na Cl Na Cl Cl Na Cl Na Cl Na Na Cl Na Cl Na Cl Cl Na Cl Na Cl Na Na Cl Na Cl Na Cl
三维堆积
Na Cl Na Cl Na Cl Cl Na Cl Na Cl Na Na Cl Na Cl Na Cl Cl Na Cl Na Cl Na Na Cl Na Cl Na Cl Cl Na Cl Na Cl Na
Cl Na Cl Na Cl Na Na Cl Na Cl Na Cl Cl Na Cl Na Cl Na Na Cl Na Cl Na Cl Cl Na Cl Na Cl Na Na Cl Na Cl Na Cl
晶体是一种具有长程、三维分子有序的固体。
小孔光栅
衍射图样
如何根据衍射结果解析蛋白质结构
1 ( xyz) | F(hkl) | cos[2(hx ky lz) (hkl)] V hkl
参考 f(x) = A cos(2x – ) 上式也可表示为：
( xyz)
核磁共振
(NuclearMagnetic Resonance -NMR)
最初,核磁共振技术主要用于核物理研究方面,用它测量各种原子核的磁矩, 误差仅是0. 003 %～0. 005 %; 迄今,它已广泛应用于化学、食品、医学、 生物学、遗传学等学科领域,已成为在这些领域开展研究工作的有力工具, 甚至是某些领域(如:化学、医学诊断、药物学等) 常规分析中不可缺少的 手段。 1985 年,维特里希( Kurt Wüthrich）等人公布了第一次利用NMR 法测定的 溶液中蛋白质-蛋白酶抑制剂IIA ( proteinase inhibitor IIA) 的结构 (如图4 所示)。1990 年用NMR 测定的蛋白质结构有23 个,而到1994 年一 年测定的蛋白质结构数上升到100个。1997 年,维特里希应用NMR 方法测定 的一种蛋白质-蛋白感染素(prion protein) 的结构。
衍射实例
缺点：样品必须为晶体（单晶）,但生物大分 子结晶困难,特别是膜蛋白和病毒等分子组装 体结晶更是困难. 其次对于像病毒那样大的分子组装体,测量其 精细结构十分复杂. 原因有二: 一是大晶胞含有的原子极多,X射线衍射点极 多,常常无法区分、辨认和探测; 其二是大晶胞所产生的衍射点强度过弱,特别 在高分辨时,无法与背景区分.
结晶条件的优化 最初筛选得到的结晶条件往往不是该 蛋白的最佳结晶条件。此时的蛋白质 晶体往往衍射能力很差，甚至没有衍 射。因此一般来说还需要对该蛋白质 的结晶条件进行优化。
优化前 优化的方法就是把结晶溶液中的沉淀 剂、辅助分子，结晶时的蛋白质浓度 在原浓度附近做一个梯度；相应地， 结晶溶液中的pH值也要在原值附近做 一个梯度。在把这些梯度排列组合起 来，从而找出一个最佳的结晶条件。 优化后
NMR也是测定生物大分子结构重要手段
基本原理：核磁共振现象( nuclear magneticresonance spectroscopy ,NMR) 1946 年由哈佛大学的伯塞( E.M.Purcell) 和斯坦福大学的布洛赫 (F.Bloch) 所领导的2个小组,用不同的方法在各自的实验室里观察到的, 伯塞尔使用的实验方法是吸收法,而布洛赫使用的是感应法. 利用物理原理,通过对核磁共振谱线特征参数的测定来分析物质的分 子结构与性质。NMR 不破坏被测样品的内部结构，是一种无损检测方法。 由于不同的原子核吸收不同的电磁波，因而通过测定和分析受测物质对电 磁波的吸收情况就可以判定它含有哪种原子，原子之间的距离有多大，并 据此分析出它的三维结构。
结晶溶液 结晶溶液成分：
沉淀剂 通常为不同分子量的聚乙二醇或者高浓度的硫酸铵、氯化钠等。
辅助分子 通常为低浓度的盐 pH缓冲剂
例如： Hampton Research Crystal Screen Kit #14 0.2M CaCl2 0.1M HEPES pH7.5 28% (v/v) PEG400 Detergents and additives
结构生物学的研究方法和技术
生物大分子要发挥功能，必须满足两个条件: • 第一，凡要发挥功能和活性的生物大分子 必须具有特定的，自身特有，相对稳定的 三级结构; • 第二，结构运动。任何的破坏促使没有稳 定的三级结构和结构运动，生物大分子是 很难发挥生物功能或活性的。
结构生物学概念及主要研究方法
结构生物学是通过确定生物大分子三级结构，来研 究生物大分子的结构功能关系，从而探讨生物大 分子的作用机制和原理作为研究目的。 主要研究方法: • X- 射线晶体衍射方法（X- 射线蛋白质晶体学） • 多维核磁共振（ NMR ） • 电镜晶体学和电镜三维重组方法