北五味子中五味子甲素等木脂素类成分的积累规律研究

1北五味子中五味子甲素等木脂素类成分的积累规律研究
王喜军*，窦圣姗，于立河，张宁，孟祥才
（黑龙江中医药大学药学院，哈尔滨150040）
[摘要] 目的：考察人工规范化种植五味子果实的（北五味子）中五味子甲素等木脂素类成分的积累规律，确定主产地北五味子药材的最适采收期。

方法：运用高效液相色谱法对不同生长期的北五味子中的五
味子甲素、五味子乙素及五味子醇甲的含量进行。

结果：8、9、10月份所采的北五味子中五味子甲素、
五味子乙素和五味子醇甲三种成分含量随季节的深入而呈现增长趋势，至10月份三种有效成分含量时间均
达到最高。

因此，北五味子应在10月上旬采集。

[关键词]五味子；五味子甲素；五味子乙素；五味子醇甲；采收期
STUDIES ON THE ACCUMULATIVE REGULATION OF THE CONTENTS OF LIGNINS IN Schisandru chinensis(Turcz.) Bai l Wang Xi-jun* Dou sheng-shan Yu li-he Zhang ning Meng xiang-cai
(Pharmaceutical college of Heilongjiang university of Chinese medicine,
Haerbin 150040)
[ABSTRACT] :Object: To investigate the accumulative regulation of the contents of shiandin A shiandin B etc in Schisandru chinensis(Turcz.) Bai l and the best harvest time of Schisandru chinensis(Turcz.) Bai l in the main producing area . Method: The contents of shiandin A , shiandrin B and schizandrol A were determined by HPLC. Result: The contents of shiandin A , shiandrin B and schizandrol A were gradual increased in August , September and October , the contents were highest in October . Schisandru chinensis(Turcz.) Bai l should be collected in the first ten days of October.
[KEY WORDS] : Schisandru chinensis(Turcz.) Bai l ;Shiandin A ; Shiandin B ; Schizandrol A ; Harvest time
北五味子为木兰科（Magnoliaceae）多年生落叶木质藤本植物五味子Schisandru chinensis(Turcz.) Bai l的干燥成熟果实，主要分布于我国东北各省山区，野生资源丰富，具有补肾、益气、生津、固涩等功效，目前广泛地用于慢性肝炎的治疗，取得良好疗效。

近年来，随着五味子需求的增加，五味子的资源在逐渐减少，而且由于掠青现象逐年加重，也导致五味子的品质逐渐退化。

因此，在药材主产区广泛开展了人工规范化种植五味子的工作，为使该项工作更有效地进行，提高人工种植五味子的品质，课题组对人工种植北五味子的最
1国家科技攻关计划：项目编号99-929-01-17，项目负责人：王喜军。

*通讯作者：wxj@
适采收期进行研究。

五味子的化学成分主要含有挥发油和木脂素成分，且木脂素类成分为五味子中的主要药效物质基础[1],而五味子甲素(shiandin A)、五味子乙素(shiandrin B)、五味子丙素(shiandrin C)、五味子醇甲(schizandrol A)、五味子醇乙(schizandrol B)、五味子脂甲(wuweizi ester A) 等为五味子的主要成分，且五味子甲素、五味子乙素及五味子醇甲为北五味子的主要活性物质。

因此，本文以上述三种木脂素类成分为目标，利用高效液相色谱法对北五味子药效物质基础的季节积累进行研究，从而依其确定北五味子的最适采收期。

1 实验仪器及材料
1.1 仪器Waters高效液相色谱仪（Waters 600 Controller，Waters 600 Pump，Waters 996 Photodiode Array Detector）； 80-2型离心机；H66MC型超声震荡仪；电热恒温干燥箱。

1.2 药品及试剂对照品五味子甲素（schizandrin）、五味子乙素（deoxyschizandrin）、五味子醇甲（schizandrol A）由中国生物制品药品检定所提供；甲醇，HPLC级，美国迪马（DIKMA）试剂公司；其余试剂为分析纯。

1.3 五味子药材来源2002年8—10月采自黑龙江省中药材GAP研究中心桃山五味子规范化种植基地的样品,经黑龙江中医药大学生药教研室鉴定为木兰科植物五味子[Schisandra chinensis (Turcz) Baill]。

2 实验方法与结果
2.1方法学考察
2.1.1对照品溶液的制备
精密称取五味子甲素约1.50mg、五味子乙素约3.70mg，五味子醇甲约2.5.00mg，置25ml 容量瓶中，用甲醇溶解，摇匀，并稀释至刻度。

即得（每1ml含五味子甲素 0.06mg，含五味子乙素0.148 mg，含五味子醇甲 0.1mg）。

2.1.2色谱条件流速：1ml/min；检测波长：250nm；柱温：40℃；保护柱：Nova-Pak C18Guard-Pak TM ；色谱柱：Hypersil C18(4.6mm×250mm，5um)；流动相：甲醇-水
（50：50 15min80：20）。

在此色谱条件下，五味子甲素、五味子乙素及五味子醇甲和样品中其他组分峰基线分离（见图-1），与其相邻色谱峰的分离度大于1.5；按五味子醇甲峰计算，理论塔板数（N）为2000以上；拖尾因子（T）为1.04。

图-1 五味子样品及标准对照品的色谱图
a对照品；b五味子样品
2.1.3标准曲线绘制五味子甲素和五味子乙素对照品溶液分别自动进样2、4、6、8、10
μl，五味子醇甲对照品溶液自动进样3、6、9、12、15μl，以各对照品色谱峰面积Y与质
量X做标准曲线，得五味子甲素的回归方程为Y=4.0871×10-7X+0.0145 (r=0.9998)，线性范围
为0.12～0.6ug；测得五味子乙素峰回归方程为Y=6.0220×10-7X+0.0541 (r=0.9998)，线性范
围为0.296～1.48ug。

取对照品溶液B分别进样3、6、9、12、15ul，得五味子醇甲回归方程
为Y=4.0327×10-7X+0.0455 (r=0.9995)，线性范围为0.3～1.5ug。

2.1.4精密度试验精密吸取对照品溶液各10ul，重复进样五次，测得五味子甲素RSD为
0.27%；五味子乙素RSD为1.23%；五味子醇甲RSD为1.86%。

2.1.5稳定性试验取五味子粉末0.3g，处理方法同供试品溶液操作，供试品溶液每隔4h
重复进样5次，每次20ul，进行稳定性试验，测得五味子甲素RSD为3.73%；五味子乙素
RSD为2.67%；五味子醇甲RSD为2.39%。

以上试验结果表明，供试品在16h内保持稳定。

2.1.6重现性试验取五味子粉末五份，每份约300mg，精密称定，处理方法同供试品溶液
操作，取20ul注入液相色谱仪，测得五味子甲素RSD为1.98%；五味子乙素RSD为1.59%；
五味子醇甲RSD为1.89%。

2.1.7回收率试验取已知含量的五味子粉末5份，每份0.1500g，精密称定，分别加标准
溶液A、B各2.5ml，再加甲醇17.5ml，其余操作同供试品溶液制备。

进样20ul，测得加样
回收率，依法重复测定3次，平均回收率五味子甲素为98.60%、五味子乙素为99.25%，RSD
分别为2.83%和1.96%；五味子醇甲为99.91%，RSD为3.19%。

2.1.8提取条件考察
2.1.8.1提取方法的考察
取五味子粉末样品300mg二份，精密称定，一份加甲醇20ml超声提取，操作同供试品
溶液制备；另一份加甲醇20ml，加热回流2小时，离心15分钟（3000rpm），以下操作同供
试品溶液制备。

分别吸取上述二种供试品20ul 测定，结果见表-1。

表-1 不同提取方法测定结果（%）
提取方法五味子醇甲五味子甲素五味子乙素
超声提取0.4583 0.0977 0.2563 回流提取0.4393 0.0960 0.2493
以上结果表明，超声所用时间短，药材中的有效成分比回流提取完全，故本试验采用超
声提取方法进行试验。

2.1.8.2提取时间的考察
取五味子样品粉末300mg三份，精密称定，置20ml量瓶中，精密加甲醇20ml，密封，
分别超声提取20、30、40分钟，离心15分钟（3000rpm），上清液用0.45μm滤膜及ODS
预柱滤过，得供试品溶液。

分别吸取上述三种供试品20ul 测定，结果见表-2。

表-2 不同提取时间测定结果（%）
提取时间（min）五味子醇甲五味子甲素五味子乙素
20 0.4087 0.0807 0.2620
30 0.4587 0.0980 0.2563
40 0.4300 0.0967 0.3280
以上结果表明，提取30分钟效果较好。

2.1.8.3提取溶剂用量的考察
取五味子粉末300mg三份，精密称定，置50ml量瓶中，精密加甲醇15、20、25ml，
密封，以下操作同供试品溶液，分别吸取上述三种供试品20ul 测定。

表-3 提取用量考察表
加醇量（ml ） 五味子醇甲 五味子甲素 五味子乙素
15 0.3920 0.1037 0.2950 20 0.4250 0.1133 0.2997 25 0.4490 0.1600 0.2980 以上结果表明，加甲醇20和25ml 测定相近，但20ml 的色谱峰形较好。

2.2样品的制备及测定
分别取不同采收时间北五味子样品粉末（过3号筛）约300mg ，精密称定，置20ml 量瓶中，精密加甲醇20ml ，密封，超声提取（功率250W ，频率20KH Z ）30分钟，离心15分钟（3000rpm ），上清液用0.45μm 微孔滤膜滤过即为供试品溶液，在拟定的色谱条件下测定，结果（表-4、图-2、图-3）表明，所测的三种木脂素类成分呈现基本相同的随时间变化规律，因此，以总量来衡量其变化规律确定其采收期具有可行性。

即8-10月份随时间递进，三种木脂素呈递增趋势，以10月份为最高。

表-4 五味子不同采收时间的含量测定表（%）
五味子醇甲
五味子甲素 五味子乙素 样品 采集日期 含量 RSD 含量 RSD 含量 RSD 总量
1 02.8.10 0.459 1.64 0.061 2.50 0.205 1.60 0.725
2 02.8.20 0.469 0.69 0.064 0.92 0.298 1.85 0.831
3 02.8.30 0.439 4.1
4 0.066 2.62 0.329 4.38 0.834 4 02.9.22 0.493 1.17 0.084 4.49 0.317 1.79 0.894
5 02.10.4 0.559 1.17 0.102 2.89 0.354 4.43 1.015 图-2 北五味子中各木脂素含量变化图
00.1
0.2
0.30.40.5
0.6
02.8.1002.8.2002.8.3002.9.2202.10.4采收时间
含量（%）
图-3 北五味子总木脂素含量变化图
00.2
0.4
0.6
0.811.2
02.8.1002.8.2002.8.3002.9.2202.10.4采收时间
含量（%）
3.结论与讨论
北五味子五味具备，有补肾、益气、生津、固涩等功效，中医视为滋补强壮剂。

从20世纪70年代起我国即以五味子治疗慢性肝炎，取得良好疗效[2]。

其所含的五味子甲素和五味子醇甲能能够增强肝细胞膜的稳定性，增强小鼠肝细胞抵抗CCL4毒性的能力，从而起到肝保护作用[3]；五味子乙素能选择性地提高滑面内质网中的肝细胞色素P450浓度，从而提高机体的解毒能力。

而五味子甲素、五味子醇甲与五味子乙素具有共同的联苯环辛双烯结构，均可能通过对肝细胞色素P450的影响增强肝脏抗毒能力[4]。

三种木脂素类成分的活性直接与五味子治疗肝炎的临床疗效相关，为五味子的主要活性物质，也是目前国家标准中的重要指标成分，故以三种成分的含量为衡量北五味子质量，并一起积累规律确定采收期是合理的。

本试验首先建立了高效液相色谱法同时测定北五味子中五味子甲素、五味子乙素和五味子醇甲含量的方法，并进行了系统的方法学研究，其方法的回收率分别为五味子甲素、五味子乙素为98.60%，RSD为2.83%；五味子醇甲为99.91%，RSD为3.19%，方法的精密度、重现性均达到技术要求，可用于五味子及制剂中三种成分的同时定量。

不同采收期的样品分析结果表明，8-10月份北五味子中三种有效成分含量均随季节的深入均呈现相同的增长规律，到10月份三种有效成分含量时间均达到最高。

故以三种木脂素的含量总和变化规律能体现药效物质基础的变化情况，可用于采收期的确定。

从其规律可见人工种植的北五味子在主产区桃山林业局应在10月上旬采收，此时不但北五味子药效物质含量高，且药材外观质量也佳。

此方法可用于其他产区北五味子药材的采收期监测。

[参考文献]
[1] 杨放，袁军等.五味子研究概况.华西药学杂志，2003，18（6）：438-440.
[2] 五味子甲素和五味子醇甲对四氯化碳所致肝脏损伤的保护作用张明华陈虹等，武警医学2002，13（7）：
395-396.
[3] Zhang M ，Wang BE，Liu GT et a1．Effect of sehisandrin B on lipoperoxidative damage to plasma
membrane of rat liver in vitro．Acta Pharmacol Sin，1992，13(4)：255～258.
[4] Siu—Pb IP，Chun—Tao CHE，Kam —rCnns KO．Structure—activity relationship of schisandrins
in enhancing liver mitoehondri al glutathione status in CCL4poisoned mice． Acta Pharmacol Sin，1998，19(4)：313—316.。