微生物实验5 PPT课件
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应用：观察细菌对糖的分解情况，常用于肠道杆菌鉴定。
细菌的糖发酵试验P16
甲,乙→紫黑→①葡萄糖,②乳糖 丙,丁→粉红→③葡萄糖,④乳糖
2-3cm
37℃，24小时
实验分组
俩俩相对4人为一组,组号编在电源插座上。 每组按从前到后,从左到右的顺序，分别编号为
甲、乙、丙、丁。
甲 乙甲 乙甲 乙
实验时应坐着，在酒精灯半径20厘米范围内操作， 保持安静、有序，尽量少说话、少走动，以免感 染病原菌。
思考题
细菌生化反应在感染性疾病诊断中有何重要意义? 为什么要在发酵管液面上方大约2～3cm处切割？ 培养时，微量糖发酵管管口不能朝上，为什么？ 抗生素敏感性实验有何实际意义? 血浆凝固酶试验观察完毕，应将载玻片立即放入
血浆凝固酶试验P17
致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，凝固人或家 兔血浆。
在体内，凝固的血浆沉积在菌体表面，阻碍吞噬 细胞的吞噬和杀菌物质的破坏，从而有利于细菌 的生长繁殖、引起感染。
体外试验有试管法和玻片法两种。
试管法检测游离凝固酶，结果准确。
玻片法检测结合凝固酶，比较简便、常作为快速 筛选技术。
器材准备
医学微生物学实验 综合性实验一
脓汁和粪便标本中病原菌的检测（五） 糖发酵试验 药敏试验 血浆凝固酶试验 半固体接种法
糖发酵试验
不同细菌具有不同的糖分解酶，分解各种糖的代谢产物 也各不相同，有的产酸，有的产酸又产气。 糖发酵管：葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇和蔗糖。 指示剂：溴甲酚紫，PH≥6.8为紫色，≤5.2为黄色。 原理：多糖→单糖→丙酮酸、酸性产物(产气)→pH↓ →指示剂呈酸性变色。 结果:变色无气泡“+” 、变色有气泡“⊕”、培养 基不变色“-”。
凝固酶试验试管法： 游离凝固酶→凝血酶
↓ 纤维蛋白原→纤维蛋白→血浆凝固
凝固酶试验玻片法： 结合凝固酶（菌体表面） ↓
纤维蛋白原→纤维蛋白→细菌凝集
玻片法
取二滴兔血浆置于洁净的玻片上。 分别用接种环取白色和黄色菌苔(2～3个菌落的
菌量)与血浆研磨混合，立即观察结果。 出现明显凝块为阳性，否则为阴性。
为了避免抗菌药物使用的盲目性，防止因不合理 用药，导致耐药性细菌的增多、药物中毒、治疗 失败、菌群失调等问题的发生，用药前（时）， 做药物敏感性试验。
药物敏感性试验—纸片扩散法wenku.baidu.com
将含有定量抗菌素的纸片，平贴在已经接种了试验细菌 的平板上。纸片中的抗菌素吸收培养基的水分，溶解后 不断向周围扩散，形成递减的梯度浓度。敏感细菌在纸 片周围的生长受到抑制，而形成没有细菌生长的抑菌圈
※白色菌苔容易混合均匀，黄色菌苔常涂抹不开。 ※晃动载玻片，让菌液流动起来，结果更明显。
载玻片1张
兔血浆各15ul
左侧血浆与黄色菌苔混合
右侧血浆与白色菌苔混合
半固体接种法P11
具有鞭毛能够真正运动的细菌，在半固体培基中, 能冲破低浓度琼脂的阻力，自接种部位向周围移
动扩散生长，培养基呈扩散云雾状混浊状态。
无鞭毛不能运动的细菌，只能沿着穿刺线生长 繁殖，穿刺线边缘清晰，周围培养基清澈透明。
方法：接种针斜面取菌，从半固体培养基中心，垂直刺 入，到达培养基底部4/5处，再循原来的路线，退出接 种针。
甲，乙→紫黑 。丙，丁→粉红。
半固体接种法P11
甲，乙→紫黑 丙，丁→粉红 标记:组号,颜色
37℃,24小时
试验菌用量以对照琼脂平板表面生长的菌落呈密 集或半密集为宜。
甲→黄色菌液 乙→白色菌液 丙→紫黑菌液 丁→粉红菌液
灭菌
取样
6ul+6ul
纸片扩散法：菌液→ 密集涂布平板 → 标记:青、 链、庆 →贴青霉素、链霉素、庆大霉素纸片→ 按压→ 倒置培养18～24小时→ 观察结果。
青
链
庆
标记
青
链
庆
贴抗菌素纸片
1
2
3
丙 丁丙 丁丙 丁
讲
台
甲 乙甲 乙甲 乙
6
7
8
丙 丁丙 丁丙 丁
甲 乙甲 乙
4
5
丙 丁丙 丁
甲 乙甲 乙
9
10
丙 丁丙 丁
细菌药物敏感性试验P20
磺胺1907年发现，1935年临床应用。青霉素1929 年发现，1945年临床应用。
我国住院病人抗菌素使用率达70%，新生儿病房 抗菌素使用率达100%。
消毒缸内，为什么? 半固体穿刺接种时，为什么要强调“原路返回”? 为保证实验结果的可靠性，你认为上述试验应还
设立哪些对照?
细菌的糖发酵试验P16 甲→紫黑→①葡萄糖，乙 →紫黑→②乳糖，
丙→粉红→③葡萄糖，丁 →粉红→④乳糖 。
细菌的药敏试验P20（菌液） 甲→黄色→平板 + 青、链、庆纸片
安全警告
本次实验（糖发酵试验、药敏试验、血浆凝固酶 试验和半固体接种）操作一次，可能产生几百个 微生物气溶胶颗粒。
气溶胶粒径＞100um沉降很快,＜50um在0.4s内扩 散开,＜5um通过呼吸道直接到达肺泡。
Pike博士对实验室感染统计分析结果发现，不明 原因的感染高达82%，大多数是气溶胶在空气中 扩散引起的。
实验方法
接种环取菌液3～6ul×2环（操作时，不得同时 握持菌液管和平板，以免菌液倒出来，造成污 染）。平板密集划线接种细菌（纱窗样）。设计 三点，三点之间等边三角距离，点距离平皿边缘 约15mm。作标记：青、链、庆。镊子火焰消毒， 夹取相应的药物纸片，平贴在已设定的位置上， 按压，最后镊子火焰灭菌。37℃18～24小时培养， 观察结果。
乙→白色→平板 + 青、链、庆纸片
丙→紫黑→平板 + 青、链、庆纸片
丁→粉红→平板 + 青、链、庆纸片
血浆凝固酶试验P17 兔血浆15ul+黄色,白色
半固体接种法P11 甲,乙→紫黑
依抑菌圈的有无、大小来判断敏感性。
敏感：试验细菌所引起的感染，可以用常用剂量的某 种抗菌药物治愈。
耐药：试验细菌引起的感染，不能用该种抗菌药物治 愈。
☆试验菌用量以对照琼脂平板表面生长的菌落呈密集或半 密集为宜。
实验分工（每人1块平板）
甲→黄色菌液→平板 + 青、链、庆纸片。 乙→白色菌液→平板 + 青、链、庆纸片。 丙→紫黑菌液→平板 + 青、链、庆纸片。 丁→粉红菌液→平板 + 青、链、庆纸片。
细菌的糖发酵试验P16
甲,乙→紫黑→①葡萄糖,②乳糖 丙,丁→粉红→③葡萄糖,④乳糖
2-3cm
37℃，24小时
实验分组
俩俩相对4人为一组,组号编在电源插座上。 每组按从前到后,从左到右的顺序，分别编号为
甲、乙、丙、丁。
甲 乙甲 乙甲 乙
实验时应坐着，在酒精灯半径20厘米范围内操作， 保持安静、有序，尽量少说话、少走动，以免感 染病原菌。
思考题
细菌生化反应在感染性疾病诊断中有何重要意义? 为什么要在发酵管液面上方大约2～3cm处切割？ 培养时，微量糖发酵管管口不能朝上，为什么？ 抗生素敏感性实验有何实际意义? 血浆凝固酶试验观察完毕，应将载玻片立即放入
血浆凝固酶试验P17
致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，凝固人或家 兔血浆。
在体内，凝固的血浆沉积在菌体表面，阻碍吞噬 细胞的吞噬和杀菌物质的破坏，从而有利于细菌 的生长繁殖、引起感染。
体外试验有试管法和玻片法两种。
试管法检测游离凝固酶，结果准确。
玻片法检测结合凝固酶，比较简便、常作为快速 筛选技术。
器材准备
医学微生物学实验 综合性实验一
脓汁和粪便标本中病原菌的检测（五） 糖发酵试验 药敏试验 血浆凝固酶试验 半固体接种法
糖发酵试验
不同细菌具有不同的糖分解酶，分解各种糖的代谢产物 也各不相同，有的产酸，有的产酸又产气。 糖发酵管：葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇和蔗糖。 指示剂：溴甲酚紫，PH≥6.8为紫色，≤5.2为黄色。 原理：多糖→单糖→丙酮酸、酸性产物(产气)→pH↓ →指示剂呈酸性变色。 结果:变色无气泡“+” 、变色有气泡“⊕”、培养 基不变色“-”。
凝固酶试验试管法： 游离凝固酶→凝血酶
↓ 纤维蛋白原→纤维蛋白→血浆凝固
凝固酶试验玻片法： 结合凝固酶（菌体表面） ↓
纤维蛋白原→纤维蛋白→细菌凝集
玻片法
取二滴兔血浆置于洁净的玻片上。 分别用接种环取白色和黄色菌苔(2～3个菌落的
菌量)与血浆研磨混合，立即观察结果。 出现明显凝块为阳性，否则为阴性。
为了避免抗菌药物使用的盲目性，防止因不合理 用药，导致耐药性细菌的增多、药物中毒、治疗 失败、菌群失调等问题的发生，用药前（时）， 做药物敏感性试验。
药物敏感性试验—纸片扩散法wenku.baidu.com
将含有定量抗菌素的纸片，平贴在已经接种了试验细菌 的平板上。纸片中的抗菌素吸收培养基的水分，溶解后 不断向周围扩散，形成递减的梯度浓度。敏感细菌在纸 片周围的生长受到抑制，而形成没有细菌生长的抑菌圈
※白色菌苔容易混合均匀，黄色菌苔常涂抹不开。 ※晃动载玻片，让菌液流动起来，结果更明显。
载玻片1张
兔血浆各15ul
左侧血浆与黄色菌苔混合
右侧血浆与白色菌苔混合
半固体接种法P11
具有鞭毛能够真正运动的细菌，在半固体培基中, 能冲破低浓度琼脂的阻力，自接种部位向周围移
动扩散生长，培养基呈扩散云雾状混浊状态。
无鞭毛不能运动的细菌，只能沿着穿刺线生长 繁殖，穿刺线边缘清晰，周围培养基清澈透明。
方法：接种针斜面取菌，从半固体培养基中心，垂直刺 入，到达培养基底部4/5处，再循原来的路线，退出接 种针。
甲，乙→紫黑 。丙，丁→粉红。
半固体接种法P11
甲，乙→紫黑 丙，丁→粉红 标记:组号,颜色
37℃,24小时
试验菌用量以对照琼脂平板表面生长的菌落呈密 集或半密集为宜。
甲→黄色菌液 乙→白色菌液 丙→紫黑菌液 丁→粉红菌液
灭菌
取样
6ul+6ul
纸片扩散法：菌液→ 密集涂布平板 → 标记:青、 链、庆 →贴青霉素、链霉素、庆大霉素纸片→ 按压→ 倒置培养18～24小时→ 观察结果。
青
链
庆
标记
青
链
庆
贴抗菌素纸片
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甲 乙甲 乙甲 乙
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甲 乙甲 乙
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甲 乙甲 乙
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丙 丁丙 丁
细菌药物敏感性试验P20
磺胺1907年发现，1935年临床应用。青霉素1929 年发现，1945年临床应用。
我国住院病人抗菌素使用率达70%，新生儿病房 抗菌素使用率达100%。
消毒缸内，为什么? 半固体穿刺接种时，为什么要强调“原路返回”? 为保证实验结果的可靠性，你认为上述试验应还
设立哪些对照?
细菌的糖发酵试验P16 甲→紫黑→①葡萄糖，乙 →紫黑→②乳糖，
丙→粉红→③葡萄糖，丁 →粉红→④乳糖 。
细菌的药敏试验P20（菌液） 甲→黄色→平板 + 青、链、庆纸片
安全警告
本次实验（糖发酵试验、药敏试验、血浆凝固酶 试验和半固体接种）操作一次，可能产生几百个 微生物气溶胶颗粒。
气溶胶粒径＞100um沉降很快,＜50um在0.4s内扩 散开,＜5um通过呼吸道直接到达肺泡。
Pike博士对实验室感染统计分析结果发现，不明 原因的感染高达82%，大多数是气溶胶在空气中 扩散引起的。
实验方法
接种环取菌液3～6ul×2环（操作时，不得同时 握持菌液管和平板，以免菌液倒出来，造成污 染）。平板密集划线接种细菌（纱窗样）。设计 三点，三点之间等边三角距离，点距离平皿边缘 约15mm。作标记：青、链、庆。镊子火焰消毒， 夹取相应的药物纸片，平贴在已设定的位置上， 按压，最后镊子火焰灭菌。37℃18～24小时培养， 观察结果。
乙→白色→平板 + 青、链、庆纸片
丙→紫黑→平板 + 青、链、庆纸片
丁→粉红→平板 + 青、链、庆纸片
血浆凝固酶试验P17 兔血浆15ul+黄色,白色
半固体接种法P11 甲,乙→紫黑
依抑菌圈的有无、大小来判断敏感性。
敏感：试验细菌所引起的感染，可以用常用剂量的某 种抗菌药物治愈。
耐药：试验细菌引起的感染，不能用该种抗菌药物治 愈。
☆试验菌用量以对照琼脂平板表面生长的菌落呈密集或半 密集为宜。
实验分工（每人1块平板）
甲→黄色菌液→平板 + 青、链、庆纸片。 乙→白色菌液→平板 + 青、链、庆纸片。 丙→紫黑菌液→平板 + 青、链、庆纸片。 丁→粉红菌液→平板 + 青、链、庆纸片。