温度和氨氮浓度对水体N2O释放的影响

中国环境科学 2019,39(1)：330~335 China Environmental Science 温度和氨氮浓度对水体N2O释放的影响
路俊玲,陈慧萍,肖琳*(南京大学环境学院,污染控制与资源化国家重点实验室,江苏南京 210023)
摘要：氧化亚氮的释放已经成为了一个全球性的环境问题,水体中N2O的释放量会随着氮含量的增加而增加.本文通过微宇宙系统的构建,分析氮的转化过程和氮转化基因的变化,并结合结构方程模型分析了温度、氨氮含量对水体N2O释放的贡献.研究结果发现氨氧化古菌和反硝化细菌丰度均与N2O 释放呈正相关,表明水体中的硝化和反硝化作用都会造成N2O的释放.氨氮浓度的升高并不直接促进N2O的释放,而温度和通过硝化作用产生的硝态氮对N2O的释放有促进作用.此外,硝化速率通过促进亚硝态氮和反硝化菌的丰度而间接地促进N2O的释放.
关键词：氧化亚氮；温度；硝化；反硝化；结构方程模型
中图分类号：X524 文献标识码：A 文章编号：1000-6923(2019)01-0330-06
Coupling effect of temperature and ammonia on N2O emission in surface water. LU Jun-ling, CHEN Hui-ping, XIAO Lin*(State Key Laboratory of Pollution Control and Resource Reuse, School of the Environment, Nanjing University, Nanjing 210023, China). China Environmental Science, 2019,39(1)：330~335
Abstract：The increase of nitrous oxide emission has become a worldwide problem. The emission of nitrous oxide from water body increased with the increase of N inputs. Our stud y analyzed the roles of temperature and ammonia in N2O emission through quantification of nitrogen transformation and related functional genes. The results showed that the abundance of ammonia oxidizing archaea and denitrifiers positively correlated to N2O emission in water. Structural equation model revealed ammonia content had no d irect effect on N2O emission, however, high temperature and nitrification d irectly accelerated the release of N2O. In ad d ition, nitrification process also increased the release of N2O indirectly through promoting abundance of denitrifiers and nitrite content.
Key words：nitrous oxide；temperature；nitrification；denitrification；structural equation mode
化肥的大量使用和污水的无序排放,造成大量的氮素进入水体,不仅加剧了水体富营养化,也成为N2O的重要释放源[1-3]. N2O作为重要的温室气体[4],其温室效应是CO2的298倍,并且能造成臭氧层的破坏,引起臭氧层空洞[5-7].已经有研究证实在氮含量高的河道[8]、湖泊等水体都有较高的N2O释放[9].
在缺氧和厌氧条件下,N2O的产生主要由反硝化过程驱动,而近年来研究发现氨氧化细菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA)也能产生N2O[10-11]. AOB和AOA主要通过3种途径产生N2O:一是通过氨单加氧酶在氧化氨的过程中N2O作为副产物产生[12];二是AOB可以通过羟胺脱氢酶直接将氨氧化过程中产生的羟胺(NH2OH)氧化为N2O[13];此外,AOB含有nirK基因,还能够在缺氧条件下通过硝化菌的反硝化作用将NO2-还原为NO和N2O[14-15].虽然目前已有大量研究表明在土壤中硝化反应对N2O的释放发挥重要的作用[16-19],但关于水体中硝化作用对N2O释放的贡献还不清楚.
富营养化湖泊中硝化反应速率受到氨氮浓度和温度的影响,过高的游离氨浓度会抑制亚硝酸氧化细菌活性,导致N2O的积累[20].而温度对硝化和反硝化作用均有重要影响[21],并且AOA和AOB对温度的响应各有不同[22].如温度的升高可以直接促进氨氧化菌的增殖和潜在硝化能力[23],而冬季低温条件下氨氧化菌因为有较多的氧供给及较少的竞争作用比夏季的丰度更高[24].温度和氨氮如何通过影响硝化、反硝化过程,从而影响N2O的产生,目前尚不清晰.
本文通过构建微宇宙系统,研究氨氮浓度和温度对水体中氮的转化、N2O释放过程的影响;通过构建结构方程模型,区分硝化、反硝化过程对N2O释放的贡献及其对环境因子的响应.这对更全面地认识和指导富营养化水体修复措施的实施,减少温室气体N2O的排放具有重要意义.
1材料与方法
1.1试验设计
收稿日期：2018-06-19
基金项目：国家水体污染控制与治理科技重大专项(2017ZX07204002) * 责任作者, 教授, xiaolin@
1期
路俊玲等：温度和氨氮浓度对水体N 2O 释放的影响 331
微宇宙试验,通过在实验室模拟不同的生态系统进行研究,既能够保持生态系统的复杂性,又使结果具有可重复性,在生态学研究中被广泛应用[25].本次研究于2017年6月在太湖(30°58′14.37′′N, 120°8′16.40′′E)采集水样,冰袋低温保存立即运回实验室.取3L 水样置于5L 的加塞广口玻璃缸中,构建微宇宙系统[26].微宇宙系统设2个氨氮浓度,分别为不添加和添加NH 4Cl 至氨氮终浓度为30mg/L.分别于5,15及25℃下黑暗静置培养,防止藻类的生长.在试验开始的第1,3,5,10,15,20和25d 定期采集水样,用于理化性质和定量PCR 分析.每组试验3个平行. 1.2 水样理化性质分析
总氮(TN),氨氮(NH 4+),硝态氮(NO 3-
)和亚硝态
氮(NO 2-
)、总有机碳(TOC)测定均采用文献中的方法[27].
NH 4+净转化速率(NATR)和NO 3-
净转化速率
(NNR)的计算分别采用公式(1)和公式(2)进行:
NATR=n x n c c x +− (1) NNR=n n x c c x
+− (2) 式中:C n+x 为(n+x) d 的NH 4+或NO 3-浓度(mg/L),C n 为第(n ) d 的NH 4+或NO 3-
浓度(mg/L),x 为天数(d).
1.3 N 2O 的采集和测定
每次采样时用注射器采集5mL 顶空气体,转移到3mL 的密闭玻璃瓶中用于分析N 2O 的产生量.N 2O 的浓度采用Agliet7890B 气相色谱仪测定,检测器为电子捕获器(ECD).检测条件为:柱温55℃、后检测器(ECD)温度300℃,载气为高纯氮气,流速为
30mL/min,燃气为氢气,流速为45mL/min [28]. 1.4 DNA 的提取和实时荧光定量PCR(qPCR)
DNA 的提取和qPCR 参照文献的方法进行[29]. qPCR 采用20μL 反应体系进行:10µL SYBR ® Premix Ex Taq™(Takara), 100nM 引物, 1.5µL 模板DNA.细菌和古菌的amoA 基因分别采用amoA1F/amoA2R, Arch–amoAF/Arch–amoAR 引物进行扩增,反应条件为:94℃ 2min;94℃ 20s,57℃ 30s (AOB) 或55℃ 30s (AOA),40个循环.反硝化基因nirS 的扩增采用引物cd3af/r3cd,反应条件为:94℃ 2min;94℃ 30s, 57℃ 45s,72℃ 45s,40个循环.
1.5 统计分析和结构方程模型分析
水体理化指标和qPCR 数据进行One–Way ANOV A 分析,平均数的比较采用Fisher’s L SD 检测.生物和环境因子间的关系进行Pearson 相关性分析,并
通过结构方程模型分析环境因子对氮转化过程、相关
功能微生物和N 2O 释放的直接和间接影响[30].以上统计分析均在IBM SPSS 22.0(SPSS Inc.,美国)中进行. 2 结果与分析 2.1 不同氨氮浓度和温度条件下氮转化及N 2O 的释放
在无外源氮添加的情况下,体系中的氨氮主要来源于有机氮降解,在3个温度下氨氮浓度都很低.不同温度下对照组氨氮的净转化速率在0.06~ 0.11mg NH 4+-N/(L ⋅d)范围内波动,组间没有显著性差异(图1,2),表明在低氨氮情况下,温度对氨氮的转化没有显著性影响
.
图1 NH 4+
-N(a), TN(b), NO 3-
-N(c)在不同氨氮浓度和温度条件下的变化
Fig.1 The profiles of NH 4+-N(a), TN(b), NO 3--N(c) under different ammonia concentration and temperature
332 中 国 环 境 科 学 39卷
速率[m g N O 3
-
-N /(L ⋅d )]
图2 氨氮净转化速率(NATR) (a)和硝态氮净转化速率(NNR) (b) Fig.2 The net transformation rate of NH 4+-N(a) and NO 3--N(b)
在低氨氮情况下,在5℃时,最终有2.72mg/L 的硝态氮产生,其净产生速率与氨氮的转化速率基本相同(0.1mg NO 3-
-N/(L ⋅d),说明硝化作用在氮的转化中占据优势.在15℃和25℃时,分别只有7%和3%的氮氮减少量被转化为硝态氮,同时硝态氮的净产生速率也只占氨氮转化的18%和15%(图2),表明温度的升高促进了反硝化作用的进行并使体系中总氮降低.
图3 不同氨氮浓度和温度下N 2O 的产生 Fig.3 Production of N 2O under different ammonia
concentration and temperature
在有高氨氮添加时,氨氮浓度在所有处理组中都持续下降,表明即使在低温下氨氮也能够被快速转化(图1).同时,氨氮的转化速率在25℃时达到最高,表明高氨氮情况下氨氮的转化速率与温度呈正相关.在15℃时,NO 3-
的产生速率约为氨氮转化速率的
60%,在25d 时,超过90%的氨氮被转化为硝态氮,表明此时硝化作用仍占主要作用.在25℃时,体系中氨氮浓度的减少(28.86mg/L)与总氮的减少(20.30mg/L)和硝态氮的生成量(8.45mg/L)之和呈化学剂量平衡,说明耦合了硝化作用的反硝化过程在氮的转化过程中占主要作用.
N 2O 的产生在培养开始时即可以在所有体系中检测到.N 2O 的产生量在未添加氨氮的体系中较低.在添加了高浓度氨氮的体系中,5℃条件下N 2O 的产生量也显著低于15和25℃的处理.在15和25℃条件下,从第5d 起N 2O 的产生量即明显高于对照,其中25℃时N 2O 的产生速率和产生量显著高于15℃. 2.2 氨氧化(amoA )和亚硝酸盐还原酶(nirS )基因丰度的动态变化
如图4所示,在全部微宇宙体系中,氨氧化菌的amoA 和反硝化菌的nirS 基因丰度都随着时间而增加.AOA 的amoA 基因丰度大约比AOB 的amoA 基因高一个数量级(图4),表明AOA 是水体中主要的
氨氧化菌.相比于对照,在5和25℃时AOA 的amoA 基因拷贝数随着氮的添加而降低,在15℃时添加铵盐促进了AOA 的生长.
与氨氧化菌相比,低温对反硝化菌增殖的抑制作用更为显著.在5和15℃条件下,25d 时,未添加氨氮的对照组中nirS 的拷贝数仅较起始拷贝数增加了20%和30%.但在25℃条件下,添加氨氮的处理组中nirS 的拷贝数则迅速增加,表明此时反硝化菌具有较高的代谢活性.
1期
路俊玲等：温度和氨氮浓度对水体N 2O 释放的影响 333
图4 amoA 基因(a 、b)及nirS (c)基因丰度变化 Fig.4 Variance of amoA and nirS gene abundance
2.3 温度、氨氮浓度对氮转化过程及N 2O 释放的影响
通过person 相关性分析发现,N 2O 的释放与温
度、NO 2-和NO 3-
浓度、PNR 以及AOA -amoA 、AOB -amoA 和nirS (表1)呈显著正相关.但氨氮和总氮浓度都与N 2O 的释放无显著相关.
表1 生物和环境因子与N2O 释放的相关性分析
Table 1 Correlation analysis of biotic and abiotic factor with N 2O emission
因子 温度 NH 4+-N TN NO 3--N NO 2--N N 2O AOA AOB nirS PNR 温度 1
NH 4+-N -0.1 1 TN -0.1 0.9** 1 NO 3--N 0.3 -0.1 0.2 1 NO 2--N 0.4* 0.1 0.3 0.7** 1
N 2O 0.3*
-0.1 0.2 0.9**
0.6**
1
AOA 0.2 -0.2 0.1 0.7** 0.2 0.8** 1
AOB 0.2 -0.2 0.0 0.5**
0.1 0.6**
0.8**
1
nirS
0.4* -0.1 0.2 0.8** 0.4* 0.9** 0.8** 0.7** 1
PNR 0 -0.2 0.0 0.6** 0.3 0.5** 0.7** 0.7** 0.5** 1
图5 影响N 2O 产生因子的SEM 分析 Fig.5 SEM analysis of N 2O production
图中所标均具有显著性作用,实线代表正向促进作用,虚线代表抑制作用.
线的粗细代表作用强度的大小
进一步通过SEM 分析了温度和氨氮浓度对氮转化过程、N 2O 释放的直接和间接影响,所构建的结构方程模型能够解释90%的N 2O 释放的影响(r 2=0.90).SEM 结果表明NO 3-
(λ=0.767, P <0.001)和
温度(λ=0.136, P <0.05)显著提高N 2O 的释放,但NH 4+对N 2O 的释放没有直接作用(图5).NH 4+显著促进nirS (λ=0.251, P <0.05)和NO 2-
(λ=0.277, P <0.01)的量,而nirS (λ=0.493, P <0.001)和NO 2-(λ=0.433, P <0.001)与NO 3-呈显著正相关.此外,AOA 对nirS (λ=0.651, P <0.001)和PNR(λ=0.748, P <0.001)有强烈的促进作用.
3 讨论
氮的生物可利用性及温度是影响氮转化的两
334 中国环境科学 39卷
大重要因素.结构方程模型分析的结果表明,温度的升高能直接促进N2O的释放,而高氨氮主要是通过加快硝化速率,缩短硝化反应时间,从而加速N2O的释放.高氨氮体系中,N2O的释放在体系中很快开始,并且即使在以硝化作用为主的体系中,N2O依然能够大量产生,这表明在水体中硝化作用可以是产生N2O的主要途径.在未添加氨氮的处理组中也检测到了N2O的释放,说明有机氮经矿化作用后所产生的NH4+也能通过硝化作用增加N2O的释放.在25℃和高氨氮情况下,20d以后体系中的氮以硝态氮形式存在,并且氮转化过程以反硝化作用为主,表明反硝化作用也在N2O的产生中发挥重要作用.温度影响着氮转化细菌的生长以及酶的活性,同时也会影响N2O从水体中释放的传质阻力,这些因素造成了在低温(5℃)条件下N2O的产生量较低.在本研究的微宇宙试验中,反硝化过程并不占优势.在低温条件下,nirS的丰度也增长缓慢,表明低温抑制了反硝化细菌的活性和生长.但与前人报道[24]类似,5℃的低温并未对AOA和AOB的增长造成显著性抑制.N2O 的释放与NO2-和NO3-浓度呈现显著的正相关关系,这也表明在NO2-和NO3-生成的过程中伴随着N2O 的释放[16].但随着氨氧化的进行,体系中的DO逐渐被消耗造成缺氧或厌氧环境,这时反硝化作用的发生也将导致大量N2O的释放.
沉积物中通过反硝化作用产生N2O已经引起了重视[2].相比于沉积物而言,湖泊、河流等水体中上覆水的体量更大,直接接受外源的氮输入,并且在N2O的释放过程中受到的传质阻力更小而更容易释放.本文的研究结果表明,除了反硝化作用,水体中的硝化作用也会产生N2O,并且随着温度和氨氮浓度的升高,N2O的释放量也随之增加.温度的升高可以直接促进N2O的释放.氨氮浓度的升高虽然并不直接作用于N2O的释放,但其一方面可以通过促进硝化作用的进行而增加N2O的释放;同时,硝化作用所产生的NO2-和NO3-又可以通过耦合反硝化过程间接促进N2O的产生.结构方程模型分析结果表明,温度和氨氮浓度的升高均能促进N2O的释放,并且进一步区分了硝化、反硝化在N2O释放过程中的贡献,这使得我们对温度及不同形态的氮素对N2O释放风险的影响有了更全面的认识.因此,富营养化水体治理过程中,不仅要控制以硝酸盐为主的反硝化过程,更要加强对氨氮等其它各种形式氮素的控制,这对于有效降低N2O的产生,减少温室气体的排放具有重要意义.
4结论
4.1水体中硝化、反硝化作用的增加均能促进N2O 的释放.
4.2温度的升高可以直接促进水体中N2O的释放,而氨氮浓度的升高主要通过提高硝化反应速率,加速N2O的产生.
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作者简介：路俊玲(1994-),女,山东青岛人,南京大学硕士研究生,主要研究方向为环境微生物学.发表论文2篇.。