大豆蛋白水解液脱苦

中图分类号：ＴＱ６４５．９＋９；文献标识码：Ａ；文章篇号：１００７－２７６４（２００４）０１－００１２－０３２　
大豆蛋白水解液脱苦的研究
朱海峰１ 班玉凤１ 周克仲２　
（１．沈阳工业大学辽阳校区化工学院，辽阳　１１１００３）（２．辽阳石油化纤公司，辽阳　１１１００３）　
摘 要：大豆蛋白酶解常常会产生苦味，蛋白质水解物苦味肽的苦味是长期困扰其应用的问题。

本文研究了酶法与微生物法对大豆蛋白水解液脱苦的效果。

结果表明：采用端肽酶黑曲霉酸性蛋白酶（３０００ｕ／ｇ）与内切酶枯草杆菌碱性蛋白酶（Ａｌｃａｌａｓｅ　２．４Ｌ）协同作用水解大豆蛋白可有效降低水解液苦味，并且由酿酒酵母对水解液进一步处理后，大豆蛋白水解液的苦味降至更低。

　
关键词：大豆蛋白水解液；脱苦；黑曲霉酸性蛋白酶；酿酒酵母　
大豆蛋白是植物性食物中氨基酸组成比例最合理的蛋白质。

通过水解大豆蛋白制成蛋白肽混合物可以提高大豆蛋白的加工性能、营养性以及生理保健功能。

但水解后，原来处于蛋白质内部的疏水性氨基酸就会暴露出来，使水解产物呈现出一定的苦味，限制了水解产物的最终应用，因此必须将苦味消去。

脱苦的主要方法有选择性分离法、掩盖法、膜分离法、和酶法。

文献中报道的在大豆蛋白水解液中多采用活性炭吸附法或活性炭吸附法与包埋法结合法进行脱苦[1~2]，但在脱苦过程中营养成分会有所损失。

本文在制取大豆蛋白肽工艺中采用酶法和微生物法来脱除大豆蛋白水解液的苦味。

１ 材料与方法　
1.1 实验原料及药品
枯草杆菌（Alcalase）碱性蛋白酶2.4L：食品级（酶活力2.4AU/g），丹麦NOVO公司出品；
黑曲霉酸性蛋白酶：食品级(酶活力3000u/g)，北京房山酶制剂厂出品；
大豆蛋白（含水量7.35%，蛋白质含量69.6%）：市售；
酿酒酵母：大连理工大学生化实验室提供；
其它试剂为国产试剂。

1.2 实验仪器
精密酸度计：pHS-2型，上海雷磁仪器厂；
台式离心机：80-1型，江苏省金坛市医疗仪器厂；
超级恒温水浴：501型，上海市实验仪器厂；
水夹套式三口玻璃发酵罐：250ml，自加工；
磁力搅拌器：78-1型，国华电器有限公司。

收稿日期：２００３－１０－２９　
作者简介：朱海峰（１９７０～），男，讲师，研究方向为生物酶催化1.3 工艺流程
大豆蛋白→酶解→灭酶→离心→水解液→脱苦→脱色→浓缩→喷雾干燥
1.4 实验方法
1.4.1 酶解反应
将大豆蛋白在105℃下干燥至恒重，称取一定量上述原料加入发酵罐（置于磁力搅拌器上），按照设计的底物浓度向发酵罐中补适量自来水。

连接发酵罐和超级恒温水浴，启动磁力搅拌器和超级恒温水浴，然后在搅拌下以一定方式加入蛋白酶（单酶或双酶）进行水解。

水解结束后，水解液经过高温灭活（95℃下加热5min），在4000 r/min的条件下离心10min，取适量上清液供分析用，同时小心取出全部残渣经充分干燥后用于测定降解率HR。

HR 定义为：（底物投料量－剩余残渣量）／底物投料量。

1.4.2 蛋白质水解度（HD）测定
根据文献［3~5］介绍的甲醛滴定法测定。

水解度的定义为在水解过程中打开的肽键占蛋白质肽键总数的百分比。

1.4.3 苦味评分标准
产品苦味的鉴定采用感官评价法。

以20名品尝者（男、女各10名，均为不吸烟者）按照下面评分基准进行评分，最后得出平均值来表示苦味程度。

将Alcalase水解大豆蛋白18h的水解液定为10分，取20ml水解液10份，分别加入10、20、30、40、50、60、70、80、90、100ml的蒸馏水，搅拌均匀，将其苦味值分别定义为9、8、7、6、5、4、3、2、1、0。

1.4.4 大豆蛋白原料蛋白质含量的测定
采用凯氏定氮法测定蛋白质含量，见文献[5]。

32
33
２ 结果与讨论　
文献报道蛋白质酶解过程多采用碱性蛋白酶[7]。

由于肽键的打开会导致水解液pH 值下降，因此一般在水解过程都要外加碱以维持水解液的pH 值，确保酶的最佳活性，从而提高蛋白质的降解率并尽可能降低肽分子量。

但是水解过程中加碱恒pH 值的后果是增加了水解物下游处理过程中脱盐除杂难度，不利于降低产品成本和提高产品纯度。

本文酶解反应都是在没有外加碱的pH 渐变条件下进行的。

2.1 单酶水解
2.1.1 Alcalase 水解条件
考察了反应温度、酶与底物比、反应时间对Alcalase 水解大豆蛋白的影响，结果见图1~3。

图１温度对Ａｌｃａｌａｓｅ水解性能的影响　
酶与底物比１０μｌ／ｇ蛋白；底物浓度６０ｇ／ｌ；水解时间２ｈ　Fig.1 Effect of hydrolysis temperature on Performance of Alcalase
图２　酶与底物比对Ａｌｃａｌａｓｅ水解性能的影响　底物浓度６０ｇ／ｌ；水解时间２ｈ；反应温度７０℃　Fig.2 Effect of protease / substrate ratio on hydrolysis performance
of Alcalase
图３　Ａｌｃａｌａｓｅ水解大豆蛋白时降解率和水解度随时间的变化　底物浓度60g/l ；酶与底物比1 0ìl/g 蛋白；反应温度70 Fig.3 Progress of soybean protein hydrolysis with Alcalase
由以上试验可以看出单酶水解的最佳条件是：温度为70 ，酶与底物比的范围为10~20ìl/g 蛋白，反应时间为2h 。

2.1.2 温度对酸性蛋白酶的水解性能的影响
按同样方法，在不外加碱的情况下筛选出黑曲霉酸性蛋白酶的水解适宜条件：酶与底物比2%；底物浓度60g/l ；水解时间2h 。

温度对酸性蛋白酶的水解性能的影响见图4。

实验中发现酸性蛋白酶的降解率和水解度随温度变化的趋势不一致。

降解率在55 有最大值，而水解度则随温度的提高而单调增加。

这一点与Alcalase 情况不同。

在黑曲霉酸性酶水解大豆蛋白的条件下，蛋白的降解率很低，这可能是因为酸性酶为端肽酶，不利于打开大分子的缘故。

图４温度对酸性蛋白酶水解性能的影响　
Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on Performance of acidic protease
2.2 双酶协同水解的条件
在不外加碱的情况下大豆蛋白水解过程中水解液的pH 值不断下降，不利于Alcalase 的水解活性，在Alcalase 的水解体系中引入外切酶黑曲霉酸性蛋白酶后，因为水解液pH 值的下降恰好有利于酸性蛋白酶工作，因此采用外切酶黑曲霉酸性蛋白酶与内切酶Alcalase
碱性蛋白酶协同水解大豆蛋白，不但可降低
水解液苦味，还可能会提高降解率和水解液的水解度。

我们首先通过正交试验优化了双酶水解大豆蛋白的水解条件。

由于酸性蛋白酶的最高允许使用温度为60℃，所以下列正交试验中温度点的选择为最高60℃。

正交试验结果如表2所示。

按正交表L9(34)设计试验表，反应时间为4h。

表１　正交试验因素水平　
Tab.1 The factors and levels of orthogonal test
水平
A
温度℃
B
E(Alcalase)/S
C
E(酸性酶)/S
D
底物浓度g/l
1 50 5 2% 40
2 55 10 4% 60
3 60 15 6% 80
表２ 正交试验结果　
Tab.2 The results of the orthogonal test
实验号 A B C D HR(%) HD(%)
1 1 1 1 1 43 17.35
2 1 2 2 2 44 24
3 1 3 3 3 44.5 26.41
4 2 1 2 3 44.2
5 22.03
5 2 2 3 1 54 22.01
6 2 3 1 2 46 24.26
7 3 1 3 2 48 24.37
8 3 2 1 3 43 22.23
9 3 3 2 1 52.5 23.92
HR HD HR HD HR HD HR HD
K1131.5 67.76 135.2563.75 132 63.84 149.5 63.28 K2144.25 68.3 141 68.24 140.7569.95 138 72.63 K3143.5 70.52 143 74.59 146.5 72.79 131.7570.67 k143.83 22.59 45.08 21.25 44 21.28 49.83 21.09 k248.08 22.77 47 22.75 46.92 23.32 46 24.21 k347.83 23.51 47.67 24.86 48.83 24.26 43.92 23.59 R 4.25 0.92 2.59 3.61 4.83 2.98 5.91 3.12 A2A3B3B3C3C3D1D2
从正交试验得到的双酶协同水解的最佳水解条件为：底物浓度40g/l，水解温度为60℃，Alcalase与底物比为15μl/g蛋白，酸性蛋白酶与底物比为6％。

在此最佳水解条件下，考察了大豆蛋白水解降解率和水解度随时间的变化情况。

结果如图5所示。

由图5可见，在使用双酶即在内切蛋白酶的水解体系中引入端肽酶的情况下，在水解18h的延长时间里，蛋白质降解率和水解液水解度都随着时间的延长明显增
加。

在水解时间达到18h时，原料降解率达到了约76%，水解度达到了约26%，水解度在达到24h时仍
呈上升趋势。

以上双酶的水解行为及水解结果与Alcalase 单独水解行为和水解结果明显不同。

双酶水
解的最佳时间确定为18h。

图５　双酶水解大豆蛋白降解率及水解度随时间的变化　
Fig.5 Progress of soybean protein hydrolysis under double enzymes mode 2.3 最佳水解条件下Alcalase单酶水解的苦味值及水
解度和降解率
单酶水解最佳反应条件：底物浓度60g/l，水解温
度70℃，Alcalase与底物比15μl/g蛋白。

与双酶水解
对照，水解时间取为18h。

大豆蛋白降解率为51％，水解液水解度为11％。

在水解的18h里，随着水解时间延长，水解液苦味逐
渐加重。

水解18h后水解液味很苦，根据苦味评分标准，苦味值定为10。

2.4 最佳水解条件下双酶协同水解的苦味值
在双酶最佳水解条件下，水解初始，水解液味苦，
水解1h后水解液苦味显著下降，以后变化不大。

水解
结束后水解液稍苦，根据评定，苦味值降至6。

多肽的C－末端为疏水性残基，N端为疏水性或
碱性氨基酸残基，该多肽会呈现出较强的苦味。

端肽
酶可以从肽链的末端移去一个或几个氨基酸分子，例
如羧肽酶从C－端，而氨肽酶从N－端起作用而使苦
味肽的苦味减轻。

黑曲霉酸性蛋白酶为羧肽酶，因此
当与内切酶Alcalase碱性蛋白酶协同作用时，不但水
解度和降解率显著提高，而且水解液的苦味值也显著
下降。

2.5 酿酒酵母对水解液的脱苦
取一定体积的双酶水解液接入1％的酿酒酵母，
先在35℃保温1h后，再升温至45℃保温静置１２ｈ。

水解液苦味值降为３。

　
酿酒酵母中存在一定的产氨肽酶体系［8］，他们
有能力从N
－端将黑曲霉酸性蛋白酶作用后残留的苦
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味肽进一步水解，使水解液苦味进一步降低。

３ 结论　
（1）将外切酶黑曲霉酸性蛋白酶与内切酶Alcalase 碱性蛋白酶结合使用水解大豆蛋白，不但可以有效降低水解液苦味，而且还可显著提高大豆蛋白的降解率和水解液的水解度。

（2）酿酒酵母的氨肽酶体系可将苦味肽进一步水解，使苦味值减弱。

参考文献　
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London: Elsevier ,1986.427
5 北京师范大学生物系生物化学教研室基础生物化学实验
[M] 北京:高等教育出版社1982.121-123
6 张龙翔等. 生化实验方法和技术:第二版[M], 北京:高等
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[J]. 食品科学, 1999 20(6):42-45
8 陈思妍. 酵母生物化学[M].山东科技出版社,1984
Studies on Debitter of Soybean Protein Hydrolyzate
Zhu Haifeng1, Ban Yu-feng1, Zhou Ke-Zhong2
(1.Shenyang University of Technology Liaoyang Compus School of Chem.Eng,Liaoyang Liaoning 111003)
(2.Liaoyang Petrochemical Fibre Corporation,Liaoyang Liaoning 111003 )
Abstract: Enzymatic hydrolysis of soybean protein frequently results in bitter taste, and the bitterness in protein hydrolyzate has been a factor that hinders its application for a long time. In this paper, the application of exopeptidase and microorganism to remove the bitterness in soybean protein hydrolyzate has been studied. Results indicated that the cooperation of Aspergillus niger acidic protease (3000u/g) which a exopeptidase with Bacillus alkaline protease (2.4AU/g) which a ensoprotease clearly decrease s the bitter taste in soybean protein hydrolyzate, furthermore, the bitterness is lighter after the Brewing Yeast hydrolyzes bitter peptide further than before.
Key words: hydrolyzate of soybean protein; debittering; Aspergillus niger acidic protease; brewing yeast
（上接第５３页）　
异抗坏血酸护色，0.3%CaCl2防溃处理8h，充分漂洗后，采用间歇性常压加热渗糖72h，初始糖液浓度为35%，起糖糖液浓度为65%~70%， 60℃~55℃分段变温鼓风干燥，成品水分含量约控制在１８％，总糖含量为５８％左右，可获得质地韧软可口，有透明感，色泽呈淡黄白色，有淮山风味的淮山蜜饯产品。

　
参考文献　１　宁正祥等编．食品生物化学．华南理工大学出版社，１９９８　２　华南理工大学等编．食品分析．中国轻工业出版社，１９９４　
3 天津轻工业学院编．食品添加剂．中国轻工业出版社，１９８３
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5 自卫东等．银杏真空渗糖研究．食品科学，２００１（１）５０－５３６　王常青等．长山药粘液质的粘度与热稳定性的研究．食品科学，１９９５（８）７－１１　
Processing Technology of Chinese Yam Confectionery
Gao jianhua, Ning Zhengxiang, Pan Bin
(College of Food Engineering and Biotechnology ,South China University of Technology, Guangzhou510641) Abstract: The current research studies the processing technology of Chinese Yam confectionery, including pre-treatment, seep sugar (candying), and drying. The results showed that the product texture of the Chinese Yam confectionery become delicious in mouth, semi-transparent, white yellowish in color, and the candied product had the natural Chinese Yam flavor after the treatment process with 0.3% citric acid and 0.2% iso-ascorbic acid for anti- brown, 0.3%CaCl2 for 8 hours in order to avoid histolysis of the Yam, candying by interval heating for 72hours, 60℃ – 55 ℃ for interval drying (hot air) till water content became 18%, and total sugar became about 58%.
Key Words: Chinese Yam; Anti-brown; Seep sugar (candying); Drying; Product texture
35。