毕赤酵母表达重组植酸酶酶学性质的比较研究
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１ 材 料 和 方 法
１ １ 菌 株 和 质 粒 酵 母 菌 株 Ｐ ｃ ｉ ａｔｒｓＧ ｌ ５（ ｓ ． ｉｈａｐ ｓｏｉ Ｓ ｌ Ｈｉ —Ｍｕ 。 购 自 Ｉｖｔｏ ｅ ｔ） 。 ｎ ｉ ｇ ｎ公 司． 达 载 体 ｒ 表
ｐ Ｍ９ ５ 和 含 有 植 酸 酶 基 因 的 质 粒 ｐ ＨＢ ０ Ａ ＵＣＩ一ｐ Ａ， ＨＢ ０ Ａ ａ ｐ ８ａ ｐ ｐ Ｍ９ ５ — ｐ Ａ ＮＲ ， ＨＢ ０ Ａ ａ ｐ 和 ｐ Ｍ９ ５ —ｐ Ａ
ａ ｐ 和 ｐ ｙ 更具 备工 业 饲 料要 求 的 酶 学 特性 ． ｐＡ ｈＡ
关键 词 重 组 植 酸 酶 ；毕 赤 酵 母 ； 学 性 质 ；比较 酶
Ｑ９ ６ ３ 文献标志码 Ａ
中 图分 类 号
植 酸酶 是催 化植 酸及其 盐类水 解 成肌 醇和磷 酸 的一类 酶 的总称 ， 可降 低饲料 中植 酸 的抗 营养 作用 ， 提高单 胃动 物磷 的吸 收率 ， 降低磷 的污 染 ， 目前在 食 品特别 是饲料 领域 得 到 了广 泛 的应 用［ ］ 植酸 酶 的 １． 来源 广泛 ， 括植 物 、 包 动物 和微生 物 ， 以微 生物 来源 的植 酸酶最 为广 泛 ， 自然 界微 生物 中植 酸酶 的含 尤 但
Ｎ 和 黑 曲 霉 植 酸 酶 （ ｈ Ａ） Ｒ） ｐ ｙ 的最 适 ｐ 、 度 、 稳定 性 及 对 胃蛋 白酶 和 胰 蛋 白 酶 的 耐 受 性 ． 果 表 明 ， ９ Ｈ 温 热 结 在 ５ ℃ ， 热 １ ｎａ ｐ 加 ０ｍｉ，ｐ Ａ ＮＲ可 残 余 ９ 左 右 的 活 力 ， Ｏ 而其 他 两种 只残 余 ２ ～５ 的 活 力 ； ｐ Ａ Ｎ 和 ｐ ｙ Ｏ Ｏ ａｐ Ｒ ｈＡ
具有 良好 的活性 ， 因此很 多植 酸酶 只能满 足一方 面 的需求 ． 通过基 因工程 、 白质工程 等方法 不但 可提 高植 酸 酶 的 产量 ， 低 生 产和 应 用成 本 ， 且还 可 优化 蛋 降 而
植 酸酶某些 理化 性质 ， 使其 具有 广谱 ｐ 耐受性 、 Ｈ 良好 的热 稳定 性 、 白酶 耐 受性 等 ］ 例如 来 源 于 Ｅ． 蛋 ，
第 ３ 第 ２期 ３卷
２１ 年 ６ ０１ 月
湖北大学学报（ 自然 科 学 版 ）
Ｊ ｕ ｎ ｌｏ ｂ ｉ ｉｅｓｔ （ ｔ ｒｌＳ ｉｎ ｅ ｏ ｒ ａ ｆＨｕ ｅ ｖ ｒｉｙ Ｎａｕ ａ ｃｅ ｃ ） Ｕｎ
Ｖ０ ． ３ Ｎｏ ２ １３ ．
Ｊ ｎ 。２ １ ｕ． ０１
文章 编 号 ： ０ ｏ ３ ５ ２ １ ） ２ １ ７— ３ １ ｏ 一２ ７ （ ０ １ ０ —０ ８ ０
毕 赤 酵 母 表 达 重 组植 酸 酶 酶 学性 质 的 比较研 究
邹 由， 玲 ， 付 江维 ， 玉 玲 ， 立 新 周 马
（ 北大学生命科学学院 ， 北 武汉 ４０６） 湖 湖 ３ Ｏ ２
摘要
通 过 酶 学 性 质 比较 毕 赤 酵 母 Ｇ １ ５表 达 的 Ｅ．ｏｉ ２植 酸 酶 （ｐ Ａ） 其 突 变 体 植 酸 酶 （ ｐ Ａ Ｓ１ ｃｌ ＫＩ ａｐ 及 ａｐ
具 有 两 个 最 适 ｐ 值 ， ａ ｐ 只 有 一 个 ； 对 ｐ ｙ ａ ｐ 及 其 突 变 体 ａ ｐ ＮＲ都 具 有 良好 的 胃蛋 白 酶 和 Ｈ 而 ｐＡ 相 ｈ Ａ，ｐ Ａ ｐ Ａ
胰 蛋 白酶 耐 受 性 ． 此 ａ ｐ Ｒ 无 论 是 热 稳 定 性 还 是 ｐ 耐 受 性 及 对 胃 、 蛋 白 酶 的 耐 受 性 都 比 野 生 型 因 ｐＡ Ｎ Ｈ 胰
量很 低 ， 低于 工业 生产需 要 ， 远 ］ 同时 饲料用 酶加 工需要 经 过一个 高 温 （ ５ ３℃） 粒过 程 ， ７ ～９ 制 一般 的植
酸酶 活性在 此高 温下 大 幅度 地不 可逆 丧 失［ ２ ；另一 方 面 ， 酸酶 的作 用部 位 是 动物 胃肠 道 ， “ 植 动物 胃肠 道 的温度 一般 是 ３ ７℃ ， Ｈ 为 ２ ５ ． ， 以商 品化 的植 酸酶 又必 须在 ３ ｐ ． ～７ ０ 所 ７℃左 右 和 ｐ 为 ２ ５ ． Ｈ ． ～７ ０时
ｃ ｌ 的 ａ ｐ 在 毕赤酵 母 中表达 ， ｏｉ ｐＡ 不但 产量 提高 ， 而且 一些 理化性 质也 发生 改变 ， 这些 不 同的性质 可能对
植 酸酶在 饲料 中的应 用产 生直 接影 响＿ ． ７ 有研 究 表 明 ， ｃｌ ＫＩ ］ Ｅ．ｏｉ ２的植 酸 酶 （ ｐ Ａ） ａ ｐ 及其 突变 体植 酸 酶 （ｐ Ａ ＮＲ） ａｐ 和黑 曲霉 植酸 酶 （ ｈ Ａ） 毕 赤 酵母 中分 别 进 行 了 表达 ｌ ， 达 量 得 到 了很 大 的提 高 ， ｐｙ 在 ８ 表 然 而很 少有 人对 它们 的酶学 性质 进行 综 合 的 比较． 因此本 实 验 中以毕 赤 酵母 ＧＳ １ １ ５为 宿 主 ， 表达 ３种 不 同来 源 的植酸 酶 ａ ｐ ＮＲ、ｐ Ａ、ｈ Ａ， 后通 过酶 学性 质 比较 这 ３种植 酸酶 的最适 ｐ 温度 、 稳定 ｐ Ａ ａｐ ｐ ｙ 然 Ｈ、 热 性及 对 胃、 胰蛋 白酶 的耐 受性 ． 结果 表 明 ， 论 是 在 热 稳定 性 、 Ｈ 范 围 ， 是 在 胃蛋 白酶 和 胰蛋 白酶 的 无 ｐ 还 耐 受性上 ，ｐ Ａ ＮＲ都 比野 生 型植 酸 酶 ａ ｐ ８和黑 曲霉 ｐ ｙ 口 ａｐ ｐ Ａ［ ］ ｈ Ａ 叩更具 备工业 饲料 需要 的酶学 特性 ．
ｐ Ｍｇ ５ — ｈ Ａ 为 本研 究室保 存 ． ＨＢ ０ Ａ ｐ ｙ １ ２ 植 酸酶 的发 酵 ． ３ 不 同来 源 的植 酸 酶 ａ ｐ ａ ｐ 种 ｐ Ａ、ｐ Ａ ＮＲ、 ｈ Ａ 均来 自实 验 室重 组 毕赤 酵母 菌 株 ｐｙ
发 酵． 酸酶 毕 氏酵母 的诱导 按 Ｉｖｔｏ ｅ 植 ｎ ｉ ｇ ｎ公 司的毕 氏酵母 操作 手册 进行 ． ｒ
１ 材 料 和 方 法
１ １ 菌 株 和 质 粒 酵 母 菌 株 Ｐ ｃ ｉ ａｔｒｓＧ ｌ ５（ ｓ ． ｉｈａｐ ｓｏｉ Ｓ ｌ Ｈｉ —Ｍｕ 。 购 自 Ｉｖｔｏ ｅ ｔ） 。 ｎ ｉ ｇ ｎ公 司． 达 载 体 ｒ 表
ｐ Ｍ９ ５ 和 含 有 植 酸 酶 基 因 的 质 粒 ｐ ＨＢ ０ Ａ ＵＣＩ一ｐ Ａ， ＨＢ ０ Ａ ａ ｐ ８ａ ｐ ｐ Ｍ９ ５ — ｐ Ａ ＮＲ ， ＨＢ ０ Ａ ａ ｐ 和 ｐ Ｍ９ ５ —ｐ Ａ
ａ ｐ 和 ｐ ｙ 更具 备工 业 饲 料要 求 的 酶 学 特性 ． ｐＡ ｈＡ
关键 词 重 组 植 酸 酶 ；毕 赤 酵 母 ； 学 性 质 ；比较 酶
Ｑ９ ６ ３ 文献标志码 Ａ
中 图分 类 号
植 酸酶 是催 化植 酸及其 盐类水 解 成肌 醇和磷 酸 的一类 酶 的总称 ， 可降 低饲料 中植 酸 的抗 营养 作用 ， 提高单 胃动 物磷 的吸 收率 ， 降低磷 的污 染 ， 目前在 食 品特别 是饲料 领域 得 到 了广 泛 的应 用［ ］ 植酸 酶 的 １． 来源 广泛 ， 括植 物 、 包 动物 和微生 物 ， 以微 生物 来源 的植 酸酶最 为广 泛 ， 自然 界微 生物 中植 酸酶 的含 尤 但
Ｎ 和 黑 曲 霉 植 酸 酶 （ ｈ Ａ） Ｒ） ｐ ｙ 的最 适 ｐ 、 度 、 稳定 性 及 对 胃蛋 白酶 和 胰 蛋 白 酶 的 耐 受 性 ． 果 表 明 ， ９ Ｈ 温 热 结 在 ５ ℃ ， 热 １ ｎａ ｐ 加 ０ｍｉ，ｐ Ａ ＮＲ可 残 余 ９ 左 右 的 活 力 ， Ｏ 而其 他 两种 只残 余 ２ ～５ 的 活 力 ； ｐ Ａ Ｎ 和 ｐ ｙ Ｏ Ｏ ａｐ Ｒ ｈＡ
具有 良好 的活性 ， 因此很 多植 酸酶 只能满 足一方 面 的需求 ． 通过基 因工程 、 白质工程 等方法 不但 可提 高植 酸 酶 的 产量 ， 低 生 产和 应 用成 本 ， 且还 可 优化 蛋 降 而
植 酸酶某些 理化 性质 ， 使其 具有 广谱 ｐ 耐受性 、 Ｈ 良好 的热 稳定 性 、 白酶 耐 受性 等 ］ 例如 来 源 于 Ｅ． 蛋 ，
第 ３ 第 ２期 ３卷
２１ 年 ６ ０１ 月
湖北大学学报（ 自然 科 学 版 ）
Ｊ ｕ ｎ ｌｏ ｂ ｉ ｉｅｓｔ （ ｔ ｒｌＳ ｉｎ ｅ ｏ ｒ ａ ｆＨｕ ｅ ｖ ｒｉｙ Ｎａｕ ａ ｃｅ ｃ ） Ｕｎ
Ｖ０ ． ３ Ｎｏ ２ １３ ．
Ｊ ｎ 。２ １ ｕ． ０１
文章 编 号 ： ０ ｏ ３ ５ ２ １ ） ２ １ ７— ３ １ ｏ 一２ ７ （ ０ １ ０ —０ ８ ０
毕 赤 酵 母 表 达 重 组植 酸 酶 酶 学性 质 的 比较研 究
邹 由， 玲 ， 付 江维 ， 玉 玲 ， 立 新 周 马
（ 北大学生命科学学院 ， 北 武汉 ４０６） 湖 湖 ３ Ｏ ２
摘要
通 过 酶 学 性 质 比较 毕 赤 酵 母 Ｇ １ ５表 达 的 Ｅ．ｏｉ ２植 酸 酶 （ｐ Ａ） 其 突 变 体 植 酸 酶 （ ｐ Ａ Ｓ１ ｃｌ ＫＩ ａｐ 及 ａｐ
具 有 两 个 最 适 ｐ 值 ， ａ ｐ 只 有 一 个 ； 对 ｐ ｙ ａ ｐ 及 其 突 变 体 ａ ｐ ＮＲ都 具 有 良好 的 胃蛋 白 酶 和 Ｈ 而 ｐＡ 相 ｈ Ａ，ｐ Ａ ｐ Ａ
胰 蛋 白酶 耐 受 性 ． 此 ａ ｐ Ｒ 无 论 是 热 稳 定 性 还 是 ｐ 耐 受 性 及 对 胃 、 蛋 白 酶 的 耐 受 性 都 比 野 生 型 因 ｐＡ Ｎ Ｈ 胰
量很 低 ， 低于 工业 生产需 要 ， 远 ］ 同时 饲料用 酶加 工需要 经 过一个 高 温 （ ５ ３℃） 粒过 程 ， ７ ～９ 制 一般 的植
酸酶 活性在 此高 温下 大 幅度 地不 可逆 丧 失［ ２ ；另一 方 面 ， 酸酶 的作 用部 位 是 动物 胃肠 道 ， “ 植 动物 胃肠 道 的温度 一般 是 ３ ７℃ ， Ｈ 为 ２ ５ ． ， 以商 品化 的植 酸酶 又必 须在 ３ ｐ ． ～７ ０ 所 ７℃左 右 和 ｐ 为 ２ ５ ． Ｈ ． ～７ ０时
ｃ ｌ 的 ａ ｐ 在 毕赤酵 母 中表达 ， ｏｉ ｐＡ 不但 产量 提高 ， 而且 一些 理化性 质也 发生 改变 ， 这些 不 同的性质 可能对
植 酸酶在 饲料 中的应 用产 生直 接影 响＿ ． ７ 有研 究 表 明 ， ｃｌ ＫＩ ］ Ｅ．ｏｉ ２的植 酸 酶 （ ｐ Ａ） ａ ｐ 及其 突变 体植 酸 酶 （ｐ Ａ ＮＲ） ａｐ 和黑 曲霉 植酸 酶 （ ｈ Ａ） 毕 赤 酵母 中分 别 进 行 了 表达 ｌ ， 达 量 得 到 了很 大 的提 高 ， ｐｙ 在 ８ 表 然 而很 少有 人对 它们 的酶学 性质 进行 综 合 的 比较． 因此本 实 验 中以毕 赤 酵母 ＧＳ １ １ ５为 宿 主 ， 表达 ３种 不 同来 源 的植酸 酶 ａ ｐ ＮＲ、ｐ Ａ、ｈ Ａ， 后通 过酶 学性 质 比较 这 ３种植 酸酶 的最适 ｐ 温度 、 稳定 ｐ Ａ ａｐ ｐ ｙ 然 Ｈ、 热 性及 对 胃、 胰蛋 白酶 的耐 受性 ． 结果 表 明 ， 论 是 在 热 稳定 性 、 Ｈ 范 围 ， 是 在 胃蛋 白酶 和 胰蛋 白酶 的 无 ｐ 还 耐 受性上 ，ｐ Ａ ＮＲ都 比野 生 型植 酸 酶 ａ ｐ ８和黑 曲霉 ｐ ｙ 口 ａｐ ｐ Ａ［ ］ ｈ Ａ 叩更具 备工业 饲料 需要 的酶学 特性 ．
ｐ Ｍｇ ５ — ｈ Ａ 为 本研 究室保 存 ． ＨＢ ０ Ａ ｐ ｙ １ ２ 植 酸酶 的发 酵 ． ３ 不 同来 源 的植 酸 酶 ａ ｐ ａ ｐ 种 ｐ Ａ、ｐ Ａ ＮＲ、 ｈ Ａ 均来 自实 验 室重 组 毕赤 酵母 菌 株 ｐｙ
发 酵． 酸酶 毕 氏酵母 的诱导 按 Ｉｖｔｏ ｅ 植 ｎ ｉ ｇ ｎ公 司的毕 氏酵母 操作 手册 进行 ． ｒ