虫草多糖的提取

1.前言 蛹虫草 Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ （Ｌ）Ｌｉｎｋ．又称蛹草、北虫草、北冬虫夏草， 为真菌界子囊菌亚门 （Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、肉座菌目 （Ｈｙｐｏｃｒｅａｌｅｓ）、麦角菌 （Ｃｌａｖｉｃｉｐｉｔａｃｅａｅ）的虫草属，是一种虫生真菌，与冬虫夏草同属异种［１］。 蛹虫草由虫体与从虫头部长出的真菌子座相连而成，虫体似蚕，长 ３－５ｃｍ，直径 ０．３－０．８ｃｍ ；表面深黄色至黄棕色，有环纹 ２０－３０ 个，近头 部的环纹较细；头部红棕色，足 ８ 对，中部 ４ 对较明显；质脆，易折断，断 面略平坦，淡黄白色。子座细长圆柱形，长 ４－７ｃｍ，直径约 ０．３ｃｍ；表面深 棕色至棕褐色，有细纵皱纹，上部稍膨大；质柔韧，断面类白色。气微腥， 味微苦［２］。蛹虫草在世界各地分布广泛，我国的吉林、河北、四川、湖南、 湖北、山西等省均有生长。其子座于春至秋季在半埋于林地上或腐枝落 叶层下的鳞翅目昆虫蛹上长出［３］。 蛹虫草主要有效成分虫草素，结构为 ３＇－ 脱氧腺苷，结构与腺苷相 似替代腺苷。虫草素是第一个从真菌中分离出来的核苷类抗菌素，分子 量为 ２５１Ｄ，熔点 ２３０－２３１℃，溶于水、热乙醇和甲醇，不溶于苯、乙醚和 氯仿，紫外光的最大吸收波长为 ２５９ｎｍ［４］ 。虫草多糖被认为是一种活性 物质，关于其结构和生物合成已有一定的研究。虫草多糖的生物合成已 经得到了初步的研究，不同培养方式的多糖产率有一定的差异，可以通 过优化培养条件来提高多糖的产量。虫草多糖产业化生产已成了研究 的热点之一［５］。 蛹虫草作为传统珍贵中药材，我国人民对其药用价值早有认识。 蛹虫草人工栽培成功以来，药理和毒理等方面的研究得到了广泛 的开展。研究表明蛹虫草具有与冬虫夏草极相似的作用，无毒副作用， 近年来，随着人们对蛹虫草的滋补保健功效和多种药用价值的认识，其 开发利用研究倍受关注，并在药理、有效成分及人工栽培等各方面取得 了很大的进展。 蛹虫草是一种具有滋补作用的中药和营养品，其所含的虫草素、虫 草多糖具有独特的药理及保健功效：虫草素具有抗病毒、抑菌、明显抑 制肿瘤生长，与环磷酰胺有明显的协同作用，并有降血糖的作用；虫草 多糖具有提高机体免疫功能、免疫调节，抑制肿瘤作用、降血压、抗衰 老、抗疲劳、调节内分泌、抑菌、抗病毒等多种药理作用，长期以来被视 为珍贵的强壮滋补中药和藏药。 近年来蛹虫草受到了广泛关注，并大面积地种植开发，近年来蛹虫 草人工培养及其活性成分的研究才活跃起来， 而人工培养已有大量药 品、保健食品上市。为了更好地开发利用蛹虫草资源，本研究采用正交 试验对蛹虫草中虫草素和虫草多糖综合提取工艺进行了深入研究，为 进一步开发利用提供有价值的参考数据，也将会对今后产品开发研究 具有重要的意义。 2.材料与方法 ２．１ 实验材料、仪器及试剂 ２．１．１ 实验材料 蛹虫草粉末：由江苏虫草种植基地提供，先用样品均在 ７０℃下真空 低温干燥 ５－６ｈ，干燥后粉碎研成粉末，装瓶备用。 ２．１．２ 主要仪器与设备 高效液相色谱仪：日本 ＨＩＴＡＣＨＩ （由 Ｌ－７１１０ 液压恒波泵、Ｌ－７４２０
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专题论述
蛹虫草虫草素和虫草多糖综合提取工艺的研究
沈阳信天翁医药有限公司 祁 波
［摘 要］蛹虫草（Cordyceps militaris）在我国本草文献中已有记载。近年来的研究更进一步证实了蛹虫草与冬虫夏草 C. sinensis 有相 同或相似的化学成分和药理作用,是可供开发的新产品,并可以之作为冬虫夏草的替代品。现代科学论证蛹虫草不仅具有特殊的营 养价值，而且有明显的药用价值。其中尤以虫草素、虫草多糖等多种生物活性物质的药用价值最为显著。虫草素是一种具有抗菌活性 的核苷类物质，对核多聚腺苷酸聚合酶有很强的抑制作用。在 DNA 转录 mR NA 过程中使 mR NA 成熟障碍，抑制癌细胞的生长。并 有降血糖的作用。虫草多糖是一种高度分枝的半乳甘露聚糖，它能促进淋巴细胞转化，提高血清 IgG 的抗体含量和机体的免疫功能， 增强机体自身抗癌抑癌的能力。因此分离纯化虫草素和虫草多糖，对此类抗癌药物的开发具有很大社会价值和意义。本次研究以蛹 虫草粉末为原料，研究了蛹虫草中虫草素和虫草多糖的综合提取工艺技术，探讨了采用超声波水提法、超声波醇提法、水热回流法和 醇热回流法 4 种提取方法，选择虫草素和虫草多糖的最优提取办法。并通过用正交试验方法研究考察了水热回流法中提取温度、提 取次数、提取时间、料液比 4 个因素对虫草素和虫草多糖综合提取效率的影响。建立了从蛹虫草中综合提取虫草素和虫草多糖的最 佳工艺。采用正交试验对蛹虫草中虫草素和虫草多糖综合提取工艺进行了研究，为进一步开发利用提供有价值的参考数据，也将会 对今后产品开发研究具有重要的意义。 ［关键词］蛹虫草 虫草素 虫草多糖 提取工艺 正交试验法
紫外可见光检测器），Ｎ２０００ 色谱工作站 Ｖａｒｉａｎ ２７００ Ｃ１８ 不锈钢柱； Ｅａｓｙｐｕｒ ＲＦ 超纯水器；
真空恒温干燥器：ＰＢ－ＩＡ 型，天津市光学仪器厂技术开发公司； 三用恒温水浴箱：ＨＨ－４ 型，江苏金坛荣华仪器公司； 循环水式多用真空泵：ＳＨＢ－Ｂ９５ 型，郑州长城科工贸有限公司； 分光光度计：ＵＶ－２６５ 型，ＵＶ－７２１ 日本岛津仪器有限公司； 旋转薄膜蒸发器：ＲＥ－５２Ａ 型，上海申科机械研究所； 电子天平：ＢＰ２１１－Ｄ 型，北京赛多利斯仪器有限公司； 超声波清洗器：ＫＱ 一 ６００ 型，巩义市英峪予华仪器厂； 超声萃取器：ＨＳ３１２０ 型，宁波新芝科学仪器研究所； 真空减压提取罐：５０Ｌ－２０００ 型，无锡市雪浪化工设备厂。 ２．１．３ 主要试剂 ９５％乙醇：武汉市江北化学试剂厂； ９９．５％甲醇：杭州化学试剂厂； ９９．５％丙酮：武汉市江北化学试剂厂； 磷酸盐：天津市化学试剂三厂； 浓硫酸：武汉市江北化学试剂厂； 苯酚：武汉市江北化学试剂厂； 无水葡萄糖：天津市科密欧化学试剂开发中心； 虫草素对照品：上海化学试剂公司进口分装； 纯水（用超纯水器制备，电导率 １０－８ Ｍ ） 样品 １：野生蛹虫草子座（抚顺产）； 样品 ２：以大米为培养基质的人工栽培蛹虫草子座； 样品 ３：以蚕蛹为培养基质的人工栽培蛹虫草子座； 样品 ４：长满了蛹虫草菌丝的大米培养基； 样品 ５：深层发酵的蛹虫草菌丝；以上 ５ 种样品均干燥后研成粉末 待测。 以上试剂均为分析纯。 ２．２ 实验方法 ２．２．１ 分析测试方法：用高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）测定虫草素含量［６］ ２．２．１．１ 高效液相色谱条件 色谱柱：Ｃｌ８ 柱（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ）；流动相：磷酸盐缓冲溶液 （ｐＨ６．５）－ 甲醇（８５：１５） 流速 １ｍＬ／ｍｉｎ；紫外检测波长 ２６０ｎｍ，在此条件下， 虫草素保留时间为 １１．３ｍｉｎ。 ２．２．１．２ 标准溶液的配制 用电子天平称取虫草素对照品适量，置于容量瓶中，加 ５０％乙醇水 溶液，超声波振荡溶解，定容，配制成浓度为 ５０．５μｇ／ｍＬ 标准储备液备 用，使用时加 ５０％乙醇稀释液。 ２．２．１．３ 样品处理 蛹虫草样品 ６０℃真空干燥 ２ｈ，粉碎过 ４０ 目筛（０．３６ｍｍ）。准确称取 干燥样品粉末 ０．５ｇ 置具塞锥形瓶中，准确加入甲醇 ３０ｍＬ，称定，超声波 振荡 ３０ｍｉｎ，补足失重，滤过，弃去初滤液，准确吸取续滤液 １ｍＬ，置１０ｍＬ 量瓶中，甲醇定容。 ２．２．１．４ 样品分析 吸取对照品和样品溶液各 １０μＬ 注入高效液相色谱仪，记录色谱
２．２．２．２ 溶液的配制 用电子天平称取 ８０ｇ 重蒸苯酚，置于容量瓶中，加入 ２０ｍＬ 重蒸馏 水，配制成 ８０％苯酚溶液。 ２．２．２．３ 标准曲线的制作 吸取葡萄糖标准液（１００μｇ／ｍＬ）０，０．１，０．２，０．３，０．４，０．６，０．８，１ｍＬ 分 别加入到各试管中。用重蒸馏水补足至每管 ２ｍＬ。使各管葡萄糖含 量分别为 ０，１０，２０，３０，４０，６０，８０，１００μｇ，各管加 ０．０５ｍＬ ８０％苯酚溶 液，再加入浓硫酸 ５ｍＬ（勿沿管壁加入，以便使样品与硫酸快速混匀）， 静置 １０ｍｉｎ，３０℃水浴 １５ｍｉｎ。在 ４９０ｎｍ 波长处测各管的 ＯＤ 值。 糖 浓度为横坐标，各管的 ＯＤ 值为纵坐标作标准曲线，其回归方程为 Ｙ＝０．０６２５Ｘ－０．０６８９ ｒ＝０．９９９０ 线性范闹为：１０μｇ／ｍＬ～６０μｇ／ｍＬ 。 ２．２．２．４ 样品测定 取 ２ｍＬ 稀释的待测样品 （糖浓度控制在 １０μｇ／ｍＬ～６０μｇ／ｍＬ 之 间），加入试剂量和操作方法同制作标准曲线，测其 ＯＤ 值，在标准曲线 上，求得多糖相当的量，再计算出样品含糖量。 ２．３ 单因素确定虫草素最佳提取方法 ２．３．１ 水热回流提取法 取蛹虫草粉末 ２．５ｇ，用 ５０ｍ１ 蒸馏水于 ９５－１００℃热回流提取 ２ｈ，重 复提取 ３ 次，合并滤液，用蒸馏水定容至 ２００ｍｌ。 ２．３．２ 醇热回流提取法 取蛹虫草粉末 ２．５ｇ，用 ５０ｍ１ 的 ５０％乙醇 ８０℃热回流提取 ２ｈ，重复 提取 ３ 次，合并滤液，用 ５０％乙醇定容至 ２００ｍｌ。 ２．３．３ 超声波水提法 取蛹虫草粉末 ２．５ｇ，用 ５０ｍｌ 蒸馏水，超声波提取 ３０ｍｉｎ，重复提取 ３ 次，合并滤液，用蒸馏水定容至 ２００ｍｌ。 ２．３．４ 超声波醇提法 取蛹虫草粉末 ２．５ｇ，用 ５０ｍｌ 的 ５０％乙醇，超声波提取 ３０ｍｉｎ，重复 提取 ３ 次，合并滤液，用 ５０％乙醇定容至 ２００ｍ１。 ２．４ 单因素确定虫草多糖最佳提取方法 ２．４．１ 水热回流提取法 取蛹虫草粉末 １０．０ｇ，用 ｌ０ 倍量蒸馏水 ９５－１００℃热回流提取 ２ｈ，重 复提取 ３ 次，合并滤液，减压浓缩至 １：１（ｗ／ｖ），冷却后加入 ３ 倍量乙醇使 其沉淀，浸出上清液，沉淀再加少量水溶解，加入 ２ 倍量使其沉淀，重复 ３ 次，将最后的沉淀物用蒸馏水溶解，并定容于 ５０ ｍ１ 容量瓶中（用于测 定虫草多糖）。以上乙醇上清液合并，并用水定容至 ２００ｍ１（用于测定虫 草素）。 ２．４．２ 醇热回流提取法 取蛹虫草粉末 １０．０ｇ，用 １００ｍｌ 的 ５０％乙醇 ８０℃热回流提取 ２ｈ，重 复提取 ３ 次，合并滤液，减压浓缩至 １：１（ｗ／ｖ），冷却后加入 ３ 倍量乙醇使 其沉淀，浸出上清液，沉淀再加少量水溶解，加入 ２ 倍量使其沉淀，重复 ３ 次，将最后的沉淀物用蒸馏水溶解，并定容于 ５０ｍ１ 容量瓶中（用于测 定虫草多糖）。以上乙醇上清液合并，并用水定容至 ２００ｍ１（用于测定虫 草素）。 ２．４．３ 超声波水提法 取蛹虫草粉末 １０．０ｇ，用 １００ｍｌ蒸馏水，超声波提取 ３０ｍｉｎ，重复提 取 ３ 次，合并滤液，减压浓缩至 １：１（ｗ／ｖ），冷却后加入 ３ 倍量乙醇使其沉 淀，浸出上清液，沉淀再加少量水溶解，加入 ２ 倍量使其沉淀，重复 ３ 次，将最后的沉淀物用蒸馏水溶解，并定容于 ５０ｍ１ 容量瓶中（用于测定 虫草多糖）。以上乙醇上清液合并，并用水定容至 ２００ｍ１（用于测定虫草 素）。 ２．４．４ 超声波醇提法 取蛹虫草粉末 ｌｇ，用 １００ｍｌ 的 ５Ｏ％乙醇，超声波提取 ３０ｍｉｎ，重复 提取 ３ 次，合并滤液，减压浓缩至 １：１（ｗ／ｖ），冷却后加入 ３ 倍量乙醇使其 沉淀，浸出上清液，沉淀再加少量水溶解，加入 ２ 倍量使其沉淀，重复 ３
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专题论述
图，外标法以峰面积计算样品中虫草素的含量。 ２．２．２ 分析测试方法：用苯酚一硫酸法测虫草多糖含量［７］ ２．２．２．１ 蛹虫草多糖的提取 蛹虫草样品均取研成的粉末 １０ｇ，用水提醇沉法提取，即加 １０ 倍量
的水 １００℃水浴煎煮 １ ｈ，重复 ３ 次。提取液过滤、浓缩至 １：１（ｇ／ｍＬ）加 ３ 倍量的乙醇使其沉淀。倾出上清液，沉淀加水溶解，加稀乙醇使沉淀、离 心，取出上清液，继续加乙醇放置。倾出上清液，沉淀依次用乙醇、无水 乙醇冼涤、过滤、低温干燥，即得多糖粗品。将提取的多糖粗品，置于 ｌ０ｍＬ 量瓶中，加重蒸馏水溶解，并稀释到刻度，摇匀、备用。