基因工程制药.ppt

下游阶段
将实验室成果产业化、商品化，主要包 括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型 生物反应器的研制，高效分离介质及装置的 开发，分离纯化的优化控制，高纯度产品的 制备技术，生物传感器等一系列仪器仪表的 设计和制造，电子计算机的优化控制等。
目的基因的获取途径
问题：来源于真核细胞的产生基因工程药物的目 的基因，为什么不能进行直接分离？ 一、逆转录法
传统制药存在的问题
A、材料来源困难或制造技术问题而无法付诸应用； B、从动物脏器中提取出来，也因造价太高，或因来 源困难而供不应求； C、由于免疫抗原等缘故，使它们在使用上受到限制。
基因工程技术的特点 能够十分方便有效地生产许多以往难以大量 获取的生物活性物质，甚至可以创造出自然界 中不存在的全新物质。
洗脱 rRNA/tRNA
纤维素柱纯化Poly(A)mRNA 流程图
Poly(A)mRNA
反转录人工合成互补DNA
➢ cDNA法选择性地克隆 蛋白编码序列；
➢ cDNA法克隆的目的基 因很“纯净”； cDNA片一般只有2—3kb 或更小。
2、cDNA第一链的合成：一次好的逆转录反 应可使oligo(dT)选出的mRNA有5—30%被 拷贝。 3、cDNA第二链的合成： 4、cDNA cloning：expression vector pUC 5、将重组体导入host celห้องสมุดไป่ตู้ 6、cDNA library identification 7、目的cDNA 克隆的分离和鉴定 （限制酶图谱的绘制、杂交分析、基因定位、 基因测序、确定基因的转录方向、起始点等。）
第三章 基因工程制药
学习要求：
掌握基因工程药物生产的基本过程，掌握真核生 物目的基因分离的原理和基本方法，掌握常用的原 核、真核表达系统的特点以及影响药用目的基因表 达的主要因素，熟悉导致基因工程菌不稳定的原因 及解决方法，掌握基因工程菌的发酵工艺和基因工 程药物分离纯化方法的基本原理及技术。 8学时。
➢ 将目的基因克隆到大肠杆 菌细胞中的操作步骤：
1．获得目的基因和质粒载体；
2．形成重组质粒；
3．制备感受态细胞，用重组质粒 转化大肠杆菌细胞；
4．培养大肠杆菌，让重组质粒及 外源目的基因形成大量拷贝；
5．筛选含重组质粒的大肠杆菌细 胞，进行检查或鉴定。
载体
➢ 载体是运送目的基因片段进入宿主细胞的工具，目 前最常用的载体包括细菌质粒、噬菌体、cosmid 质粒等。
基因工程
重组DNA技术的基本定义
将一种生物体（供体）的基因与载体在体 外进行拼接重组，然后转入另一种生物体 （受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传 并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程 序，也称为分子克隆技术。
供体、受体、载体是重组DNA技术的三 大基本元件。
重组DNA技术的操作过程
基因工程的基本定义
基因工程是指重组DNA技术的产业化 设计与应用，包括上游技术和下游技术 两大组成部分。上游技术指的是基因重 组、克隆和表达的设计与构建技术（即 重组DNA技术）；而下游技术则指基因 工程菌或细胞的大规模培养技术及目的 基因产物的分离纯化技术。
基因工程的基本用途
✓分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信 息资源。 ✓设计、构建生物的新性状甚至新物种。 ✓大规模生产生物活性物质。
化学合成法
前提：较小的蛋白质或多肽的编码基因，必须 知道目的基因的核苷酸排列顺序，或知道目的蛋 白质的氨基酸顺序，再按相应的密码子推导出 DNA的碱基序列。
限制：（1）不能合成太长的基因。 （2）人工合成基因时，遗传密码的简并会
为选择密码子带来很大的困难。 （3）费用高。
以大肠杆菌为宿主菌进行基因的克隆
基因工程药物生产基本过程
获得目的基因 构建重组质粒 构建基因工程菌（或细胞） 培养工程菌
产物分离、纯化 产品加工、检验等
上游阶段
首先获得目的基因，然后用限制性内 切酶和连接酶将其插入适当的载体质粒或 噬菌体中并转入大肠杆菌或其它宿主菌 （细胞），以便大量复制目的基因。
选择基因表达系统主要考虑的是保证 表达功能，其次要考虑的是表达量的多少 和分离纯化的难易。
b.真核细胞mRNA 的特点及分离纯化方法
3’-polyA（20-250AAA）-oligo(dT)
Oligo(dT) 纤维素
Poly(A)--Oligo(dT)
TTTTTT TTTTTT
AAAAA TTTTTT
AAAAA TTTTTT
100mM NaCl
10mM Tris 1mM EDTA
Total RNA
➢ 质粒是细菌细胞中自然存在于染色体外可以自主复 制的一段环状DNA分子。进入到宿主细胞中的一 个质粒可以大量增加其拷贝数。
逆转录法就是分离纯化目的基因的mRNA，再反 转录成cDNA，然后进行cDNA 克隆表达。 1、mRNA purification
a.细胞内RNA的组成和含量：DNA:95%核内，5％
细胞器；RNA：75％细胞质，10%核内，15%细胞 器
rRNA80-85%;tRNA10-15%;mRNA1-5%
基因工程药物的主要种类
1、免疫性蛋白，如各种抗原和单克隆抗体； 2、细胞因子，如各种干扰素、白细胞介素、 集落刺激因子、表皮生长因子、凝血因子； 3、激素，如胰岛素、生长激素、心钠素； 4、酶类，如尿激酶、链激酶、葡激酶、组织 型纤维蛋白溶酶原激活剂、超氧化物歧化酶。
基因工程技术生产药物的优点
1、可大量生产过去难以获得的生理活性蛋白质和多 肽，为临床使用提供有效保障； 2、可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生 理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物 质的应用范围； 3、可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质； 4、内源生理活性物质作为药物使用时存在的不足之 处，可以通过基因工程进行改造和去除; 5、利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物 筛选来源。
重组DNA技术的理论基础
19世纪中 孟德尔 豌豆杂交试验 遗传因子 经典遗传学 20世纪初 摩尔根 果蝇杂交实验 基因 基因学 1944年 艾弗瑞 肺炎双球菌转化实验 遗传物质DNA
分子遗传学 1953年 沃森--克瑞克 DNA双螺旋结构 分子生物学 1973年 伯格--杰克森--考恩--鲍耶 DNA分子体外拼接