电喷雾串联质谱图的叠合与多肽序列分析

ISSN 0582 9879

生物化学与生物物理学报

ACTA BIOCHIM ICA et BIOPH YS ICA S INICA 2001,33(6):665-670

CN 31 1300/Q

收稿日期:2001 05 14 接受日期:2001 06 29国家自然科学基金重大项目资助,No.39990600

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电喷雾串联质谱图的叠合与多肽序列分析

王贤纯 梁宋平*

(湖南师范大学生命科学学院,长沙410081)

摘要 利用离子阱电喷雾串联质谱仪,在选择性改变某些仪器参数的条件下对模式分子M et 脑啡肽和自行固相化学合成的7肽及其修饰产物、10肽和20肽进行碎裂处理,从而获得一系列具有一定差异的串联质谱图。选择具有适当互补性的图谱进行叠合处理,得到具有连贯性 三联套 (triplet)及 二联套 (doublet )碎片离子峰的叠合串联质谱图,据此可以方便准确地解析出多肽的氨基酸序列。实验结果表明,这种方法在多肽的质谱法测序中具有一定的实用性。

关键词 串联质谱;序列测定;图谱叠合;多肽

研究未知蛋白质的结构与功能时,首先要做的工作之一是测定其氨基酸序列。随着蛋白质组学研究的开展和不断深入,以Edman 降解为基础的传统测序方法已难以适应蛋白质结构研究的微量测序要求。利用 软 电离技术的串联质谱具有测序功能,能在微量乃至超微量水平准确快速地进行蛋白质多肽的氨基酸序列分析,从而在蛋白质组学研究中成为鉴定蛋白质的关键技术之一[1~3]

。

通过串联质谱图的解析推断蛋白质多肽氨基酸序列的基本方法之一,是在串联质谱图中找到连续的 三联套 (triplet)及 二联套 (doublet)系列碎片离子峰:A n 、B n 和C n ,X n 、Y n 和Z n ,同系列中相邻成套碎片离子峰间的质量数之差即代表一个氨基酸残基

[4,5]

。然而,多肽的碎裂化学是复杂的,

常常在形成系列碎片离子峰时出现 缺口 ,从而给

串联质谱图的解析带来困难。

进行串联质谱实验时发现,适当调节某些仪器参数(如激发电压)的大小,可以得到具有一定差异的串联质谱图。这些图谱在碎片离子峰的多少和信号强弱的分布区域等方面具有一定的互补性,提示可以有选择地将它们叠合起来进行分析,从而达到易化串联质谱图的解析和提高多肽氨基酸序列推测准确性的目的。本研究首先利用M et 脑啡肽作模式分子,探讨串联质谱图的叠合与解析的一般方法,然后用同样的方法对固相化学合成多肽进行序列鉴

定,以检验该方法的实用性。

1 材料和方法(M aterials and M ethods)

1.1 材料

三氟乙酸(TFA)购自Eastman 公司;M et 脑啡肽购自Sig ma 公司;乙腈(ACN)和冰醋酸分别为国产色谱纯和分析纯试剂;7肽、10肽和20肽均为本实验室用固相法化学合成。1.2 方法

1.2.1 样品液制备 将多肽样品溶于乙腈 水 冰醋酸(50 50 0.2)溶液中,浓度约为10-5mol/L 。1.2.2 质谱分析 多肽样品的质谱分析在美国Bruker 公司生产的Esquire LC 离子阱电喷雾质谱仪上进行。正离子方式检测,离子电荷控制(ICC),碰撞气为氦气。采用注射泵直接进样,流速为200 l/h 。喷雾器压力15psi,干燥气(N 2)流速5.0L/min,干燥气(N 2)温度300 ,离子阱驱动55.0,平均数5,滚动数5,扫描范围50~2200m /z ,在上述各主要参数固定的前提下,改变激发电压等参数,获得一系列串联质谱(MS/MS)图,以轮廓谱的形式储存。

1.2.3 MS/M S 图的叠合与解析 选择谱峰互补性较好的MS/MS 图,利用Bruker DataAnalysis 软件处理得到适宜的MS/MS 叠合图;利用软件中的Find Masslist 功能列出所有谱峰的m /z 值;截去下部的背景峰,先在上部的碎片离子峰中按B n +Y m -n =(M +H )++1(m 为多肽残基总数)的规律寻找成对的B n 和Y n 峰,然后按A n 、B n 、C n

Table 1 Peaks distribution of No.1,No.3,No.6and superimposed MS/MS spectra of methionine enkephalin

A1B1C1

A2B2C2

A3B3C3

A4B4C4Z1Y1X1Z2Y2X2Z3Y3X3Z4Y4X4(M +H)+

No.1No.3No.6SI * *

*,A3+1;

SI,superimposed

spectrum of No.1,No.3

and No.

6.

Fig.1 MS/MS spectra and analyzed amino acid sequence of methionine enkephalin

和X n 、Y n 、Z n 的形成规律搜寻 三联套 及 二联套 碎片离子峰(先用第一种方法寻找可筛掉相当一部分谱峰,减少搜寻 三联套 及 二联套 碎片离子

峰的工作量),并适当结合其他一些特殊碎片离子峰提供的结构信息进行综合分析;最后利用软件的Annotation 和Comment 等功能解析和标记叠合的

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A CT A BIOCH IM ICA et BIOPHY SI CA SIN ICA

Vol.33,No.6

串联质谱图,推断和验证出多肽的氨基酸序列。2 结果(Results)

2.1 Met 脑啡肽的MS/MS 分析

不断加大激发电压,对Met 脑啡肽(H 2N YG GFM COOH,M r 573.67)进行碎裂处理,获得一系列MS/MS 质谱图。根据图谱峰的互补情况,利用Bruker DataAnalysis 软件将M et 脑啡肽的1、3、6号M S/MS 图叠合。各图谱中主要碎片离子峰分布情况见表1。

从表1可以看出,尽管M et 脑啡肽的各单一M S/MS 图所含有的碎片离子峰不完全 成套 ,但叠合后组成了若干个连续的 三联套 及 二联套 碎片离子峰。叠合处理带来的不仅是峰的 有 、 无 互补,还有 强 、 弱 互补,从而可以快捷准确地分析Met 脑啡肽的氨基酸序列(图1)。2.2 合成7肽及其修饰产物的质谱鉴定

固相化学合成7肽的序列为H 2N YVNTNMG COOH (M r 797.90)。合成粗品经RP HPLC 纯化后,主峰物质的MS 分析结果见图2。

图2显示,主峰物质的m/z 值(M +H )+为798.89,与目的肽理论分子量很接近,提示该合成产物可能即为所要合成的7肽,但需对其氨基酸序列进行鉴定。在得到的一系列MS /MS 图谱中

,

Fig.2 ESI mass spectrum of the chemically synthesized hep tapeptide

利用Bruker DataAnalysis 软件将互补性较强的2号、16号和18号MS/MS 图谱叠合,然后按照实验方法中叙述的方法进行解析。结果表明,可在其M S/M S 叠合图中分辨出除A1B1C1外的几乎所有AnBnCn 碎片离子峰和除X1Y1Z1,X2Y2Z2外的所有XnYnZn 碎片离子峰(表2),从而为推断多肽序列所需系列碎片离子峰的确认提供了保证。m /z 值为798.89的合成产物即为所要合成的目的肽,其氨基酸序列与要求的完全相同,见图3。 在利用RP H PLC 分析合成7肽粗品时,还收集了一个 杂峰 。M S 分析(MS 图未列出)结果表明,该杂峰物质的m /z 值(M +H )+为814.57,提示它是目的7肽的一个修饰产物。为了探明修饰的实质,我们用类似的方法得到了该修饰7肽的叠合M S/M S 质谱图,并利用碎片离子峰的 三联套 规律帮助确定B n 和Y n 峰的存在。结果(图4)表明,该修饰7肽是由目的7肽的第6位M et 氧化后形成的。

2.3 合成10肽的质谱鉴定

10肽的序列为H 2N FLPSDFFPSV CONH 2

(M r 1154.34)。按照上述方法得到的叠合M S/MS 质谱图(图5)中,除低m /z 区外,其余部分都形成了连续性的成套碎片离子峰。图中只标出了根据连续性成套碎片离子峰确定的B n 和Y n 系列谱峰。解析结果表明,合成产物的氨基酸序列与要求的相符。

2.4 合成20肽的质谱鉴定

为了进一步鉴定串联质谱叠合法在鉴定多肽氨基酸序列中的实用性,我们又用固相合成的20肽进行了同样的质谱分析实验。该20肽的序列是:H 2N LLTRILT IPQSLDSWWTSLN CONH 2

(M r

2356.79)。MS 分析结果证明,20肽的分子量与理论值相符(M S 图未列出),其MS/MS 叠合图如图6。用同样的方法确定了序列解析中起重要作用的连续性B1~B18和Y4~Y18系列碎片离子峰。该多肽中含有较多的Leu 和Ile,二者的区分是质谱

法测序的难点之一,对此将另文探讨。

Table 2 Peaks distribution of No.2,No.16,No.18and superimposed MS/MS spectra of chemically synthesized heptapeptide

A2B2C 2

A3B3C3A4B4C4A5B5C5A6B6C6Z2Y2X2Z3Y3X3Z4Y4X4Z5Y5X5Z6Y6X6(M +H)+

No.2

No.16

*

No.18 SI

*

V *,A4+1;S I,superimposed spectrum of No.2,No.16and No.18.

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N ov.,2001王贤纯等:电喷雾串联质谱图的叠合与多肽序列分析