第二章 植物组织培养快速繁殖

第二章：植物组培培养快速繁殖

目的要求：

1.掌握组织培养实验室的设计；掌握组织培养常用的实验仪器设备及其使用方法；

2.掌握培养基的种类、特点；掌握基本培养基的配方；一般掌握培养基的组成成分和适宜的剂量；掌握培养基母液和常用培养基的配制方法和步骤；熟练掌握培养基的灭菌方法；一般掌握培养基的筛选办法。

3.了解组培快繁的类型，重点掌握无菌培养物的建立。

4.掌握植物组培快繁中常见问题的解决措施。

教学重点、难点：基本培养基的配方；培养基母液和常用培养基的配制方法和步骤；培养基的灭菌方法；培养基的筛选办法。

第一节植物组培快繁的工厂化生产设施

在进行植物组织培养工作之前，首先应对工作中需要哪些最基本的设备条件有个全面的了解，以便因地制宜地利用现有房屋，或新建、改建实验室。实验室的大小取决于工作的目的和规模。以工厂化生产为目的，实验室规模太小，则会限制生产，影响效率。在设计组织培养实验室时，应按组织培养程序来设计，避免某些环节倒排，引起日后工作混乱。植物组织培养是在严格无菌的条件下进行的。要做到无菌的条件，首先需要一定的设备、器材和用具。

一个标准的组织培养实验室应当包括：普通实验室（洗涤室、培养基配制室）、无菌接种室、恒温培养室、观察培养情况并作记录的细胞学实验室等。在实际中可结合可行条件，合并一部分。实验室的大小和设置可根据自己的工作性质和规模自行设计，其中最主要的是无菌操作室和恒温培养室。

一、植物组培快繁场地设计

（一）组培快繁场地的选择

无菌环境，周围安静、无污染，阳光充足，无高大建筑物遮挡，交通便利。

（二）组织快繁厂房的设计

1.药品贮藏间

面积10~15m2，需终年保持相对较低的温度和较好的通风干燥条件，同时需要遮光。

2.药品配制间

面积15m2左右，需抗盐酸、牢固、平稳，具有较好抗震性的试验台。

3.玻璃器皿洗涤间（cleaning room）

面积20m2左右，本室主要用于组织培养所需玻璃器皿等仪器的清洗、干燥和贮存。室内应配备大型水槽，最好是白瓷水槽。为防止碰坏玻璃器皿，可铺垫橡胶。上下水道要畅通。备有塑料筐，

用于运输培养器皿。备有干燥架，用于放置干燥涮净的培养器皿。

4.培养基制作间

面积3m2培养基配制室则负责培养基的配制、分装、包扎和高压灭菌等工作。为完成培养基的制备工作，该室还应配备以下仪器设备：

1）大型工作台：其高度应方便配制工作。

2）药品柜：用于放置常用药品。

3）普通冰箱：主要用于贮存母液、各种易变质、易分解的化学药品以及植物材料等。

4）电子分析天平和托盘天平电子分析天平：

用于称取大量元素、微量元素、维生素、激素等微量药品精确度为0.0001g；托盘天平用于称取用量较大的糖和琼脂等，其精确度为0.1g。天平应放置在干燥、不受震动的天平操作台上。

5）电蒸馏水器

电蒸馏水器，采用硬质玻璃或金属制成。蒸馏水用于配制母液或培养基，配制培养基可用自来水来代替，若实验要求严格的话，则须用蒸馏水。

6）磁力搅拌器

磁力搅拌器用于加速搅拌难溶的物质，如各种化学物质、琼脂粉等。磁力搅拌器还可加热，使之更利于溶解。

7）恒温水浴锅

恒温水浴锅用于难溶药品的溶解、琼脂的溶化等。

8）电炉或电饭锅

电炉的功率为1500或2000W，并配有铝锅。电饭锅的功率1000W，用于琼脂的溶化。

9）酸度计

组织培养中培养基pH值的准确度是十分重要的，应当使用酸度计，若无酸度计，也可使用pH 试纸进行粗测。

首次使用酸度计前，应用标准液调节定位，然后固定。测量pH值时，待测液必须充分搅拌均匀。如果培养基温度过高，测量时要调整pH值计上的温度扭使之和培养基温度相当。注意保护好玻璃电极，用后电极应用蒸馏水冲洗净，盖上电极帽。

10）培养基分装设备

小型操作时可采用烧杯直接分装。大型实验室可采用医用“下口杯”作为分装工具，在“下口杯”的下口管上套一段软胶管，加一弹簧止水夹，使用时非常合适。更大规模或要求更高效率时，可考虑采用液体自动定量灌注设备。

11）烘箱

用于干燥洗净的玻璃器皿，也可用于干热灭菌和测定干物重。用于干燥需保持80-100℃；进行干热灭菌需保持150℃，达1-3h；若测定干物重，则温度应控制在80℃烘干至完全干燥为止。12）盛装器皿

用于药品的溶解、贮备、熔化等，如烧杯、试剂瓶等。

13）计量器皿

母液的配制、药液的分装、吸取等，如10ml、25ml、50ml、100ml、200ml、500ml、1000ml 的量筒，25ml、50ml、100ml、200ml、500ml、1000ml、2000ml的容量瓶，0.1ml、0.2ml、0.5ml、1ml、5ml的移液管。

14）过滤器械

如细菌过滤器，用于不耐高温物质（玉米素、吲哚乙酸、某些维生素等）的过滤。

15）其他器皿

滴瓶、称量瓶、玻璃棒、漏斗、玻璃管、注射器等实验室常备器皿。

5.消毒灭菌操作间

面积在30m2左右，主要仪器有高压灭菌锅，用于进行培养基和器械用具的灭菌。小规模实验室可选用小型手提式高压灭菌锅。如果是连续的大规模生产，应选用大型立式的或卧式的高压灭菌锅。通常以电作能源。

6.试管苗无菌转接操作间（transfering room）

接种室是进行植物材料的分离、消毒、接种及培养物转移的一个重要操作室。其无菌条件的好坏对组织培养成功与否起重要作用。

在工作方便的前提下，接种室宜小不宜大，一般40-50m2，要求地面、天花板及四壁尽可能密闭光滑，易于清洁和消毒。除通风口、入口外，均应密封。配置拉动门，以减少室内外空气的对流，污染室内环境。

接种室要求干爽安静，清洁明亮。在适当位置吊装1-2盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。最好安装一小型空调，使室温可控，这样可使门窗紧闭，减少与外界空气对流。

接种室应设有缓冲间，面积2m2为宜。室内放置有工作服、工作帽、拖鞋等物品，进入无菌操作室前在此更衣换鞋。缓冲间可使工作人员进入无菌操作室之前有一个过渡，最好安一盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌，，以减少工作人员进出时带人接种室杂菌。

工作前，工作台用2%的新解洁尔灭擦洗，无菌室内的紫外灯要照射20分钟，室内应定时用消毒药品消毒（①每平方米需2毫升与过量的高锰酸钾混合产生的蒸汽消毒；②70%的酒精或0.5%苯酚喷雾降尘、消毒）。

接种室的主要设备及用具有：