酚二黄酸比色法测土壤硝态氮含量

土壤硝态氮的测定--酚二黄酸比色法

一、方法原理

土壤浸提液中NO3--N在蒸干无水的条件下能与酚二磺酸试剂作用，生成硝基酚二磺酸：

C6H3OH(HSO3)2 + HNO3→ C6H2OH(HSO3)2NO2 + H2O

2，4-酚二磺酸6-硝基酚-2，4-二磺酸此反应必须在无水条件下才能迅速完成，反应产物在酸性介质中无色，碱化后则为稳定的黄色溶液，黄色深浅与NO3--N含量在一定范围内成正相关，可在400-425nm处（或用蓝色滤光片）比色测定。酚二磺酸法的灵敏度很高，可测出溶液中0.1mg/L NO3--N，测定范围为0.1-2mg/L。

二、主要仪器

分光光度计、水浴锅、瓷蒸发皿

三、试剂

CaSO4·2H2O（分析纯、粉状）、CaCO3（分析纯、粉状）、Ca（OH）2（分析纯、粉状）、MgCO3（分析纯、粉状）、Ag2SO4（分析纯、粉状）、1:1NH4OH、活性炭（不含NO3-）。

酚二磺酸试剂：称取白色苯酚（C6H5OH，分析纯）25.0g置于500ml三角瓶中，以150ml纯浓硫酸溶解，再加入发烟硫酸75ml，并置于沸水浴中加热2h，可得酚二磺酸溶液，储于棕色瓶中保存。使用时须注意其强烈的腐蚀性。如无发烟硫酸，可用酚25.0g，加浓硫酸225ml，沸水浴中加热6h配成。试剂冷后可能析出结晶，用时须重新加热溶解，但不可加水，试剂必须贮于密闭的玻塞棕色瓶中，严防吸湿。

10 μg/ml NO3--N标准溶液：准确称取KNO3（二级）0.7221g溶于水，定容1L，此为100 μg/ml NO3--N溶液，将此溶液准确稀释10倍，即为10μg/ml NO3--N 溶液。

四、操作步骤

（1）浸提。称取新鲜土样50g放在500ml三角瓶中，加入CaSO4·2H2O 0.5g 和250ml水，盖塞后，用振荡机振荡10min。放置5min后，将悬液的上部清液用干滤纸过滤，澄清的滤液收集在干燥洁净的三角瓶中。如果滤液因有机质而呈现颜色，可加活性炭除之。

（2）测定。吸取清液25-50ml（含NO3--N 20-150μg）于瓷蒸发皿中，加CaCO3约0.05g，在水浴上蒸干，到达干燥时不应继续加热。冷却，迅速加入酚二磺酸试剂2ml，将皿旋转，使试剂接触到所有蒸干物。静止10min使其充分作用后，加水20ml，用玻璃棒搅拌直到蒸干物完全溶解。冷却后缓缓加入1:1 NH4OH并不断搅拌混匀，至溶液呈微碱性（溶液显黄色）再多加2ml，以保证NH4OH试

剂过量。然后将溶液全部转入100ml容量瓶中，加水定容。在分光光度计上用光径1cm比色杯在波长420nm处比色，以空白溶液作参比，调节仪器零点。

NO3--N工作曲线绘制：分别取10 μg/ml NO3--N标准溶液0、1、2、5、10、15、20ml于蒸发皿中，在水浴上蒸干，与待测液相同操作，进行显色和比色，绘制成标准曲线，或用计算器求出回归方程。

五、计算

土壤中NO3--N含量（mg/kg）=ρ(NO3--N)×V×ts/m

式中：

ρ（NO3--N）------从标准曲线上查得（或回归所求）的显色液NO3--N质量浓度（μg/ml）；

V------显色液的体积（ml）；

ts------分取倍数；

m------烘干样品质量，g。

注释：

注1:硝酸根为阴离子，不为土壤胶体吸附，且易溶于水，很易在土壤内部移动，在土壤剖面上下层中移动频繁，因此测定硝态氮时应注意采样深度。即不仅要采集表层土壤，而且要采集心土和底土，采样深度可达40cm、60cm以致120cm。试验证明，旱地土壤上分析全剖面的硝态氮含量能更好地反映土壤的供氮水平。和表层土壤比较，则全剖面的硝态氮含量与生物反应之间有更好的相关性，土壤经风干或烘干易引起NO3--N变化，故一般都用新鲜土样测定。

注2：用酚二磺酸法测定硝态氮，首先要求浸提液清彻，不能混浊，但是一般中性或碱性土壤滤液不易澄清，且带有机质颜色，为此在浸提液中应加入凝聚剂。凝聚剂的种类有很多，有CaO、Ca(OH)2、CaCO3、MgCO3、KAl(SO4)2、CuSO4、CaSO4等，其中CuSO4有防止生物转化的作用，但在过滤前必须以氢氧化钙或碳酸镁除去多余的铜，因此以CaSO4法提取较为方便。

注3：如果土壤浸提液由于有机质而有较深的颜色，则可用活性炭除去，但不宜用H2O2，以防最后显色时反常。

注4：土壤中的亚硝酸根和氯离子是本法的主要干扰离子。亚硝酸和酚二磺酸产生同样的黄色化合物，但一般土壤中亚硝酸含量极少，可忽略不计。必要时可加少量尿素、硫尿和氨基磺酸(20g/LNH2SO3H)以除去之。例如亚硝酸根如果超出了1μg/ml时，一般每10ml待测液中加入20mg尿素，并放置过夜。以破坏亚硝酸根。

检查亚硝酸根的方法：可取待测液5滴于白瓷板上，加入亚硝酸根试粉0.1g，用玻璃棒搅拌后，放置10min，如有红色出现，即有1mg/L亚硝酸根存在。如果红色极浅或无色，则可省去破坏亚硝酸根手续。

NO3-+3Cl-+4H+→NOCl+Cl2+H2O

亚硝酰氯

Cl-对反应的干扰，主要是在加酸后生成亚硝酰氯化合物或其它氯的气体。如果土壤中含氯化合物超过15mg/kg，则必须加Ag2SO4除去，方法是每100ml 浸出液中加入Ag2SO4 0.1g(0.1gAg2SO4可沉淀22.72mgCl-)摇动15min，然后加入Ca(OH)2 0.2g及MgCO3 0.5g，以沉淀过量的银，摇动5min后过滤，继续按蒸干

显色步骤进行。

注5：在蒸干过程中加入碳酸钙是为了防止硝态氮损失。因为在酸性和中性条件下蒸干易导致硝酸离子的分解，如果浸出液含铵盐较多，更易产生负误差。

注6：此反应必须在无水条件下才能完成，因此反应前必须蒸干。

注7：碱化时应用NH4OH，而不用NaOH或KOH，是因为NH3能与Ag+络合成水溶性的[Ag(NH3)2]+，不致生成Ag2O的黑色沉淀而影响比色。

注8：在蒸干前，显色和转入容量瓶时应防止损失。