代谢组学概述

除了核磁共振NMR和普通的GC/MS、LC/MS之外，用于代谢组学的分 析技术还有气相色谱-飞行时间质谱、超高效液相色谱-飞行时间质谱、 傅里叶变换质谱、傅立叶离子回旋共振-质谱和毛细管电泳-质谱联用 等。由于代谢产物和生物体系的复杂性，至今为止，尚无一种能满足 所有要求的代谢组学分析技术 。只有通过组合不同的分析技术才能够 比较全面准确地测定代谢组内容。
文献中常用的代谢物数据库
研究背景与意义—应用
疾病诊断 系统毒理 学 药物研发 与评价
代谢组学 应用
微生物和 植物研究 营养代谢 组学 中药现代 化研究
研究背景与意义—原理
毒物与细胞或 组织相互作用 内源性代谢物 质比例、浓度 变化 轻微时，与体 液交换组成进 行代谢调控
剧烈时，动态 平衡彻底丧失， 体液中出现毒 性生物标志物
实验 对象
贻贝等软 体动物
斑马鱼、 虹鳟鱼等 鱼类
水稻、 拟南芥等 陆生植物
研究流程—样本来源
样本来源
体液
血、尿、唾液、 眼泪、精液、 羊水、脑脊液 以及各种腺体 的分泌液(胆汁、 胰液、肠液)
组织
心、肝、 脾、肺、 肾、肌肉、 骨骼、脊 髓、脑组 织
细胞
动植物细 胞、酵母 细胞、细 菌、真菌、 病毒个体
研究流程—数据预处理
NMR数据包含了化学位移和 谱峰强度的信息。可采用仪 器自带的TOPSPIN软件进行 手动调相和基线校正，化学 位移以内标物定标。对一定 区间的谱图用极窄的分段进 行分段积分或完整输出，同 时，去除包含提取溶剂和内 标峰的区间，然后将积分表 输出到文本文件。
GC/MS和LC/MS数据包含了 保留时间、离子的质荷比m/z 以及谱峰强度的信息。可用 XCMS数据包对得到的总离子 流图谱进行峰匹配，峰识别 及峰对齐操作，并从中提取 有效数据。
对基因、mRNA、蛋白质的研究催生了基因组学、转录 组学、蛋白质组学。这些组学描述的内容是可能发生的 事件，受到诸多环境、饮食、年龄等因素的影响，且会 有平衡和反馈机制，这些可能的事件并不一定发生。
小分子的产生和代谢才是这一系列事件的最终结果； 其它组学所起的改变会在代谢层面放大，更灵敏； 代谢物结构与功能清楚，数量少，更容易解释其机理变化。
代谢组学概述
目录
1 背景、概念和意义 2 研究对象
汇 报 内 容
3 样品预处理与提取 4 代谢物检测技术 5 数据处理方法
6 研究计划
背景 概念 意义
研究背景与意义—优势
传统毒理学实验耗时、难以进行高通量研究，毒性终点 单一、难以确定毒性作用机制，多研究致死效应，难以 研究低浓度暴露的影响与长期效应。
应用现代分析 手段定性和定 量研究内源性 代谢产物
识别毒物靶标、 剂量关系、毒 性作用机制和 生物标志物
分析生物体内 在毒物作用前 后代谢产物图 谱的变化
研究流程
研究流程
样品 制备
• 进行动物实验，收集生物体 液和组织样本，进行样品预 处理与提取。
代谢物 检测
• 用高通量，高分辨率，高重复性的谱 学手段，如核磁共振NMR、液质联用 LC/MS、气质联用GC/MS等进行检测。
数据 • 峰匹配，基线矫正，积 分，归一化，标度化 预处理 多元数 据分析
模式识别和统计分析，如 PCA、PLS-DA、OPLS-DA等。
结果 解释
解析与机体生理病 理有关的生化过程。
研究流程—实验对象
人类与鼠 类等陆生 脊椎动物 端足虫等 节肢动物
应用 较多
蚯蚓等陆 生无脊椎 动物
浮萍等水 生植物
其它
粪便等
血液被认为是最具研究价值的一种体液，含有多种代谢物，能够较为 全面反映生物体的代谢状况。尿液与肾有着密切联系，同时机体代谢、 疾病等情况，也会造成尿液中化学组成的改变。肝是进行代谢的主要 场所。因此血、尿、肝组织的整合分析在代谢组学研究中发挥着重要 作用。
研究流程—样品预处理与提取
快速淬灭
分析的结果以得分图表示样本的分离聚合情况，以载荷图表示样本之间分 类的差异变量。将载荷图与得分图对应起来看，就可以发现在与样本分类 聚集相应的方向上，那些离原点越远的变量（相应的权重系数也越大）， 对分类的贡献越大。将这些变量所对应的谱峰与代谢物数据库进行比较确 定它是什么代谢物，进而推断机制，并有可能找到生物标志物。
为避免由于残 留酶活性或氧 化还原过程降 解代谢源自文库物和 产生新的代谢 产物，通常需 对所收集样品 进行快速淬灭， 灭活的方法很 多，如液氮冷 冻、酸处理等。
其它预处理
直接或冷冻干 燥后保存于80℃。提取前 体液样品一般 要离心，组织 样品一般要匀 浆。
提取
用水和有机溶 剂共同提取， 以分别获得亲 脂相和极性相 代谢物。推荐 甲醇/氯仿/水 （2/2/1.8）分 两次添加或乙 腈/甲醇/水 （2/2/1）一次 性添加。
神经网络
为了在差异较为 细小时获得更为 准确的结果，偏 最小二乘法-判 别分析PLS-DA 根据样本间的预 设分类标准来统 计与建模。 OPLS-DA是先 采用滤噪技术正 交信号校正来滤 掉由与实验目的 不相关的因素所 引起的代谢变化 再进行PLS-DA。 还需要验证模型 的有效性和显著 性。
研究流程—多元数据分析
研究流程—检测技术
提高NMR 灵敏度 分析注 意事项 GC/MS 衍生化
使用超高磁场强度的核磁共振波谱 仪、使用冷冻到4.5 K的探针、使用 二维核磁技术、用CPMG（Carr– Purcell–Meiboom–Gill）自旋回波序 列消除蛋白质类大分子物质的干扰
主要衍生化试剂是硅烷化试剂 MSTFA和BSTFA，三甲基氯硅 烷可用作衍生化催化剂，常溶 于吡啶中
研究流程—检测技术
常用的代谢组学分析技术比较
方法
NMR
优点
样品处理简单、无损伤性、测试手 灵敏度低 段丰富、定性与定量分析、无偏向 性、分析快速
缺点
GC/MS 高分辨率、高灵敏度、重复性好、 需衍生化、选择性分析、 具备完整的数据库、分析成本较低 定量不够准 LC/MS 高灵敏度、动态范围宽、样品处理 破坏性、选择性分析、 简单、分析成本较低 定量不够准、基质干扰、 无数据库
导 出
归 一 化 标 度 化
不同实验个体之间的差异可能较大，从而导致分析结果的偏差。 因此需要归一化来消除这种系统偏差。通常采用的方法是谱峰 总积分的归一化、肌酐浓度归一化和概率商归一化。 在生物样本中，并不是浓度高的代谢物其对生物体系的影响就一 定大。因此在数据分析时对浓度大小不同的代谢物要一视同仁。 通常是采用单位方差缩放或Pareto缩放，即将每个变量的数据点 除以其标准偏差或标准偏差的平方根。
研究流程—结果解释
代谢组学研究的目的之一就是了解各种小分子在生物体内的生物功 能、代谢途径与网络。目前代谢组学研究尚未有功能完备的数据库。 数据库名 KEGG 网址 说明 http://www.genome.jp/keg 关于代谢调节和通路的数据库 g/ligand.html HMDB http://www.hmdb.ca 人体低分子质量代谢物数据库 MetaCyc http://metacyc.org 关于代谢物的数据库，包括超过 150种生物体中的各种代谢途径 LipidSearch http://www.lipidsearch.jp 脂类代谢物数据库 http://www.metabolome.jp Metcore http://www.genego.com 人类信号表达、调控以及代谢物 的生物通路数据库 UMBBD http://umbbd.msi.umn.edu 微生物生物催化反应和生物降解 通路
研究流程—多元数据分析
PCA应用最广泛， 其将复杂的数据 降到一个低维空 间，以分类图的 形式显示出来， 能够获得研究对 象的可视化总览， 而不受其他人为 因素的影响。
模式识别方法
非监督方法 监督方法
主成分分析
PLS-DA或 OPLS-DA
系统聚类分析
软独立建模分 类法
非线性映射
k-最近邻法
SIMCA-P (Umetrics AB, Umeå , Sweden)
研究背景与意义—基本概念
代 谢 组
代 谢 组 学 代环 谢境 组 学
一个细胞、组织、器官或者一个生物体中在 某一特定状态下的所有内源性小分子代谢产 物的集合，如氨基酸、糖、有机酸、脂肪酸、 核苷、核苷酸等。 研究生物体系受外部刺激所产生的所有代谢 产物变化的科学，反映的是外界刺激或遗传 修饰的细胞或组织的代谢应答变化。 利用代谢组学技术探讨生物有机体与生态环 境之间相互作用的一门学科，着重于研究生 物体应对环境影响因素的代谢变化。
研究背景与意义—相关分类
代谢物靶 标分析 代谢轮廓 分析 代谢指纹 分析 代谢 组学
对少数所预设的一些代谢产物的定量分析
代 谢 产 物 分 析
对少数所预设的一些代谢产物的定量分析
定性并半定量分析生物样品中全部代谢 物 对限定条件下的特定生物样品中所有代谢 组分进行定性和定量
只有第4层次才是真正意义上的代谢组学研究。目前， 代谢组学的最终目标还是不可完成的任务。