东亚蝎毒蛋白的结构与功能生物科学

东亚蝎毒蛋白的结构与功能

摘要：东亚钳蝎是一种广泛分布于中国的蝎种，作为一种名贵药材用于治疗各种神经系统疾病已有千年历史。东亚钳蝎的蝎毒毒性软弱，不能使人致命。而且从东亚钳蝎粗毒已经发现一些具有药物活性的多肽，研究这些毒素的结构与功能对相关的研究开发也具有重要价值。关键词：天然毒素植物抗真菌多肽晶体结构原子分辨率

前言：东亚钳蝎是我国的主要蝎种，广泛分布于中国西北部、蒙古及韩国，毒性温和，毒液中富含生物活性多肽物质，有极大的药物价值。几千年前，蝎煎剂就被用来治疗中风等疾病，近年来又发现其含有抗癌多肽、抗癫痫肽，抗菌肽等。其中主要药效部位在蝎毒，蝎的毒液主要成分是具有生物活性的多肽，即蝎毒素。同时它们作为未来新型的药物也正展示出十分诱人的潜力和前景。因而结合生化、电生理、药理和免疫学等实验技术，利用分子生物学概念和方法，进一步地在基因水平上揭示蝎毒素讨其开发应用的价值已成为当前学术界中一个具有相当吸引力的研究热点并已取得了重要进展。

1.蝎毒素基因的获取及其在大肠杆菌等宿主内的表达

Ll化学合成基因化学合成基因具有简便快速准确的优点。通常被应用于一些属短肤链蝎神经毒素，如MgTx，chTx，BeISA，Betl等的研究。以其中MgTx 为例11]:MgTX是一个由39个氨基酸残基构成，选择性地阻断电压依赖性K+通道的毒素多肤。但学术界在过去相对一段时间内对蝎毒中是否真实地含有该短肤类毒素存在着争议。早期曾有报道认为类似MgTX一类短肤链毒素的生物活性功能可能是由于其它毒素多肤污染所至。Margarita等根据已知的MgTX氨基酸序

列，合成了两个89mers寡聚核昔酸，每个寡聚核昔酸的5’末端插入了5个脱氧胞啥咤碱基以利限制性内切酶酶切。寡聚核昔酸经纯化且退火后，用sequenaseDNA聚合酶补齐，再经限制性内切酶酶切，得到的片断经纯化后连接到pCSP105质粒中。最终移至“BLZI(DE)中进行表达(图l)。表达的产物为MgTX 与T7基因一9相融合的蛋白，经蛋白酶FactorXa剪切后获得了高表达产率的重组MgTx多肤(rMgTx，3一4mg/L培养液)。rMgTx与天然MgTx两者间无论分子结构或其功能特征均呈现出完全的对应一致性。从而不但为探讨MgTx分子水平的结构与功能关系提供了新的手段和依据，同时证实了MgTX这类多肤确实是存在于蝎毒中的天然活性物质。

1。2构建蝎毒cDNA基因文库

构建蝎毒cDNA文库，从中筛选相关毒素基因是当今研究蝎神经毒素分子特征的重要途径之一，并已得到了广泛的应用。与化学合成基因相比，该法的优点在于可从文库中筛选多个毒素基因。迄今，已建蝎毒cDNA文库的蝎品种有:枷thotos扣da‘eos，Aod阳etonosaost、八sHector，乃匆。se~la她。以及中国的东亚钳蝎刀。认。。ma代eos‘Karsch等，从中筛选出的基因大多为属Na 十通道阻断剂一类的长链毒素多肤，如TsW，TsVll，BjITZ，AaHr，AaHI，AaHn，AaHITI，AaHITZ和BmKI等【卜4]。由此不但解决了蝎毒素多肤含量少，分离纯化困难的问题，而且使得人们进一步加深了对这些毒素多肤基因水平特征的认识。L3利用分子生物学构建生物杀虫剂和抗昆虫植物早在1988年，CarboreU 等曾将化学合成并经八扩增的BeIT抗昆虫毒素的基因克隆(112bp)导入AeMNPV(Auto歹aPhaCa玫rohaeanuclearpolyhedro-515virus，Auto盯aPhaCalifor苗ea核多角粒子病毒)的DNA基因组中进行表达，然而当他们用携带BeIT基因的病毒对sPod叩tera加乡perda(sf)细胞进行感染，检测毒素的表达时，发现毒素的表达率较低，并且当被感染的sf细胞抽提液或培养液注入苍蝇幼虫体内后，并未观察到对昆虫的麻痹毒性效应阁。1990年，英国NERC病毒和环境微生物学研究所的Ste~t等将AaHIT抗昆虫毒素基因导入BaculoviruS 载体中，结果大大增强了病毒抗虫害的能力，且病毒对昆虫的半致死剂量和时间

均明显降低Ie]，同年Mccutchen等也报道了类似成功的工作图。1992年，Pangshengzhi等将抗昆虫毒素短肤BeISA的基因导入烟草基因组中，尝试构建新型抗昆虫植物体系。但经生物检测发现，导入BeIToA基因的烟草植物抗昆虫能力没有明显的提高。推测其原因可能是由于生成的毒素多肤分子中二硫配对误差导致不适当的分子折叠结构所致Is]。1994年Martin--Eauelaire等报道了AaHITI基因在酵母中的表达。虽然被表达的产物得率相对较低(4拼g/L培养基)，但却显现出完全因素:①毒素多肚在酵母中的合成率低;②素多肤在酵母中的稳定性差;③毒素多肚对酵母有毒性效应I0]。

2姻神经毒素的墓因水平认识

蝎神经毒素基因结构的特征’

在已被克隆的蝎神经毒素基因中，T。VII是一个较详细地在基因组水平上阐明其结构特征的多肤fl0]。在编码T，Vn的基因中含有:①一个475bp的intron;

②由20个氨基酸残基构成的信号肤;⑧与成熟ToVll相比，其相应于多肤C一端的置处多了3个氨基酸(即GKK)的编码核昔酸，且成熟多肤C末端残基是被酞胺化。

蝎毒素的生物合成过程蝎神经毒素

基因转录后，intron可在mRNA成熟过程中被剪接，而成熟多肤则是由mRNA 翻译成的多肤前体(precusor)经再加工后的产物。以TsVII为例，它的前体翻译后加工步骤可能为:①首先由信号肤酶(signalpePtidase)将信号肤切除;②由特异的狡肤酶(Carb田守pePtidase)末端剩余的Gly残基被一种a一酞胺化酶(。-amidat吨eoyme)切除，并将C一末端残基酞胺化。然而各种蝎毒素前体的信号肤和C一末端残基不尽相同。其翻译后加工的步骤想必差异较大。有的C一末端残基与天然毒素多肤相同无需加工处理;有的C一末端部位只多了一个碱性氨基酸残基，需经特异性狡肤酶切除;而有的C一末端虽含有Gly残基，但却不能被酞胺化酶作用。尽管目前对上述现象尚无统一的解释，但是蝎毒素多肤的C一末端酞胺化对其生物活性是否起着重要的作用已成为颇值得追究的疑题。