伪狂犬病毒标记神经环路的研究进展

伪狂犬病毒标记神经环路的研究进展
罗振 潘建青 边晔 王立平
摘 要 伪狂犬病毒(PRV)作为一种亲神经性的病毒，它以其自我复制、跨突触、特异性传递的三大优势在揭示神经系统中功能性神经元之间的连接发挥着重大的作用。

经基因重组后的伪狂犬病毒不但继承了原有病毒的优势，同时还延伸出其它特异性的功能。

本文即对目前应用伪狂犬病毒标记神经环路的一些技术和应用进行综述。

关键词 伪狂犬病毒；神经环路
1 神经环路标记概述
在上世纪九十年代以前，在揭示神经环路中神经元之间的连接主要是通过注射一种染料或蛋白来标记神经元。

这种方法需要很多的动物，才能明确最简单的环路，同时大量与实验无关的神经环路被标记，此外这种方法不可能注射特异性的示踪剂到神经元。

病毒示踪的价值在于它能够在同种生物体内标记完整的神经环路。

由于病毒能够在神经细胞中自我复制，不像化学物质或蛋白很容易被扩散同时能够通过突触的极少。

近年来用重组病毒在生物体内表达荧光蛋白的方法使得神经环路的标记更加简单化和直观化，并且能够在活体长期存在。

2 伪狂犬病毒标记神经环路
野生型的伪狂犬病毒由于毒性太强，对神经元的破坏性极强，很容易导致实验动物的死亡[1,2,3]，因此使用效果不是很好。

目前使用的伪狂犬病毒毒株都是减毒后的病毒，它的优点在于病毒能够在体内长期，使实验动物并无明显病症，从而可以标记完整的神经环路。

目前成功的应用于跨突触感染的伪狂犬病毒毒株有PRV-Bartha[4]。

伪狂犬病毒感染神经元的传递方式是由突触后到突触前的逆行感染方式。

荧光蛋白作为一种新型的标记物，在各个领域已得到广泛的应用。

利用基因重组技术，将表达荧光蛋白的基因插入到伪狂犬病毒的非必须基因中，从而使得被感染的细胞内表达有荧光蛋白，被感染的组织可以在共聚焦显微镜下直接观察，从而省去很多实验的下游步骤。

3 条件复制型重组伪狂犬病毒
通过直接的大脑内注射伪狂犬病毒能够揭示中央神经系统环路，这种立体定位的注射能够提供一种精确的轴突终端的剂量依赖性感染，伪狂犬病毒粒子较大，直径约200nm，很容易吸附到细胞外基质上的蛋白，因此病毒粒子不会从注射位点扩散。

精确的描绘中央神经系统环路需要很好的控制感染，为了达到这个目的DeFalco和他的同事构建了一个PRV-Bartha的衍生毒株，这种毒株不能自主表达胸苷激酶(TK)基因，而TK基因的表达受阻会导致病毒不能自主复制，当被感染的细胞能够表达Cre重组酶时，这种病毒的TK基因表达抑制被解除，能够表达TK基因同时绿色荧光蛋白[5,6]，此时病毒能够复制并且传递到所有突触连接的神经元细胞。

4 伪狂犬病毒在标记视网膜环路的应用
当PRV-Bartha被注射到眼球玻璃体，病毒最后被传递到另外一只眼的视网膜神经胶质细胞上，在这个模式中，PRV通过眼窝肌肉和睫状肌副交感神经和交感神经分布传递到中央神经系统，通过交感神经逆行感染导致视交叉上核的感染，并且从这里传递到对侧眼球的视网膜神经节细胞[7]。

最近的研究中，Viney和他的同事利用这种模式，研究一种内在的光敏感的视网膜神经节细胞的局部环路，发现PRV对少数光敏感的视网膜神经节细胞的标记是专有的[8]。

5 伪狂犬病毒示踪的新应用
PRV能够量化动态的神经元连接，在大脑发育过程中，通过测量PRV侵入大脑皮层的程度，神经元之间的连接能够被观察。

通过比较出生后1~8天的小狗幼仔被间歇障碍隔离或与母亲的间歇分离来观察这种处理对后代的CNS发育过程中的影响，小狗幼仔胃腹侧被注射PRV-Bartha，感染后63~66小时病毒传递到脑干和脑皮层时被并分析。

处理组的纹状体、中心
杏仁核、岛皮质的感染与没有处理组的相比较极其不
明显[9]。

PRV在这方面的传递差异可能是由于8天内的处理对于突触构造的形成产生的差异[10]。

类似的研究还有，它用来确定移植组织的神经分布，作为一个潜在的视网膜疾病的治疗方法，Seiler等人，将视网膜片移植到不同类型的视网膜退化的鼠的眼睛，用来确定移植的组织与宿主之间的突触连接是否形成[11]。

PRV-Bartha被注射到手术后2~9个月的鼠的上丘，上丘这个区域被认为是移植位点的投射区。

基于组织空间定位和溴脱氧尿苷的宿主染色，研究人员鉴定出一些鼠的移植视网膜神经元细胞被PRV感染，表明PRV的感染可以通过移植的组织与宿主之间形成的突触连接传递。

6 小结
总之，伪狂犬病毒是一种极好的神经突触示踪剂，尽管如此使用伪狂犬病毒还存在许多的问题需要解决。

如：PRV的传递是直接通过，还是通过附近的突触传递？PRV 功能性的神经元连接之间的传递需要什么样的分子机制？有没有神经元不会被PRV感染？神经元的激活会不会影响PRV的传递？在面对细胞病变的感染，PRV-Bartha感染的神经元是怎样使细胞维持一个相对正常的电生理现象？进一步减毒后的PRV能不能维持快速的跨突触传递？这些问题的解决将会使得伪狂犬病毒在神经生物学领域的应用更加广泛。

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[11] Seiler, M.J. et al. Transsynaptic virus tracing from host brain to
subret-inal transplants. Eur. J. Neurosci. 21, 2005，161–172.
作者简介
罗 振研究助理，毕业于湖北大学分子生物学专业，现主要从事慢病毒及重组伪狂犬病毒的
包装及相关分子生物学的研究。

潘建青作者简介见本期第43页。

边 晔研究助理，毕业于陕西师范大学分子生物学专业，现主要从事腺病毒包装以及肿瘤的基
因治疗方向的研究。

王立平作者简介见本期封2页。