高效液相色谱资料

液相色谱仪维护手册
高乃群
高效液相色谱仪常规分析操作步骤及规程
1)．严格过滤色谱纯流动相，根据需要选择不同的滤膜。

2)．对抽滤后的流动相进行超声脱气20-30分钟。

3)．打开色谱工作站，连接好流动相管道，连接检测系统。

4)．有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。

冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。

冲洗进样阀，冲洗时速度不要超过10 ml/min。

5)．调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000psi。

选用合适的流速。

6)．设定不同样品的检测器分析参数。

7)．等基线走稳即可进样分析，分析样品时对样品的前处理非常重要。

8)．关机时，先关检测器，泵不要关掉，应改用流动相冲洗泵，不同的流动相冲洗时间不同，一般冲洗30min，若是缓冲盐作流动相应先用水冲洗30 min，再用纯甲醇冲洗。

9)．然后关液相泵。

10)．需要把进样阀冲洗干净，另把注射器等工具清理整洁。

11)．填写登记本，由负责人签字。

注意事项：
1.首先必须是HPLC级的，这一条相信大家都做到了。

2.脱气。

由于流动相里含有微量空气，经泵的压力作用，会在流通池里产生气泡，这对分析产生一定的影响，如噪音增大，甚至于掩盖信号峰。

因此，流动相在使用前必须经超声脱气20分钟以上。

3.过滤。

由于流动相里有很微小的垃圾，如不经过过滤，偶尔会卡在单向阀门中，从而产生压力波动。

这一点很多用户不太注意，等到产生压力波动又不知道什么原因产生
如何选择液相色谱仪
一台品质优良的液相色谱系统应从以下几个方面考虑：
一．主要技术指标优异：
首先是如何看指标。

液相色谱仪的指标很多，有泵的、检测器的、色谱柱等等。

我们认为要看主要技术指标，根据国家标准，仪器的主要指标有噪音，漂移，最小检测浓度，定性定量重复性等。

这些指标都要放在系统，回路里去看，去比较。

就是需要把各单元装臵都要联接好，如接好色谱柱，进样阀，并且要通上流动相。

因为您在分析中也都是联接好以后才可以进行分析的，而不是单单用个检测器或是泵的。

然后在这个基础上，我们再去比较这些主要指标。

1．噪音
是指由仪器的电器元件、温度波动、电压的线性脉冲以及其他非溶质作用产生的高频噪声和基线的无规则波动。

噪音的大小直接关系到仪器的检测灵敏度，噪音越大，检测的灵敏度就越低。

对于检测低含量的样品就要求仪器的噪音越小越好，否则噪音过大将会导致基线不稳，甚至影响分析结果。

2．最小检测浓度（最小检测限）
是反映仪器灵敏度的重要参数。

CL=2×Nd×C/H（CL ：最小检测浓度Nd:噪音C：样品浓
度最小检测浓度H：样品峰高）由上式可见，最小检测浓度是和噪音成正比的，噪音越大，最小检测浓度就越大，灵敏度就越低。

某些厂家回避了这个指标，说明他们不愿在最小检测浓度的基础上
去比较噪音。

3．漂移
是指仪器稳定后一段时间内基线漂离原点的距离，通常用来衡量仪器稳定快慢。

高品质的仪器
能在较短的时间内达到稳定，从而在一定程度上提高了分析效率。

4．定性定量重复性
主要是考核仪器稳定性的指标，这对于分析样品来说是非常重要的。

好的仪器其稳定性应该是
十分优秀的，这就要求多次进样保留时间及含量的一致性，这样做出来的结果才能使人信服。

有的朋友会认为这些指标好像都是检测器的。

对的，但是就前面所说条件是要放在整个回路和
系统里去看去比较。

例如：泵的脉动会直接影响噪音指标，泵的流量准确度、精确度指标，以及密封性不好也会影响相关指标。

所以要系统地看指标。

例如：某些公司在公布的指标中，噪音和漂移
指标写的条件是空池或有的干脆不写。

这个指标只考核了UV检测器光学和电气的特性，与实际情况相差甚远，并没有考验泵的压力脉动，液流回路的阻尼和UV检测器流通池的性能。

所以我们认
为从以上的主要指标中可以反应出仪器的一些真实水平。

二．操作方便：
操作方便性无论是对新手还是成熟的用户都是很重要的。

操作越简单，有利于提高分析效率，也为以后分析方法的拓展提供有力的帮助。

上海伍丰科学仪器有限公司的WS-100工作站软件实
现了真正的智能化操作。

它摒弃了以往工作站软件只能起到数据处理的理念，率先在国内推出了集
控制与后处理于一身的软件，在操作使用上给用户带来了极大的方便。

三．系统的，整体开发
这里指的是仪器的整体开发，是一个完整的系统。

目前市场上有这个现象，说我的泵是进口的，或者是检测器怎么好，用了什么很多的进口件组装等等。

其实这是个误区。

液相色谱是个复杂的系统，不是整体开发的，各项指标之间、软件和硬件、硬件和硬件等都不匹配，整体水平不会高到哪里去，而且在售后服务方面对用户也是不负责任的。

整体开发的主要优点有：各项技术指标统一、仪器各单元的通信协调、能够建立一个整体的数字化评价系统、体现了企业的科技及开发实力。

国外知名的仪器生产厂家的产品也是整体开发的，所以能够保证仪器的整体水平。

四．稳定可靠，故障率低
这个大家都知道，就不多说了。

从以上各方面比较，伍丰仪器的LC-100智能液相色谱系统完全符合一台优秀仪器的所有特点，代表了目前国产液相色谱的真正水平。

高效液相色谱系统中气泡对检测的影响及其解决方法在我们进行液相色谱分析时，有时会遇到这样一个问题：系统的流路中存在气泡。

由于气泡的存在，会造成色谱图上出现尖锐的噪声峰，严重时会造成分析灵敏度下降；气泡变大进入流路或色谱柱时会使流动相的流速变慢或不稳定，使基线起伏。

造成上述现象的主要原因有三条：一是流动相溶液中往往因溶解有氧气或混入了空气而形成气泡；二是系统开始工作时未能将流路中的空气驱赶干净；三是在注入样品时不注意混入了空气。

为了避免这类问题的出现，液相色谱实际分析过程中必须重视对流动相进行脱气处理。

常用的脱气方法有以下几种：
1. 吹氦脱气法使用在液体中比空气溶解度低的氦气，在0.1Mpa压力下，以约60ml/min流速通入流动相10-15min以驱除溶解的气体。

此法使用于所有的溶剂，脱气效果较好，但在国内因氦气价格较贵，本法使用较少；
2. 加热回流法此法的脱气效果较好；
3. 抽真空脱气法此时可使用微型真空泵，降压至0.05-0.07MPa即可除区溶解的气体。

显然使用水泵连接抽滤瓶和G4微孔玻璃漏斗可一起完成过滤机械杂质和脱气的双重任务。

由于抽真空会引起混合溶剂组成的变化，故此法适用于单一溶剂体系脱气。

对多元溶剂体系应预先脱气后再进行混合，以保证混合后的比例不变。

4. 超声波脱气法它是目前实验室使用最广泛的脱气方法，将配制好的流动相连同容器一起放入超声波水漕中脱气10-20min即可。

该方法操作简便，基本能满足日常分析的要求。

5. 在线真空脱气法把真空脱气装臵串联到储液系统中，并结合膜过滤器，实现了流动相在进入输液泵前的连续真空脱气。

此法的脱气效果明显优于上述几种方法，并适用于多元溶剂体系。

其二，在液相色谱系统开始工作前，可以用注射器连接恒流泵的排空阀，抽入流动相，将流路中的空气驱赶干净。

其三，在注入样品前注意排出样品注射器中的空气。

液相色谱仪的最小检测浓度和流通池光程的关系与含义
某些国产仪器在公布其技术指标时，大多只写了"噪音和漂移"的指标。

用户觉得指标都差不多，但却忽略了另外二个较为重要的指标："最小检测浓度和光程"，这二个指标有什么作用呢？它们代表了什么含义？
这里来解释一下：最小检测浓度是考验仪器的灵敏度。

最小检测浓度数值大，仪器的灵敏度就小，不能反应真正的噪音和漂移水平。

例如：我公司的最小检测浓度小于1×10-8g/ml (萘/甲醇溶液)，而某些仪器是：4×10-8g/ml (萘/甲醇溶液)。

这就说明我们的仪器灵敏度大，可以检测更微量的样品。

同样如我公司仪器把最小检测浓度调较得和其它产品是一样，也就表明我们可以做得比其它产品噪音和漂移低4倍。

可以从这个公式看出：
最小检测浓度=2×仪器的噪音×进样的样品浓度/样品的峰高值
那光程又代表什么？我们先看下面一个公式，比尔定律：
A=log(I0/I)=Εcl
A是吸收率；I0代表参照池的光强；I为样品池的光强；ε为摩尔吸光系数；C是样品浓度；L就是流通池的光程。

可以看出在同样的"C"样品浓度情况下，"L"流通池的光程越大,仪器的"A吸收率"也就越大。

这样可以检测到的样品浓度就越小。

为什么有些厂家把仪器的流通池光程做得很小，有些只有：3.5mm、4.5mm或5.5mm，而不是我公司的8mm。

这是因为这些厂家不能有效的降低整个系统的"噪音和漂移水平"，只能牺牲流通池光程，也就是牺牲了仪器的检测灵敏度和最小检测浓度，来达到降低"噪音和漂移水平"目的。

用通俗的说法比喻：HPLC就是一台音响，光程就是这台音响的音量控制键，光程越小就是把音量调小了，耳朵对音响本身的噪音和失真（可以理解为仪器的噪音和漂移）感觉就越小。

但也就说明了这些仪器整体系统的制造水平不高。

知道了这些道理,你在挑选液相色谱仪时别忘了这二点哦.
怎样选择色谱柱
现代高效液相色谱中，分离效果好坏很大程度上取决于色谱填料的选择。

但是色谱填料的选择范围很宽，要做合适的选择，必须对此有一定的认识和了解。

一．硅胶基质填料：
1.正相色谱
正相色谱用的固定相通常为硅胶（Silica）以及其它具有极性官能团,如胺基团（NH2,APS）和氰基团（CN,CPS）的键合相填料。

由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其它极性基团极性较强，因此，分离的次序是依据样品中各组份的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱。

正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如：正己烷（Hexane）、氯仿（Chloroform）、二氯甲烷（Methylene Chloride）等。

2.反相色谱
反相色谱用的填料常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱的官能团的键合相。

反相色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲液与甲醇、乙腈等的混合物。

样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组份最先被冲洗出，而极性弱的组份会在色谱柱上有更强的保留。

常用的反相填料有：C18(ODS)、C8(MOS)、C4(Butyl)、C6H5(Phenyl)等。

二. 聚合物填料
聚合物填料多为聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸酯等，其主要优点是在pH值为1～14均可使用。

相对于硅胶基质的C18填料，这类填料具有更强的疏水性；大孔的聚合物填料对蛋白质等样品的分离非常有效。

现有的聚合物填料的缺点是相对硅胶基质填料，色谱柱柱效较低。

三．其它无机填料
其它HPLC的无机填料色谱柱也已经商品化。

由于其特殊的性质，一般仅限于特殊的用途。

如，石墨化碳正逐渐成为反相色谱柱填料。

这种填料的分离不同于硅胶基质烷基键合相，石墨化碳的表面即是保留的基础，不再需其它的表面改性。

该柱填料一般比烷基键合硅胶或多孔聚合物填料的保留能力更强。

石墨化碳可用于分离某些几何异构体,又由于在HPLC流动相中不会被溶解, 这类柱可在任何pH与温度下使用。

氧化铝也可用于HPLC,氧化铝微粒刚性强，可制成稳定的色谱柱柱床，其优点是可在pH高达12的流动相中使用。

但由于氧化铝与碱性化合物作用也很强，应用范围受到一定的限制，所以未能广泛应用。

新型氧化锆基质色谱填料也可用于HPLC,商品化的仅有聚合物涂层的多孔氧化锆微球色谱柱，应用pH范围1～14，温度可达100℃。

由于氧化锆填料是最近几年才开始研究，加之面临的实验难度，其重要用途与优势尚在进行中。

如何保证良好的柱性能与柱寿命
1.◇认真阅读色谱柱使用说明书；
2.◇使用填充良好的色谱柱；
3.◇尽量减少压力波动，避免机械及热冲击；
4.◇使用保护柱及在线过滤器；
5.◇经常以强溶剂冲洗色谱柱；
6.◇充分过滤样品及流动相，尽量避免杂质微粒与强保留成分；
7.◇用稳定的固定相（C18最稳定）；
8.◇在中等pH值操作时(6～8), 用有机缓冲溶液;
9.◇色谱柱使用温度最好小于40℃；
10.◇硅胶基质的的色谱柱，应保持流动相的pH值范围在3.0～8.0；
11.◇在水流动相与缓冲溶液中加200ppm的叠氮钠；
12.◇流动相中含有缓冲溶液，应注意用95：5的水及有机溶剂过渡，有机溶剂
不能低于5%。

13.◇过夜或贮存时, 冲洗掉盐和缓冲液, 用纯有机溶剂流动相保存(乙晴最好)。

如何解决色谱柱使用过程中出现的问题
一、保留值与分离度重现性不好原因分析
二、造成色谱峰（不对称）拖尾的原因
1．色谱柱本身填装问题,筛板堵塞或填料塌陷；
2．柱头有污染；
3．样品超载；
4．样品溶剂不合适；
5．柱外效应；
6．化学或二次保留（硅羟基）效应；
7．缓冲容量不足或不合适；
8．重金属污染。

三、如何解决峰形拖尾的问题
A. 与化学有关的拖尾问题
1．流动相中，加入30mM的三乙胺（用于碱性化合物）或醋酸胺（用于酸性化合物），未知化合物加醋酸三乙胺；
2．如仍然拖尾，将三乙胺换为二甲基辛胺（或醋酸二甲基辛胺）；
3.降低进样量至<1μg。

B. 与色谱柱有关的拖尾问题
1.如柱头处有强保留的样品组分积聚，反相柱可用20倍柱体积的96%的二氯甲烷与4%甲醇，加1%氢氧化铵混合液冲洗；正向柱可用甲醇冲洗；
2.使用保护柱。

C. 与HPLC系统有关的峰拖尾和峰加宽
1.进样体积过大，（通常≤25μL）；
2.进样阀与色谱柱及检测器之间的管路体积过大（最佳连接管应<20cm，内径为0.007"）；
3.检测器流通池的体积过大。

四、如何贮存色谱柱
1.防止缓冲溶液和水溶液流动相产生微生物,做到流动相用多少配多少, 或在水流动相中加200ppm的叠氮钠以抑制细菌生长（一定当心其毒性和潜在的爆炸性）；或在流动相中加20%的有机改性剂，也可抑制微生物生长，有机改性剂还有助于流动相脱气。

2.尽可能将色谱柱贮存于100%有机溶剂（乙晴最好）中，避免在缓冲溶液中保存。

3.使用缓冲溶液后的色谱柱，应用15～20倍柱体积的不含缓冲剂的同种水-有机溶剂流动相冲洗色谱柱，后换成100%有机溶剂贮存。

4.避免用纯水冲洗键合致密的C18柱。

5.将色谱柱的两端用堵头拧好，以免柱床填料干裂。

如何选择保护
怎样选择保护柱，但又不影响分离分析？这是色谱工作者经常提出的一个问题。

通常，在选择保护柱之前首先要考虑的是样品是否清洁。

对于大部分分析工作者来说，一只1cm长的保护柱便能提供充分的保护作用。

但是，如果样品非常不清洁，或工作中发现要经常更换1cm的保护柱，那么就应选择2cm或3cm长的保护柱。

保护柱越长，自然所装填的色谱填料越多，则其越能避免污染物进入分析色谱柱的机会。

当然，随着保护柱的长度加长，样品的保留时间会比使用短保护柱长。

一般来说，保护柱的内径与分析色谱柱的内径相同或相当即可。

保护柱的填料装填方式也很重要。

目前有薄膜装填法的保护柱，使用过程很简单方便，而且可以在实验室中进行干装。

但是，其最大的缺点是不经济，特别是针对中国的具体情况，一次性使用相对费用较高。

另外，薄膜装填法的保护柱所装填的色谱填料有限，只能提供很有限的保护作用；不过也因为所装填的色谱填料较少，保
护柱的长度也较短，所以对分析样品的保留时间的影响也很小。

另一种保护柱结构其实质是缩短了的色谱分析柱，设计方式上有直连式、手紧式或整体式。

整体式设计是由色谱柱的生产厂商直接安装在色谱分析柱上的，必须与色谱分析柱一同订货，可以非常方便地使用，但不能够被修改。

直连式结构设计可在任何时候由色谱工作者来安装连接，可以与任何品牌的色谱分析柱连接使用，而且还可以根据样品的相关情况选择不同的保护柱长度。

手紧式保护柱从结构上讲是与直连式保护柱一样，只是在连接时不需要借助扳手等工具，直接用手上紧即可。

另外从保护柱结构的角度看，保护柱的结构又分为是否可以更换保护柱柱芯。

现在大多数的保护柱均可以更换保护柱柱芯，可以降低保护柱的使用成本。

大多数人是根据色谱分析柱的填料选择保护柱的填料，正常情况下可以选择与分析色谱柱一样的色谱填料。

但是，根据实际的分析工作，也可不必与分析色谱柱的填料完全相匹配。

对于选择保护柱的原则是：在满足分析分离要求的前提条件下，尽可能地选择较短的保护柱结构，尽可能选择对分离样品小一些保留性的填料。

液相色谱柱使用注意事项
色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。

但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；
另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。

1、样品的前处理：
a、最好使用流动相溶解样品。

b、使用予处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。

c、使用0.45μm的过滤膜过滤除去微粒杂质。

2、流动相的配制：
液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点：
a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在
柱中)。

b、流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。

c、流动相的黏度要尽量小，以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果；同时降低
柱压降，延长液体泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。

d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。

如使用UV检测器，最好使用对紫外
吸收较低的溶剂配制。

e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。

f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。

除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，
还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。

3、流动相流速的选择：
因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。

对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。

对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择1ml／min，对于内径为4.0mm柱，流速0.8ml／min为佳。

当选用最佳流速时，分析时间可能延长。

可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。

注意：
a．由于甲醇廉价，对于反相柱推荐使用甲醇体系(必须使用乙腈的场合除外)。

b．对于正相柱推荐使用沸程为30-60℃的石油醚或提纯后的己烷作流动相，没有提纯的己烷不得使用。

用水最好使用超纯水(电阻率大于18兆欧)，去离子水及双蒸水中含有酚类杂质，有可能影响分析结果。

c．含水流动相最*在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜。

最好加入叠氮化钠，防止细菌生长。

d．流动相要求使用0.45 μm滤膜过滤，除去微粒杂质。

e．使用HPLC级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高柱性能
液相色谱仪色谱柱使用及维护
每天用足够的时间来平衡色谱柱，您就会在处理问题方面获得最大的"补偿"，而且您的色谱柱的寿命也会变得更长！------ 一定得做！
新的色谱柱在使用之前应该在您自己的液相色谱仪上进行性能测试，即使用色谱柱附带的检验报告上测试条件和样品来测定该色谱柱的柱效。

并且，在以后的使用中，应时常对色谱柱进行测试。

卡套柱的安装（不加预柱）1．将卡套架套入柱芯
2．将两片夹套片嵌入柱芯的凹槽，使柱芯高于夹套（见左图）
3．将已套到柱芯上的卡套架向上推，直至高过夹套片
4．将卡套帽和卡套架旋在一起，然后用手拧紧
5．然后依同样的顺序连接好柱子的另一端
6．连接到液相色谱仪，P EEK接头手拧即可；若为不锈钢接头应使用专用扳手
注意：使用卡套柱时，两端的卡套应时刻连接在柱芯上。

不管您是平衡色谱柱或是清洗，任何时候都不能将卡套取下来，否则会造成填料的流失。

卡套柱的安装（加预柱）
1．将卡套架套入柱芯
2．将两片夹套片嵌入柱芯的凹槽，使夹套高于柱芯（见左图）
3．将已套到柱芯上的卡套架向上推，直至高过夹套片
4．将"子弹头"预柱放入卡套片内
5．将卡套帽和卡套架旋在一起，然后用手拧紧
6．然后依同样的顺序连接好柱子的另一端
7．连接到液相色谱仪，PEEK接头手拧即可；若为不锈钢接头应使用专用扳手
更换色谱柱滤网和玻璃棉过滤片（同时可以修补色谱柱）
注意：在取出反相柱芯的滤网和玻璃片之前，应该将色谱柱充分用水和甲醇/乙腈冲洗，而且修补工具的头部也应该蘸取少量的甲醇/乙腈，以避免在取出滤网和玻璃棉滤片时带出柱子内的填料。

1．将修补工具中的2套入柱芯的顶端
2．将修补工具中的3轻轻地旋入已套着2的柱芯中，并顺时针方向旋转到旋紧
3．一手握柱芯，另一只手轻轻地向外拉3，取出柱芯顶端的滤网
4．用一个小铲子轻轻地取出滤网下面的玻璃棉以及被污染的填料
5．将新的填料用甲醇润湿，然后填入挖去的部位，压平
6．照（左图）装上新的玻璃棉滤网，并用修补工具中的4将玻璃棉压入柱芯顶端
7．柱芯顶端套上2，然后参照（左图）将滤网放入。