核酸适体筛选方法的研究进展_徐龙峰

1990年，Ellington等［1］和Tuerk等［2］创建了一种能制备高特异性、高亲和力结合靶分子的寡核苷酸技术，称为指数富集的配体系统进化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技术。用这种技术制备的寡核苷酸分子称为适体（aptamer），一般由几十个核苷酸组成，可以是RNA 或单链DNA。理论上几乎所有自然界中存在的靶分子均可通过SELEX技术筛选得到相应的适体。20多年来，核酸适体作为新型的仿生识别元素，在疾病诊断治疗、药物筛选、分子识别、分析检测等众多领域得到了广泛的应用，国内外众多科学工作者通过SELEX技术筛选得到了多种靶分子的适体，核酸适体筛选技术本身也得到了不断地完善和发展。1SELEX技术的原理及流程

SELEX技术是体外筛选核酸适体的基本方法，是一种以组合化学技术、PCR技术以及基因克隆测序技术等为基础的现代分子进化工程技术，该技术的操作流程类似于达尔文的生物进化论中所包含的3个过程：自发突变、自然选择和大量增殖［3］。采用SELEX技术筛选适体包括以下几个基本步骤：①人工合成随机的寡核苷酸序列文库，文库的容量一般在1014～1018之间，文库中随机寡核苷酸序列一般为20～60个碱基文库；②在特定的筛选缓冲体系中将寡核苷酸库与靶分子孵育；③用离心法、柱层析法、膜过滤法、毛细管电泳法、磁珠法等特定的方法，将与靶分子结合的寡核苷酸序列从体系中分离；④对分离的特异性结合的核酸序列进行PCR扩增；⑤将PCR扩增获得双链DNA利用磁珠法、核酸外切酶

核酸适体筛选方法的研究进展

徐龙峰综述，王丽审校

安徽科技学院食品药品学院，安徽凤阳233100

摘要：核酸适体是能以极高的亲和力和特异性与靶分子结合的寡核苷酸序列，可识别的靶分子范围非常广，理论上自然界存在的任何物质均可通过指数富集的配体系统进化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技术，筛选到其相应的核酸适体。近年来，在传统SELEX技术的基础上，新的SELEX技术不断出现，如毛细管电泳SELEX（capillary electrophoresis SELEX，CE-SELEX）、荧光磁珠SELEX（FluMag SELEX）、自动化SELEX（auto－mated SELEX）、细胞-SELEX（cell-SELEX）、消减SELEX（subtractive SELEX）技术等。这些新技术的出现，在不断完善SELEX技术的同时，也极大地推动了适体技术在各学科领域中的发展及应用。本文对核酸适体的筛选方法进行了总结和展望，为核酸适体的筛选提供了参考。

关键词：核酸适体；筛选方法；指数富集的配体系统进化技术

中图分类号：Q789R927文献标识码：A文章编号：1004-5503（2015）04-0429-05

Advance in research on method for screening of aptamers

XU Long-feng,WANG Li

College of Food and Drug,Anhui Science and Technology University,Fengyang233100,Anhui Province,China

Corresponding author：WANG Li,E-mail：wangli@

Abstract：Aptamers are oligonucleotides that can bind to a wide range of target molecules with high affinity and speci－ficity.The aptamers to all target molecules in nature may be theoretically screened by systematic evolution of ligands by exponential enrichment（SELEX）.In recent years,on the basis of traditional SELEX technology,new SELEX technologies are emerging such as capillary electrophoresis SELEX（CE-SELEX）,fluorescent magnetic beads SELEX（FluMag SELEX）, automated SELEX and cell-SELEX,subtractive SELEX.The new technologies improved the SELEX process gradually and promoted their application in various fields.This paper summarized and prospected the methods for screening of aptamers and provided a reference for aptamers screening.

Key words：Aptamers;Screening methods;Systematic evolution of ligands by exponential enrichment（SELEX）

·综述·

基金项目：国家自然科学基金（31201369）；安徽科技学院自然科学

研究项目（ZRC2014395）.

通讯作者：王丽，E-mail：wangli@

DOI:10.13200/ki.cjb.000864

法、变性高效液相色谱法拆分获得次级的寡核苷酸库；⑥重复②～⑤步，随着筛选轮数的不断增加，文库里亲和力低的寡核苷酸序列被逐渐淘汰，对最终筛选到的寡核苷酸序列进行克隆测序，并对寡核苷酸序列与相应的靶分子结合的特异性和亲和力进行鉴定和检测［4］。

2核酸适体的筛选方法

将分子进化的过程在体外进行是SELEX技术最大的特点，但在适体筛选的实际过程中，往往会受到筛选环境以及SELEX技术本身的限制，影响到筛选效率和效果。近年来，在传统SELEX技术的基础上，新的SELEX技术不断涌现，这些新的技术在不断完善SELEX技术的同时，也极大地推动了适体技术在生物医学、药物筛选、靶向治疗、农药检测［5］、环境监测、食品安全等领域中的发展和应用。

2.1毛细管电泳ＳＥＬＥＸ（ｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓＳＥＬＥＸ，ＣＥ-ＳＥＬＥＸ）技术如何将与靶分子结合的寡核苷酸从体系中分离出来，是限制传统SELEX技术发展的一个瓶颈。2004年，Mendonsa等［6］根据核酸适体与靶分子结合后使靶分子原有的质量和构象发生改变并导致其电泳行为变化的特性，运用毛细管电泳技术将靶分子结合的核酸与游离的核酸进行了有效的分离。2005年，Drabovich等［7］利用CE-SELEX技术，仅用3轮筛选就获得了能特异性结合Muts蛋白的适体。Tang等［8］对毛细管电泳法与亲和层析法筛选蓖麻毒素的适体的结果进行比较，亲和层析法在第9轮筛选后结合率仅为38.5%，而毛细管电泳法在第2轮筛选后结合率已达60.2%，经过4轮筛选后结合率高达87.2%，整个实验在2周之内完成。CE-SELEX技术最大的优点就是显著提高了筛选效率，一般仅需2～4轮筛选即可获得所需适体［4］。利用毛细管电泳的微量流体技术使得筛选效率大大提高，尤其适用于常规筛选不易获得的极少量靶物质的适体［9］。徐华等［10］以表达有绿色荧光蛋白的HepG2细胞作为靶细胞，利用CE-SELEX 技术仅经过1轮筛选就获得了较好的效果。Krylov 等［11］将动力学方法与毛细管电泳结合，创建了平衡混合物非平衡毛细管电泳（non-equilibrium capillary electrophoresis of equilibrium mixtures，NECEEM）技术。Berezovski等［12］利用NECEEM技术，仅用了1轮筛选就获得了亲和力为1nmol／L的法呢基转移酶（farnesyltransferase，FTase）适体。Yang等［13］利用CE-SELEX技术，仅用了3轮筛选就获得了NMM（N-methyl mesoporphyrin）的适体。Tran等［14］利用这种方法，经过8轮筛选成功获得了花生过敏原之一的阿糖胞苷H1的适体。CE-SELEX技术的主要缺陷是进样体积小（nL级），文库中DNA分子的数量一般只有1013个［4］。

2.2荧光磁珠ＳＥＬＥＸ（ＦｌｕＭａｇＳＥＬＥＸ）技术2005年，Stoltenburg等［15］引入荧光标记和磁珠分离技术筛选了链霉亲和素的适体，建立了FluMag SELEX技术。他们首先将链酶亲和素包被在磁珠上，然后与文库孵育，将未与靶分子结合的核酸分离除去，对洗脱下来的目标核酸用荧光标记的引物进行PCR扩增，最后采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，回收正义链生成次级文库进入下一轮筛选。同年，Mann等［16］利用该方法成功筛选到了乙醇胺的核酸适体。2010年，Kim等［17］用FluMag SELEX技术成功筛选到了布洛芬的适体，结果表明，所得适体对于布洛芬具有较高的特异性，而对于结构相似的布洛芬类似物（非诺洛芬、氟比洛芬和萘普生）和土霉素则未表现出任何的亲和力。2012年，Xu等［18］用同样的方法筛选到了3，3′，4，4′-四氯联苯（PCB77）的适体，成为环境快速监测的潜在工具。该方法操作简单，筛选快速高效，所需靶分子量少，且节约成本，利用荧光来定量从而避免了同位素的使用，可以对与靶分子结合的核酸量进行定量监控分析。

2.3自动化ＳＥＬＥＸ（ａｕｔｏｍａｔｅｄＳＥＬＥＸ）技术1998年，Cox等［19］在Beckmann Biomek2000Pipetting系统的基础上创建了自动化筛选工作站，首先通过链酶亲和素与生物素之间的作用，将被生物素标记的靶分子固定在磁珠上；然后将与靶分子结合的寡核苷酸序列从体系中分离出来，RT-PCR扩增和转录则通过已设定的程序自动完成；经12轮筛选成功获得了溶菌酶的适体，整个筛选过程仅用了不到2d的时间。2005年，Eulberg等［20］在此基础上创建了半自动化筛选平台，并成功筛选出了P物质的适体。该筛选平台将超滤设备、荧光检测器和半定量PCR仪等设备整合到一起，实现了对与靶分子结合的寡核苷酸量的在线监控，同时也能满足在不同的缓冲溶液以及其他严格的筛选要求。2006年，Hybarger 等［21］创建了由PCR仪与Labview控制的活动瓣膜组成的微流SELEX样机，将操作转移到芯片微流环境中进行，具有提高筛选速度和降低成本等优势。

2.4细胞-ＳＥＬＥＸ（ｃｅｌｌ-ＳＥＬＥＸ）技术cell-SELEX 技术是指使用完整的细胞与核酸文库直接作用，从而筛选出能与细胞表面分子特异性结合的适体的技术。目前，采用该技术筛选到的一些适体已被用