大鼠心脏TNNT2基因的克隆及表达研究_李兆阳

大鼠心脏ＴＮＮＴ２基因的克隆及表达研究

李兆阳，　杨 葳，　董婉维，　周生来，　吕相川，　于 洋，　王 惟，　郑志红（中国医科大学实验动物部辽宁省实验动物转基因重点实验室，　沈阳１１０００１）

［摘要］ 目的 克隆大鼠心脏ＴＮＮＴ２基因，研究其表达情况。方法　以成年ＳＤ大鼠心脏为实验

材料，提取其总ＲＮＡ并反转录；根据Ｇｅｎｅｂａｎｋ中提供的大鼠ＴＮＮＴ２基因ｃＤＮＡ序列，利用ＰＣＲ方法扩增此序列，并进行表达研究。结果　克隆了大鼠心脏ＴＮＮＴ２基因ｃＤＮＡ全长，反转录后克隆出ＴＮＮＴ２　ｃＤＮＡ全长并与Ｇｅｎｅｂａｎｋ中提供的序列对比发现了新的ｃＮＤＡ序列，递交至Ｇｅｎｅｂａｎｋ数据库，登陆号为：　ＥＵ２９５５２７。组织表达谱研究表明ＴＮＮＴ２基因在大鼠心脏、肾、肝、脾、肺、肌肉中均有表达，以心脏中表达最高（Ｐ＜０．０５）。结论　首次克隆了大鼠ＴＮＮＴ２　ｃＤＮＡ，Ｇｅｎｅｂａｎｋ登陆号：　ＥＵ２９５５２７。ＴＮＮＴ２基因在多种组织中有表达，在心脏中表达最高。［关键词］　大鼠；　ＴＮＮＴ２；　肥厚性心肌病

［中图分类号］　Ｑ７５２ ［文献标识码］　Ａ ［文章编号］　１００４－８４４８（２００８）０６－０３７７－０５

［收稿日期］　２００８－０９－０５［基金项目］　辽宁省科学技术厅攻关基金（２００６４０８００１－１）；

辽宁省重点实验室专项资金［辽科发（２００５）３６号］［作者简介］　李兆阳（１９８２－），　男，　讲师，

　Ｅ－ｍａｉｌ：　ｌｉｚｈａｏｙａｎｇ１０１６＠１６３．ｃｏｍ

［通讯作者］　郑志红，　Ｅ－ｍａｉｌ：　ｚｈｉｈｏｎｇｚｈｅｎｇ＠１６３．ｃｏｍ

心肌肌钙蛋白Ｔ（ｃａｒｄｉａｃ　ｔｒｏｐｏｎｉｎ　Ｔ，　ｃＴｎＴ）是调节心脏肌肉收缩的肌钙蛋白复合体组成之一，负责使复合体与肌凝蛋白结合，协调肌丝的Ｃａ２＋浓度依赖性ＡＴＰ酶活性，从而在心肌细胞收缩和舒张过程中发挥作用［１］。肥厚型心肌病（ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ，　ＨＣＭ）病例中，基因缺陷占发病的５０％［２］，ＴＮＮＴ２基因突变引起的ＨＣＭ约占５％～１０％。目前ＴＮＮＴ２转基因小鼠模型已经应用到了对ＨＣＭ的研究中，而转基因大鼠模型尚处于研究阶段，本实验克隆大鼠ＴＮＮＴ２基因并研究其表达情况，为进一步研究ＴＮＮＴ２基因功能及其表达调控的分子机制奠定了基础。

１ 材料与方法

１．１ 材料

ＳＰＦ级成年ＳＤ大鼠１只，来自中国医科大学实验动物部［ＳＣＸＫ（辽）２００３－０００９］，总ＲＮＡ提取试

剂ＴＲＩｚｏｌ　Ｒｅａｇｅｎｔ（ＣＩＢＣＯＢＲＬ公司），ｃＤＮＡ双链合成试剂盒（Ｐｒｏｍｅｇａ公司），引物合成和ＤＮＡ测序（上海英骏生物技术有限公司），ＰＣＲ产物纯化试剂盒及胶回收纯化试剂盒（Ｔａｋａｒａ公司），Ｔ４　ＤＮＡ　连接酶（Ｐｒｏｍｅｇａ　公司），大肠杆菌ＤＨ５α感受态细胞为本实验室保存，质粒筛选试剂ＩＰＴＧ　Ｘ－ｇａｌ（Ｔａｋａｒａ公司），ＤＮＡ　聚合酶和限制性内切酶（Ｔａｋａｒａ公司），质粒ＤＮＡ快速抽提纯化试剂盒、琼脂糖（Ｔａｋａｒａ公司），ＬＢ培养基、胰蛋白胨和酵母提取物（Ｓｉｇｍａ公司）。

１．２ 方法

１．２．１ 引物设计 根据Ｇｅｎｅｂａｎｋ提供的大鼠ＴＮＮＴ２基因ｃＤＮＡ序列，用Ｐｒｉｍｅｒ５软件设计引物Ｔ１，高保真酶扩增ＴＮＮＴ２基因ｃＤＮＡ全长。上游引物：ＴＧＡＧＧＣＴＧＡＧＣＡＧＡＣＡＣＣ，下游引物：ＡＡＧＧＧＣＡＣＡＧＧＣＡＡＧＧＡ，　预期扩增片段９９７　ｂｐ。１．２．２ 大鼠ＴＮＮＴ２基因的克隆及鉴定

１．２．２．１ 心脏总ＲＮＡ的提取及含量和浓度测定 按照《分子克隆》提供的方法提取总ＲＮＡ，取少量ＲＮＡ进行含量和纯度测定，其余分装后－７０℃冰箱保存。

１．２．２．２ ＲＴ－ＰＣＲ （１）ｃＤＮＡ第一链合成　用反转录试剂盒将总ＲＮＡ反转录成ｃＤＮＡ第一链，反应体系２０　µｌ，程序：４２℃，６０　ｍｉｎ；９９℃，５　ｍｉｎ；

４℃，５　ｍｉｎ。产物－２０℃冻存备用。（２）ＰＣＲ扩增大鼠心脏ＴＮＮＴ２基因，以Ｔ１为引物，大鼠心脏组织ＲＮＡ反转录产物为模板，扩增ＴＮＮＴ２　ｃＤＮＡ全长。ＰＣＲ反应条件：９５℃预变性５　ｍｉｎ，９５℃变性１　ｍｉｎ，６０℃退火１　ｍｉｎ，７２℃延伸１　ｍｉｎ，共３０个循环，７２℃延伸１０　ｍｉｎ。ＰＣＲ产物经１％琼脂糖凝胶电泳确认，应用胶回收试剂盒回收、纯化目的片段，－２０℃冻存备用。

１．２．２．３ ＰＣＲ产物的克隆与测序 （１）按照《分子克隆》进行载体连接反应及质粒转化反应；　（２）按照质粒小提试剂盒说明书进行质粒提取；　（３）阳性克隆酶切鉴定，　ＳａｃⅠ酶切，　由于有两个酶切位点，　可形成两个片段。３７℃过夜，　１％琼脂糖凝胶电泳观察结果，　挑取酶切片段大小与预期相符的克隆测序鉴定。１．３ 组织表达谱分析

以Ｔ１为引物，　前期冻存大鼠各组织ｃＤＮＡ为模板，　半定量ＰＣＲ扩增，　１％琼脂糖凝胶电泳检测ＴＮＮＴ２基因在大鼠各组织中的表达。

１．４ 统计学方法

应用Ｃｈｅｍｉｌｍａｇｅｒ　５５００ｖ２０３软件进行灰度值半定量分析。

２ 结果

２．１ 大鼠各脏器总ＲＮＡ含量和纯度测定

详见表１。２．２ ＰＣＲ扩增

产物经琼脂糖凝胶电泳检测为单一条带，片段长度约９００　ｂｐ，和预期基本相符（图１），胶回收纯化后（图２）连接到ｐＧＥＭ－Ｔ载体上，酶切鉴定后的电泳结果与预期相符（图３），挑取阳性克隆，测序验证，ＴＮＮＴ２基因ｃＤＮＡ全长８６７　ｂｐ（图４）。

表１ 紫外分光光度计测定ＯＤ值　Ｔａｂｌｅ　１ UV determination of OD

　脏器

比值Rat io 浓度Ｏｒｇａｎ

ＯＤ２６０ ＯＤ２８０ （ＯＤ２６０／ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ＯＤ２８０） ／　ｇ・Ｌ－１脏　Ｈｅａｒｔ ０．６４０ ０．３３８ １．８９ ２．５６肝脏　Ｌｉｖｅｒ ０．９９７ ０．５３８ １．８５ ３．９８脾脏　Ｓｐｌｅｅｎ ０．６２５ ０．３４３ １．８２ ２．５０肺脏　Ｌｕｎｇ ０．６５５ ０．３５０ １．８７ ２．６２肾脏　Ｋｉｄｎｅｙ ０．７２５ ０．３８３ １．８９ ２．９５肌肉　Ｍｕｓｃｌｅ ０．４０５ ０．２２３ １．８１ １．６２

２．３ 核酸及蛋白序列分析

利用ＮＣＢＩ提供的非重复性数据库（ＢＬＡＳＴ／Ｎ）对获得的ＴＮＮＴ２　ｃＤＮＡ序列进行了分析。结果显示其与Ｇｅｎｅｂａｎｋ提供序列（ＢＣ１６１８５５）的同源性达９６．７％，缺少第５１到８０　ｂｐ碱基序列，比提供的序列少了３０个碱基，说明ｍＲＮＡ实际剪切位点与Ｇｅｎｅｂａｎｋ提供不同，由ｃＤＮＡ序列与大鼠基因组序列对比结果可见：大鼠ＴＮＮＴ２基因全长１２　ｋｂ，包括１５个外显子和１４个内含子，所有内含子／

外