重组人干扰素α2b

提要

用活化的PEG根据正交设计在4℃时不同反应时间，不同pH值，PEG与IFN不同摩尔比进行优化，以SDS-PAGE电泳，细胞病变抑制法（WISH-VSV）为基本检测系统作检测，最后选定反应时间为2小时，pH值为9，PEG : IFN 为10：1摩尔比为最佳反应条件，得PEG-IFN占总蛋白的30％。反应终止后得到的混合物用水稀释后，在阳离子交换柱上洗脱掉PEG和反应副产物，得到的PEG-IFN纯度为90%以上，生物活性保留度为7-10%。我们定义PEG修饰的IFN为PegIntron。以10ug/Kg给小鼠肌肉注射，定时取血，处理样品，PegIntron用未修饰的干扰素作对照，作活性检定和药代动力学实验。其半衰期为18hr，IFN的半衰期为4hr，提高了4.5倍。这个结果表明PEG修饰干扰素使其半衰期延长是可行的。

摘要

重组人干扰素α2b（Recombinant Human Interferon，rhIFN-α2b）由165个氨基酸组成的单链多肽，CYS1和CYS98、CYS29和CYS138组成二条二硫键。分子量理论值为19219道尔顿，等电点在pH5—6之间，分子中无糖，比活性达1x108IU/mg 蛋白。IFN是目前临床应用最广泛的细胞因子类药物，其广谱抗病毒作用和相对无害性得到了医患的认可，但其半衰期短、中和抗体高，在临床应用上有一定的局限性，我们的实验主要是选用对IFN化学修饰的方法来克服IFN的这些缺点。

本实验就是利用线性的亲水惰性高分子PEG与IFN上具有较高亲和反应活性的游离亲核基团共价结合反应使PEG与干扰素共价结合，形成一种屏蔽，从而使修饰过的干扰素不被机体当做异源物质识别，抑制相应的免疫反应，降低血浆清除率，延长半衰期，延长药物的暴露时间，减少血浆中药物浓度的波动。PEG的生物相容性已经通过美国食品和药品管理局（FDA）的认证，是对干扰素进行化学修饰的首选原料。本实验选用PEG 用三聚氯氰在苯和石油醚的无水体系下按照一定摩尔比投料进行活化，活化得到的m PEG抽滤干燥备用。活化的m PEG根据

典型的液相反应修饰干扰素，根据干扰素的生物化学特征，我们选择反应温度为4℃，反应终止剂为冰醋酸。用mPEG在不同的反应时间，不同pH值与IFN的不同摩尔比进行反应，优化反应条件，以SDS-PAGE电泳，细胞病变抑制法（WISH-VSV）为基本检测系统做为检测手段，最后选定反应时间为2hr，pH 9，m PEG：IFN为10：1摩尔比为最佳反应条件，修饰后PEG-IFN 为总蛋白的33%（Lowry法测定）。反应终止得到的混合物用水稀释后以CM-Sepharose FF为层析介质，20mmol/L NaAc-Hac （pH4.5）为洗脱液，在4℃条件下，先用洗脱液洗2个柱体积，然后分别用0.05，0.1，0.2，0.4mol/L 的NaCl溶液洗脱，使PEG-IFN与游离的PEG和反应副产物分离，收集洗脱峰，取样做蛋白浓度检测，SDS-PAGE电泳，HPLC做纯度检测。得到的PEG-IFN纯度为90%以上，生物活性保留度为7-10%。按中国药典规定的方法测定游离PEG残留量，符合生物活体实验的要求。

我们定义PEG修饰的干扰素为PegIntron。取PegIntron干燥品用生理盐水稀释，以10万IU/Kg对小鼠进行肌肉注射，注射后每隔10，20，30，40，50，60，70hr从尾静脉采集血样，5000rmp 离心15min，收集上清液，采用WISH-VSV系统的细胞病毒抑

制法测定血清内的IFN效价，以时间为横坐标，IFN效价为纵坐标，做药代动力学曲线，得出PegIntron的半衰期为18hr，而未修饰的IFN的半衰期为4hr，PegIntron的半衰期延长了4.5倍。

rhIFNα2b相对分子量为19000，属小分子量蛋白，易经过肾小球滤过，并易被血液中的胰蛋白酶等降解，在相对分量为15，000-70，000的范围内，肾脏清除小分子蛋白质的速率与蛋白质的相对分子质量呈负相关，其相对分子质量提高，不易被肾小球滤过。蛋白质经PEG修饰后，形成一种屏蔽，使它作为异源物质不被识别，不易产生相应抗体，抑制了相应的免疫反应，因而通过免疫反应被清除率亦很低，同时由于这种屏蔽作用使蛋白质不易被蛋白酶降低，而且PEG无毒性，是FDA批准的可用于人体的聚合物，在体内不会进行生物降解产生有毒衍生物，相对分子质量小的PEG可由肾脏直接排出。

由我们的实验结果可以看出，用PEG修饰IFN使其半衰期延长是可行的，也为PegIntron作为药物研究提供了理论基础。

Abstract

Recombinant Human Interferon α2b (rhIFNα2b) is a most widely used kind of cytokine clinically, it was a copy of a protein found naturally in low levels in the human body, it was permitted in clinical application by U.S.A. FDA on Feb. 25,1991 and has raised approval since then. However rhIFNα2b has a relatively short half life and it will raise antibodies when injected in viro. rhIFNα2b has a total of 165 amino acids, CYS1 and CYS98、CYS29 and CYS138 formed two disulfide bond, its molecular weight is 19219, pI is between 5-6，specific activity is 2x108IU/mg protein.

Our research is about chemically modified rhIFNα2b with linear PEG. PEG will be linked to rhIFNα2b, there will be a perfect protective screen after modification, thus PEG modified rhIFNα2b would not be recognized as antigen in viro and inhibit the coming immune reaction, lighten its decrease rate in blood plasma, prolong its half life, increase its exposing time and decrease its unsteady waves in blood plasma.

We chose PEG as the raw material to modify rhIFNα2b

because that PEG was admitted to be used on human beings by the FDA. We use CN3Cl3 to activize PEG in the waterless system of benzene and skellysolve with certain proporation. The activized PEG was called mPEG. mPEG was to modify rhIFNα2b in the novel liquid reaction environment. We chose 4℃acetic acid glacial according to the biological feature of rhIFNα2b, and used acetic acid glacial as the stop signal of the reaction. We chose different reaction duration, different pH and different proportion of mPEG to rhIFNα2b to make the reaction standard, used SDS-PAGE, WISH-VSV as the basical examing m ethods. We selected 2 hours, pH 10, mPEG vs rhIFNα2b 10:1(molar ratio), as the best condition, and got PEG-IFN as 33 percent of the total protein( with Lowry method). Diluted the mixture with water after the reaction was stopped by acetic acid glacial, used CM-Sepharose FF chromatography medium, pH4.5, 20 mmol/L NaCl as eluent, 4℃, washed the column 2 volume of NaCl and then changed to 0.05, 0.1, 0.2, 0.4 mmol/LNaCl as eluent to separate PEG-IFN from the mixture, gathered the eluent cusp, examined protein density with SDS-PAGE and used HPLC to detect the purity, got PEG-IFN with

the purity above 90 percent, biological activity 7-10%. We detected remained PEG and found that it was suitable to use PEG-IFN on animal models.

We named PEG modified rhIFN PegIntron. Diluted PegIntron to the concetration of 100,000IU/ml and injected it to mice with 100,000IU/Kg. Collected blood from their tails at 10,20,30,40,50,60,70 hours after injection, 5000 rpm centrifuged for 15 minutes, got the clear serum on the top and examined the biological valence in the serum with WISH-VSV method. Took time as x axle valence of rhIFN as y axle, and made pharmacological kinetics curve. We got that the half life of PegIntron was 18 hours, but the half life of unmodified rhIFN was only 4 hours, which was only 1/4.5of PegIntron.

Moleular weight of rhIFNα2b is 19,000 which is a rather small molecular in viro and could pass renal corpuscle with ease and was easily degenerate by the protcineses in blood. However, when from the molecular weight 15,000 to 70,000, protein would show a negative relation to the degeneration of renal corpusal. We used linear PEG to modify the unessential agents of rhIFN to provent it

from the degeneration. After rhIFN was chemically modified, it would not be recognized as an antigen and would prolong its half life. PEG is intoxic to human beings and was admitted to be used on human beings by the FDA, it would degenerate and release toxic compounds in viro. PEG, which has a relatively small molecular weight, could be degenerated by renal corpusal.

We could get the conclusion that i t was feasible to chemically modify rhIFN with PEG to prolong its half life and we could provide the experimental data for futhur research of PegIntron .

前言

一、　干扰素简介

1、干扰素概述

自1957年Isaacs和Lindenman发现干扰素以来，人们对干扰素的研究一直具有浓厚的兴趣，研究发现干扰素除具有广谱抗病毒、抗肿瘤作用外，还具有一系列的细胞免疫调节功能。经临床学家研究证明，干扰素在人体内具有明显的生物活性，对病毒和肿瘤的防治有实用价值，它也是一种类似多肽激素的细胞功能的调节物质。

干扰素系统极为复杂，干扰素的结构基因与调节基因广泛地存在于脊椎动物以上的细胞内，在一般生理状态下，细胞的干扰素基因呈静止状态；只是在特定诱生剂的作用下，细胞的干扰素基因才活化转录合成相应的mRNA，这种mRNA可用人工的方法提取出来，在异种蛋白合成系统中转译出具有细胞种属特异性的干扰素蛋白[1]。

2、干扰素基本原理

1980年国际干扰素命名委员会正式定名：Interferon简写IFN 并给干扰素下了如下定义：干扰素是一类在同种细胞上具有广谱

抗病毒活性的蛋白质，其活性的发挥又受细胞基因组的调节和控制，涉及RNA和蛋白质的合成。

目前认为，干扰素是的一种类似多肽激素的细胞功能的调节物质，是一种细胞素，这一定义的含义如下[2]：

（一）干扰素必须是一种蛋白质，它对蛋白酶类是敏感的，而对DNA酶或RNA酶却有抵抗。天然干扰素是一种糖蛋白，采用DNA重组技术由大肠杆菌表达的人的干扰素多肽不带糖分子。

（二）这种蛋白质的结构基因与调节基因广泛地存在与脊椎动物以上的细胞内。在一般生理状态下，细胞的干扰素基因呈静止状态，只有在特定诱生剂的作用下，细胞的干扰素基因才活动转录合成相应是mRNA，进而转译出具有种属特异性的干扰素蛋白。

（三）干扰素本身并不能直接灭活病毒，干扰素作用与细胞后，使后者又产生多种其他蛋白质（抗病毒蛋白）从而阻断病毒的繁殖。

（四）干扰素必须具有广谱的抗病毒活性。如果某一种抗病毒物质仅对特定的病毒有作用就不能称为干扰素。

3、干扰素的种类与命名

干扰素在生物界的分布是很广的，不仅人和高等动物的有关细胞产生干扰素，而且许多低等动物、昆虫及植物和细菌也能产生干扰素，因此概括起来可以分为人干扰素、动物干扰素、昆虫干扰素、植物干扰素和细菌干扰素五大类[3]。国际上对干扰素提出了一种新的命名法，根据抗原特异性和分子结构的不同分为αβγ三型，在命名法中还规定：⑴若今后继续发现新干扰素，则可在IFN右侧标以δε等即可；⑵若要表示IFN的来源，则可在IFN左侧标以宿主的种或属的缩写或全名即可，HuIFN（人干扰素）、MuIFN（鼠干扰素）、BovIFN（牛干扰素）；⑶若要区别不同细胞产生的同一型干扰素，则可在该型干扰素缩写名称的右侧括弧内标以细胞名的缩写即可，如HuIFN-α（Le）=α-人白细胞干扰素、HuIFN-α（Ly）=α-人类淋巴细胞干扰素；⑷若在今后发现某些类型的干扰素在其蛋白质多肽上的氨基酸排列顺序有差异，则还可再分亚型，如HuIFN-α1、HuIFN-β2；

⑸若要表示分子量的不同，则可将分子量标在其缩写名右侧括弧内，如HuIFN-α（18KD），HuIFN-β（38KD）等。

近年来随着基因工程技术的发展，基因工程干扰素研制成功，为了区分基因工程干扰素和自然干扰素，则分别以rIFN和nIFN表示。

４、干扰素的基本特性及其作用特点　

干扰素的基本特性，目前所知道的主要有以下几点[4]：

（一）种属特异性：即所有的干扰素，一般地说来都有严格的种属特异性，所谓“种属特异性”即指某一种属的细胞所产生的干扰素，只能作用相同种属的其它细胞，使其获得“免疫力”。

（二）作用“广谱性和选择性”：广谱性即指干扰素作用与机体有关组织细胞后，可使其获得抗多种病毒和其它微生物的能力。选择性即指干扰素仅作用与异常细胞，对正常细胞的作用很小。

（三）相对无害性：干扰素已广泛应用与临床，但到目前为止还未发现它对人体有什么严重的副作用，在临床应用干扰素治疗时即使有时会出现些不良反应，但一经停药后，即可迅速恢复正常，均属可逆反应。

（四）特殊稳定性：α、β干扰素一般60℃1小时不被灭活，γ干扰素可被56℃灭活，纯品可在低温下（-20℃）以下长期保存，若加入适量的人血白蛋白等稳定剂，则效果更好。α、β干扰素对pH2相当稳定，γ干扰素对pH2不稳定。

5、干扰素的生物活性

（一）　抑制病毒繁殖活性

干扰素具有广谱抗病毒活性，它在同种细胞或机体内，对多种病毒包括DNA病毒、RNA病毒、引起肿瘤的病毒或不引起肿瘤的病毒都有一定程度的抑制作用，但是抑制程度却因病毒种类而千差万别，甚至同一病毒的不同血清型对干扰素的敏感性差别也很大。干扰素的抗病毒作用，并不是靠干扰素本身去直接“中和”或“抑杀”病毒的，而是间接地通过细胞产生“抗病毒蛋白”发挥作用的，干扰素的抗病毒活性有相对的种属特异性[5]。

干扰素的抗病毒作用表现在病毒繁殖量的减少，以及由此引起的细胞损伤的减少。干扰素可以阻断病毒颗粒的复制，减少病毒量，使显形感染变成不显形感染，对一般病毒感染可以促进机体恢复，缩短病程。

（二）　抑制细胞分裂活性

干扰素在试管内和机体内对细胞生长有抑制作用，产生这一作用的干扰素量要比抑制水泡性口炎病毒（VSV）繁殖量大30倍，对细胞生长快得远比生长慢的抑制作用要强。干扰素对迅速分裂的肿瘤细胞有选择的抑制作用，这对防治肿瘤有一定意义。干扰素的抑制细胞分裂活性也有相对的种属特异性。

干扰素抗肿瘤作用的机制并不是单一的，是综合性的[6]。据目前所知，除干扰素直接抑制肿瘤细胞的生长外，还有抑制肿瘤

病毒的繁殖和调动机体免疫系统杀伤肿瘤细胞，促进巨噬细胞的功能，引起肿瘤细胞迅速被破坏与减少的功能。干扰素可以抑制抗体反应，从而可能降低肿瘤保护抗体的水平，使免疫系统更有效的作用于肿瘤。干扰素可以改变肿瘤细胞的细胞膜，以增加肿瘤特异性组织相容性抗原的表达，以利于杀伤清除肿瘤细胞。干扰素可增进NK细胞活力，这一点可能是干扰素抗肿瘤作用的最为重要的一个原因。

（三）免疫调节活性

1．免疫系统细胞产生干扰素，免疫系统细胞产生干扰素的主要类型是γ以及小量的酸不稳定性α，也有少量的α或β。详见表。

免疫系统细胞所产生的干扰素　

在试管内的刺激物产生干扰素的细胞类型产生干扰素类型

有丝分裂素各种T细胞（右或无巨噬细胞辅助）γ，α以及小量的酸　

单核细胞，B细胞，无效细胞不稳定性α　

　阳性细胞，B细胞γ，酸不稳定免疫个体的抗原刺激 ＯＫＴ

４

性α　

肿瘤细胞 非Ｔ，非Ｂ，ＬＧＬ（大颗粒淋巴细胞） α，γ　

自发 ＬＧＬ，ＯＫＴ

阳性Ｔ细胞 γ，酸不稳定性α　

４

干扰素对效应细胞的影响

（1）　增强组织相容抗原和某些受体的表达：一定浓度的干扰素可增强淋巴细胞表面组织相容抗原、β-2微球蛋白及LgG、Fc

受体的表达，从而调节许多免疫反应，包括免疫复合物的清除，吞噬作用和依赖抗体的细胞毒作用。干扰素对巨噬细胞的功能有增进作用，并可调节T、B细胞功能。

（2）　干扰素可增加NK细胞的活性，α、β、γ干扰素均能刺激NK细胞对肿瘤细胞系和新分离的肿瘤细胞的细胞毒，而有效的保护正常细胞免受NK细胞的杀伤。干扰素增加NK细胞活性包括两个方面，一是激活NK细胞前体，二是增加细胞膜通透性。（3）　干扰素与其它细胞因子关系也相当密切。周血单核细胞在有丝分裂素刺激下，不仅可以诱生γ干扰素，同时产生其他细胞因子，如白细胞介素-2（IL-2）、淋巴毒素（L T）等。目前所知，IL-2参与INF-γ产生的调节机制，而INF对激活的T细胞产生IL-2也是必须的。部分纯化的INF-γ可以增加IL-2受体，而T 细胞的增殖是依赖于IL-2受体的表达和密度的。IL-2可以增加有丝分裂素刺激淋巴细胞诱生INF-γ, 这说明 INF-γ与IL-2在功能上是紧密联系的。

6、干扰素的诱生与工作原理

（一）　干扰素的诱生原理

能诱导有关生物细胞产生干扰素的一类物质统称“干扰素诱生剂”。干扰素诱生剂的种类很多，概括起来可分为“病毒

性干扰素诱生剂”和“非病毒性干扰素诱生剂”两大类。诱生α干扰素的诱生剂以病毒为主，诱生β干扰素的诱生剂主要是病毒和PolyI:C，诱生γ干扰素的诱生剂主要是抗原和有丝分裂素。

干扰素诱生剂作用于细胞膜后，使细胞内产生一种特异性因子，它可能与结合在干扰素操纵基因上的蛋白抑制物相结合，从而使干扰素操纵基因去抑制而开始转录合成干扰素mRNA，再转移到胞浆核糖体转译成干扰素前体，然后借助于分泌多肽的功能将干扰素前体搬运到细胞膜，信号多肽分别切割，成熟干扰素分泌到细胞外。

干扰素诱生剂　

　

　

抑制蛋白基因 产生灭活抑制蛋白的特殊因子　

　

　

转录合成干扰素ｍＲＮＡ　

干扰素ｍＲＮＡ转移到胞浆核糖体　

　

　

干扰素前体借助于分泌多肽转移到细胞膜　

　

分泌多肽被切割　

　

成熟干扰素分泌到细胞外　在细胞诱生干扰素的过程中还有一种特殊现象，叫做超诱导，所谓超诱导是指细胞在某种大分子合成抑制物的适当作用下，诱生蛋白合成的增加现象。干扰素超诱导不仅有理论上的重要性，而且有实用上的重要性，采用这一技术可以使人β干扰素的产量提高10-1000倍，目前已常规性地应用于β干扰素的大量生产上。迄今干扰素的超诱导现象只发生在用PolyI:C作为诱生剂的成纤维细胞培养中，在用病毒作为诱生剂的白细胞培养、类淋巴细胞培养中均没有观察到。

（二）　干扰素作用原理　

干扰素作用在细胞膜上的受体系统，细胞内抗病毒蛋白基因去抑制而被激活，合成抗病毒蛋白mRNA，转移到胞浆核糖体，再转译成几种抗病毒蛋白，从而阻断病毒的繁殖。其作用机理如下[4]：

1．2′-5′A合成酶的作用机理，这种酶可导致病毒mRNA 的降解。

（1）　首先，由双股核糖核酸（dsRNA）将其非活化状态激活成

为活化状态。

（2）　2′-5′A合成酶被激活后，可催化ATP聚合成2′-5′A。（3）　这种2′-5′A可作为一种激活剂将细胞内的隐性“核酸酶F”激活。

（4）　这种核酸酶对病毒mRNA有专一性，它可在病毒mRNA 分子上切开1-2个切口，使其发生降解。

2．蛋白激酶的作用机理，这种蛋白激酶能导致抑制病毒蛋白质的合成。

（1）　首先由双股核糖核酸和ATP将未活化的蛋白激酶激活成为活化的蛋白激酶。

（2）　这种活化的蛋白激酶再将磷酸基通过ATP加到一种病毒蛋白合成所必需的“启动因子2”（Elf-2）上，使其

发生磷酸化。

（3）　启动因子2一旦发生磷酸化后即失去活性，而不能参与病毒蛋白的合成，这样，病毒蛋白的合成就受到抑制，

于是，就表现出了干扰素所导致的抗病毒作用。3．磷酸二酯酶的作用机理，这种磷酸二酯酶（2′-PDi）主要有二种作用，其一是它能降解2′-5′A，但同时可以去除tRNA的pCpCpA末端，从而抑制翻译。

干扰素作用原理见图　

　

同种干扰素　

　

靶细胞膜　

（受体识别） ……　种属特异性　

　

“抗病毒蛋白”基因去抑制　

　

“抗病毒蛋白”基因激活　

　

　

　

　

　

２′－５′Ａ合成酶 蛋白激酶 磷酸二酯酶　

２′－５′Ａ ｄｓＲＮＡ ｅＩＦ－２磷酸酶 去除ｔＲＮＡ的ｐＣｐＣｐＡ末端　

　

激活核酸酶Ｆ 多肽链起始受阻 抑制翻译　

　

ｍＲＮＡ降解　

7、干扰素基因工程产业化

干扰素对多种病毒有疗效。经过十多年的临床应用研究表明，干扰素活性的发挥受微细胞基因组的调控，与机体内许多RNA及蛋白质的合成有关。1986年，美国食品药品管理委员会（FDA）首先批准α2a和α2b干扰素投放市场，基因工程α，

β干扰素也相继于1990年，1993年获准投放市场,目前已有57个国家批准干扰素上市，治疗约30多种疾病，国内研制开发的人工α1b星，α2a型基因工程干扰素已经投放市场，其中人工α1b型基因工程干扰素我国首创。

本试验使用的干扰素是重组人干扰素α2b（Recombinant Human Interferon，rhIFN-α2b）由165个氨基酸组成的单链多肽，CYS1和CYS98、CYS29和CYS138组成二条二硫键。分子量理论值为19219道尔顿，等电点在pH5—6之间，分子中无糖，比活性达1ｘ108IU/mg蛋白。其分子内共有10个Lys，分别在31、

49、70、83、112、121、131、133、134、164位[7]。

二、　学修饰剂种类及修饰后蛋白特性改变

1、对修饰剂的要求一般情况下，要求修饰剂具有较大相对分子质量，良好的生物质相容性和水溶性，分子表面有较多的反应活性基因及修饰后蛋白的半衰期延长。

2、常用的化学修饰

①糖及糖的衍生物：主要有右旋糖酐、旋糖酐硫酸酯、糖肽、葡聚糖凝胶、聚乳糖等。

②高分子多聚物：主要是聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）、聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）、聚N —乙烯吡咯