RP—HPLC法测定盐酸帕洛诺司琼原料药中有关物质的含量

RP—HPLC法测定盐酸帕洛诺司琼原料药中有关物质的含量

【摘要】目的：建立测定盐酸帕洛诺司琼原料药中4种有关物质杂质A、杂质B、杂质C和杂质D的方法。方法：采用梯度洗脱的反相高效液相色谱法。色谱柱为VP-ODS，以六氟磷酸钾的缓冲盐溶液-乙腈组成流动相体系进行梯度洗脱，流速为每分钟1.0ml；检测波长为215nm；柱温为45℃。检测3批样品中的有关物质。结果：盐酸帕洛诺司琼与各有关物质分离良好，各线性关系良好，检测限分别为0.0123、0.0058、0.0289、0.0126、0.0243?g。3批样品中检出已知杂质均小于0.05%。

【关键词】反相高效液相色谱法；盐酸帕洛诺司琼；有关物质；梯度洗脱

盐酸帕洛诺司琼（Palonosetron Hydrochloride ）由美国Syntex公司（现属瑞士Roche Biosicence公司）Berger，J等人在1991年合成。然后由瑞士Helsinn Healthcare开发成功，MGI Pharma买入了该药在北美的市场销售权，于2003年获得FDA批准，同年9月在美国上市。用于预防由中度或高度致呕性化疗引发的急性或迟发性恶心呕吐。本品为高选择性的5-HT3受体拮抗剂，作用效果明显。目前盐酸帕洛诺司琼尚未载入《中国药典》2010年版。本研究依据ICH指导原则，再结合实际生产工艺路线和产品有关物质检查结果，建立了有效可控的检查盐酸帕洛诺司琼中有关物质的方法。

1 材料

1.1 仪器

LC-20AT型HPLC仪，HPLC系统，LC-solution色谱工作站等；XS205型分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；PHS-3C型酸度计（天津大学精密仪器厂）。

1.2 药品与试剂

盐酸帕洛诺司琼原料药（重庆华邦制药有限公司，批号：PAL-20100701、PAL-20100702、PAL-20100703，纯度99.9%、99.9%、99.9%）；杂质A 2-[1-氮杂双环（2.2.2）辛-3S-基]-2，4，5，6-四氢-1H-苯并[de]异喹啉-1-酮盐酸盐对照品（批号：PAL -Z4d-100401，纯度：99.5%）、杂质B （S）-N-（（（S）-1，2，3，4-四氢萘-1-基）甲基）-奎宁-3-胺对照品（批号：PAL -Z2-100301，纯度：96.0%）、杂质C 2-[1-氮杂双环（2.2.2）辛-3S-基]-2，3，3aR，4，5，6-六氢-1H-苯并[de]异喹啉-1-酮盐酸盐对照品（批号：PAL -Z4c-100201，纯度：94.8%）、杂质D 3-（（S）-1-氧代-3aS，4，5，6-四氢-1H-苯并[de] 异喹啉-2（3H）-基）奎宁-1-氧化物对照品（批号：PAL -D-131001，纯度：98.4%）均来自重庆华邦制药有限公司；乙腈为色谱纯，水为自制纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：VP-ODS（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：A为六氟磷酸钾的缓冲盐溶液（取六氟磷酸钾7.36g加水1000ml使溶解），B为乙腈，梯度洗脱，流速：1.0ml·min-1；检测波长：215nm；柱温：25℃；进样量：10μl。梯度洗脱程序见表1。

表1 HPLC梯度洗脱程序

时间/min 流动相A/% 流动相B/%

0 75 25

40 65 35

50 65 35

50.1 75 25

60 75 25

2.2 溶液制备

取本品适量，精密称定，加稀释剂稀释制成每1ml中约含盐酸帕洛诺司琼1mg的溶液，摇匀，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液0.5ml，置100ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。分别称取杂质A、杂质B、杂质C、杂质D和盐酸帕洛诺司琼对照品适量，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml 中约含杂质A3?g、杂质B3?g、杂质C10?g、杂质D3?g和盐酸帕洛诺司琼1000?g 的混合溶液，作为系统适用性溶液，以六氟磷酸钾的缓冲盐溶液-乙腈（65：35），作为空白溶液。

2.3 有关物质测定

取系统适用性溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图。按出峰顺序依次为杂质B、杂质A、杂质C、盐酸帕洛诺司琼和杂质D，盐酸帕洛诺司琼峰与相邻杂质峰的分离度应大于1.5。

取对照溶液10μl，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分峰的峰高约为满量程的20%～25%，再精密量取供试品溶液与空白溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液的色谱图中如显杂质峰，杂质A、杂质B、杂质C和杂质D峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.3倍（0.15%），其他单个未知杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.2倍（0.1%），杂质总量不得过1.0%。

2.4 专属性试验

本品与有关物质的分离。照“2.2”、“2.3”项下方法试验，结果表明，盐酸帕洛诺司琼与杂质C分离度为2.0，与杂质D分离度为2.0，符合盐酸帕洛诺司琼峰与相邻杂质峰的分离度应大于1.5的要求，表明方法的专属性强。

2.5 线性关系试验

分别取盐酸帕洛诺司琼、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D各适量，精密称定，用流动相溶解并稀释成系列溶液，进样分析。以峰面积（y）对浓度（x）进行线性回归，得回归方程，结果表明盐酸帕洛诺司琼、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D线性关系良好。

2.6 检测限和定量限试验

分别将盐酸帕洛诺司琼、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D的对照品溶液逐步稀释后进行测定，信噪比按3：1计，得盐酸帕洛诺司琼、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D检测限分别为0.0123、0.0058、0.0289、0.0126、0.0243?g；信噪比按10：1计，盐酸帕洛诺司琼、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D定量限分别为0.0368、0.0173、0.0868、0.0377、0.0730?g。

2.7 中间精密度试验

照“2.3”项下有关物质测定方法，对同一样品（批号：PAL-20100701）在不同日期、不同仪器、不同操作人员进行中间精密度试验，结果，样品中总杂质平均含量为0.10%，RSD为1.6%。。

2.8 样品有关物质检测

取3批样品，按照“2.3”项下有关物质测定方法进行有关物质检查，试验结果显示，3批供试品PAL-20100701 、PAL-20100702 、PAL-20100703检出杂质A、杂质C和单个未知杂质均小于0.05%，杂质B和杂质D均未检出，总杂含量分别为0.11、0.10、0.10%。

3 讨论

3.1 检测波长选择

选择210nm、215nm、238nm三个检测波长，分别分析同一供试品（批号：PAL-20100703），结果显示三个波长下，成品中检出各已知杂质个数和水平均相当，杂质谱一致，无新增杂质出现。但在238nm波长下，成品杂质检出灵敏度，明显比210nm和215nm低，而210nm和215nm相当。又因210nm和215nmUV 吸收值明显比238nm强，215nm基线噪音干扰明显优于210nm，故选择215nm 作为检测波长。