参一胶囊Rg3诱导小鼠黑色素瘤细胞凋亡
文章编号：１００７－４２８７（２０１０）０４－０５２６－０２
参一胶囊（Ｒｇ３）诱导小鼠黑色素瘤细胞凋亡
孙宝胜１，张 矛２，刘林林２，孙 晶３，侯吉光４
（１．吉林省肿瘤医院放疗三科，吉林长春１３００２１；２．吉林大学第二医院肿瘤生物治疗科；
３．吉林大学第二医院药剂科；４畅吉林大学第二医院放疗科）
摘要：目的 探讨参一胶囊（Ｒｇ３）对小鼠黑色素瘤细胞的生长抑制及其诱导凋亡的作用。方法 ＭＴＴ法检测参一胶囊（Ｒｇ３）对黑色素瘤细胞生长的影响；流式细胞仪检测细胞凋亡。结果 参一胶囊（Ｒｇ３）对小鼠黑色素瘤细胞生长有显著的抑制作用，并能显著诱导细胞发生凋亡，其作用呈明显的量效和时间依赖性关系。结论 参一胶囊（Ｒｇ３）诱导小鼠Ｂ１６－４Ａ５黑色素瘤细胞凋亡，抑制细胞增殖。
关键词：参一胶囊；黑色素瘤细胞；细胞凋亡
中图分类号：Ｒ９６５文献标识码：Ａ
ＭｅｌａｎｏｍａｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｄｕｃｅｄｗｉｔｈＲｇ３ ＳＵＮＢａｏ－ｓｈｅｎｇ１，ＺＨＡＮＧＭａｏ２，ＬＩＵＬｉｎ－ｌｉｎ２，ｅｔａｌ．（１．ＪｉｌｉｎＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＴｕｍｏｒＨｏｓ－ｐｉｔａｌ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３００１２，Ｃｈｉｎａ；２．ＴｈｅＳｅｃｏｎｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＪｉｌｉｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆＲｇ３ｏｎｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆｍｅｌａｎｏｍａＢ１６－４Ａ５ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ＴｈｅｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｗｅｒｅａｓｓｅｓｓｅｄｗｉｔｈＭＴＴｍｅｔｈｏｄａｎｄｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｒｇ３ｈａｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｏｎＢ１６－４Ａ５ｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈ，ａｎｄｉｎｄｕｃｅｄｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｗｉｔｈａｄｏｓｅ－ａｎｄｔｉｍｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｍａｎｎｅｒ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｒｇ３ｃａｎｉｎｈｉｂｉｔＢ１６－４Ａ５ｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈａｎｄｉｎｄｕｃｅａｐｏｐｔｏｓｉｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｒｇ３；ｍｅｌａｎｏｍａｃｅｌｌ；ａｐｏｔｏｓｉｓ
（ＣｈｉｎＪＬａｂＤｉａｇｎ，２０１０，１４：０５２６）
人参皂苷Ｒｇ３是从人参中提取的有效单体成分。研究证明，人参皂苷Ｒｇ３可通过抑制肿瘤血管形成，阻断肿瘤的浸润和转移［１，２］；提高肿瘤病人免疫力，抑制转移，并降低肿瘤病人放、化疗后毒副作用［３］。本文通过观察人参皂苷Ｒｇ３对黑色素瘤细胞的存活率及细胞凋亡的变化，为其临床应用提供重要的实验依据。
１ 材料与方法
１．１ 试剂
细胞培养液、小牛血清、青霉素、链霉素、谷氨酰胺、胰酶和磷酸盐缓冲液均购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司（Ｐａｉｓｌｅｙ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ，ＵＫ）。Ｔａｕｒｏｌｉｄｉｎｅ（Ｔａｕｒｏｌｉｎ）溶剂由ＧｅｉｓｔｌｉｃｈＰｈａｒｍＡＧ（Ｗｏｌｈｕｓｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）赠送。其他的化学试剂均购于ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ公司（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。
１．２ 细胞及培养
小鼠黑色瘤细胞（Ｂ１６－４Ａ５）购于美国细胞库（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）。Ｂ１６－４Ａ细胞均在含有１０％小牛血清、青霉素（１００Ｕ?ｍｌ－１）和谷氨酰胺（２ｍｍｏｌ?Ｌ－１）的ＤＭＥＭ培养液培养，并在３７℃、５％ＣＯ２孵箱中贴壁生长。１×１０５?ｍｌ－１。将Ｂ１６－４Ａ５细胞种植在９６孔培养板（１００μｌ?ｗｅｌｌ－１）２４ｈ后，分别给予不同浓度的ｔａｕｒｏｌｉ－
ｄｉｎｅ，并确定最终浓度分别为０、１０、２５、５０、１００和２００μｍｏｌ?Ｌ－１。５％的ＰＶＰ作为空白对照组。Ｂ１６－４Ａ５细胞在３７℃、ＣＯ２孵箱中培养２４和４８ｈ后，给予１００μｌＭＴＴ（５．０ｇ?Ｌ－１），３７℃继续培养３ｈ，终止培养，吸去上清，每孔加入１５０μＬ二甲基亚砜，振荡１０ｍｉｎ在酶联免疫吸附仪上测量各孔光吸收值（ＣＰＭ）。细胞生长抑制率（％）＝（１－实验组ＣＰＭ值／对照组ＣＰＭ值）×１００％。
１．４ 流式细胞术检测细胞凋亡
待Ｂ１６－４Ａ５细胞接近对数生长期，常规消化细胞，制成２．５×１０５?ｍＬ－１细胞悬液，接种于６孔培养板中。２４ｈ后，实验组给予上述不同浓度的ｔａｕｒｏｌｉ－ｄｉｎｅ。５％的ＰＶＰ作为空白对照组。Ｂ１６－４Ａ５细胞在３７℃，ＣＯ２孵箱中培养２４和４８ｈ后，将贴壁及悬浮的细胞离心，收集后震荡、混匀，在碘化丙啶（ＰＩ）混合溶液中（５０ｍｇ?Ｌ－１ＰＩ，３．４ｍｍｏｌ?Ｌ－１ｓｏｄｉｕｍｃｉｔ－ｒａｔｅ，１．０ｍｍｏｌ?Ｌ－１Ｔｒｉｓ，０．１ｍｍｏｌ?Ｌ－１ＥＤＴＡ，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００），并在４℃环境中避光培养４－６ｈ。流式细胞仪（ＢＤｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ，ＣＡ）进行
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—ＣｈｉｎＪＬａｂＤｉａｇｎ，Ａｐｒｉｌ，２０１０，Ｖｏｌ１４，Ｎｏ．４
细胞凋亡实验报告
实验七、Hela细胞凋亡诱导及检测 一、实验目的 学习细胞凋亡诱导及检测。 二、实验原理 1.细胞凋亡是多细胞有机体为调控机体发育，维护内环境稳定，由基因控制的细 胞主动死亡过程，是细胞衰老自然死亡的主要方式之一，是一种自然的生理学 过程。与细胞坏死不同，不会引起炎症反应，不释放细胞内容物。 2.DAPI是一种荧光染料，它可以与DNA双螺旋的凹槽部分发生相互作用，从而与 DNA紧密结合，可在紫外下激发蓝光。 三、实验材料 8.8mol/L的H2O2溶液，甲醇，PBS溶液，10μg/mL的DAPI染液 四、实验步骤 1.细胞传代（上一次实验完成） 2.凋亡诱导 1)取做H.E染色的小皿，加H2O2溶液150μL使终浓度为0.8mol/L 2)24小时后收集细胞进行染色和形态学观察。 3. 染色 1）收集细胞，观察，贴壁细胞较多，直接用PBS溶液洗 2）吸出洗液，加入500μL甲醇，室温固定10min 3）倒掉甲醇，PBS洗净，加500μLPBS溶液和50μLDAPI母液，于37℃染色10min 4）倒掉染液，用PBS洗净（注意避光），加入500μLPBS溶液，倒置荧光显微镜 下观察并拍照。 五、实验结果与分析 1.观察： 实验开始前镜检： 细胞贴壁较多，细胞有的仍呈不规则状，有的细胞已皱缩，还有一些细胞呈圆形浮在培养基中，核质分界不明显。可以看到有的细胞处于裂解状态。 染色后： 由于DAPI染料只对核进行染色，所以在紫外下只可见核的结构。 视野里最多的是正常细胞，其特点是染色质均一且核表面光滑，说明凋亡是不同步的。 凋亡各时期的细胞也都可见，其主要特点是染色不均一。凋亡前期和中期的细胞较多。很少看到凋亡末期的细胞，除了这个时期细胞较少外，还可能因 为在前期操作中很多凋亡小体被洗掉了。而且有的细胞在正常光下观察是明显 的裂解状态，但是到紫外光路下就变得很不明显了。 另外，可以看到很多分裂期的细胞，其特点为染色深，细胞核染色质浓缩，但是看起来较均一，往往有对称性，特别是分裂末期的细胞两个子细胞会靠在 一起。 2.照片及分析：
细胞凋亡实验步骤及注意事项
细胞凋亡实验步骤及注意事项 一、实验目的 1、掌屋凋亡细胞的形态特征 2、学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞与坏死 细胞的方法 二、实验原理 细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡与坏死两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界,在生物个体与生存中起着非常重要的作用。它就是细胞在一 定生理条件下一系列顺序发生事件的组合,就是细胞遵循一定规律自己结束生命 的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学与生物化学特征。 在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触,细胞变园,细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网与细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体,凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外,不会影响其它细胞,因而不引起炎症反应。 在生物化学上,多数细胞凋亡的过程中,内源性核酸内切酶活化,活性增加。核DNA 随机地在核小体的连接部位被酶切断,降解为180-200bp或它的整倍数的各种片断。如果对核DNA进行琼脂糖电泳,可显示以180-200bp为基数的DNA ladder(梯状带纹)的特征。 相比之下,坏死就是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细胞在坏死早期 即丧失质膜完整性,各种细胞器膨胀,进而质膜崩解释放出其中的内容物,引起炎症反应,坏死过程中细胞核DNA虽也降解,但由于存在各种长度不等的DNA片断,不能形成梯状带纹,而呈弥散状。 一些温与的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡,通常这些因素在诱导凋亡的同时,也可产生细胞坏死,这取决于损伤的剧烈程度与细胞本身对刺激的敏感 程度。 三尖杉酯碱(HT)就是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病,急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明HT在0、02~5μg/ml范围内作用2小时,即可诱导HL-60细胞凋亡,并表现出典型的凋亡特征。本实验用1μg/ml HT在体外诱导培养的HL-60细胞发生凋亡,同时也有少数细胞发生坏死。用 Hoechst33342与碘化丙啶(propidium iodide,PI)对细胞进行双重染色,可以区别凋亡、坏死及正常细胞。 细胞膜就是一选择性的生物膜,一般的生物染料如PI等不能穿过质膜。当细胞坏死时,质膜不完整,PI就进入细胞内部,它可嵌入到DNA或RNA中,使坏死细胞着
细胞凋亡试验常用的方法
细胞凋亡试验常用的方法（MTT法、荧光法、DNA琼脂糖凝胶电泳法与流式细胞仪检测法） （一）药物对肿瘤细胞的抑制效应的MTT法： 用培养基将肿瘤细胞调整至2 X108个/L，在96孔板中每孔加入100ul细胞悬液于37℃、5% CO2下培养过夜。 次日每孔加入不同浓度的药物100mg/L作为试验组，设加完全培养基不加药物的阴性对照，并用功能明确的药物为阳性对照和0.5%的乙醇溶剂对照，每组均设4-6个复孔（平行孔）、37℃、5% CO2继续培养。 培养至12h、24h、48h、实验终止前4-6h加入10ulMTT（5g/L），培养4-6h后，阴性对照孔中已形成明显的蓝紫色颗粒结晶时加100ul/孔SDS-HCl终止反应，于37℃存放过夜。 用酶标仪在A570波长下测吸光度值，按下式计算抑制率 抑制率（%）=（1-试验组平均吸光度值/阴性对照组平均吸光度值）x 100%。 （二）荧光法： 选用上述最佳浓度作用于肿瘤细胞，培养细胞48h后，收货细胞用PBS洗2-3次后用0.4%多聚甲醛室温下固定30min。 弃去固定液，并用PBS洗2次后，用1%Triton X-100作用4min加入适量的0.5mg/L DAPI 荧光染色60min，用PBS冲洗3次，取10ul滴片，干燥后于荧光显微镜下检测断裂的颗粒和片状荧光。 （三）DNA琼脂糖凝胶电泳法： 1、DNA提取： 用大方瓶培养肿瘤细胞，每瓶10ml，细胞浓度为3 x 108个/ml，每隔药物浓度、作用时间均设2瓶，共分3个时间段，4个药物浓度。共培养26瓶细胞。 分别于细胞中加入不同浓度的药物，于37℃、5% CO2中分别培养12h、24h、48h，收货细胞，用PBS洗2-3次。 于-20℃将细胞冷却处理10min后将细胞收集至离心管中，加1ml细胞裂解液，再加蛋白酶K，轻轻振摇使悬液混匀，成黏糊状，50℃过夜。 冷却后加入等体积的饱和酚溶液，混合后10000r/min离心10min，吸出上层水相，移至另一离心管中，再加入等体积饱和酚溶液重复抽提一次，直到无蛋白为止。 吸上清加入氯仿/异戊醇（24：1）按上述方法再抽提一次。 吸取水相层加入1/10体积的3mol/L的醋酸钠溶液，混匀。 再加入2.5倍体积冷无水乙醇，混合置-20℃处理30min后，10000r/min离心10min，沉淀部分为提供的DNA，弃去无水乙醇后用70%乙醇漂洗2次，将离心管倒扣在吸水纸上，吸干乙醇。 加入200ulTE缓冲液融解DNA，再加入25ul的RNA酶，置37℃作用30min，置4℃冰箱保存。 2、琼脂糖凝胶电泳： TBE缓冲液配制1.8%琼脂糖凝胶。在微波炉内煮沸至琼脂糖融解，待冷却至60℃时，加入溴化乙锭，使其终浓度为0.5mg/ml，混匀后灌胶。 待凝胶固定后放入含TBE电泳液的电泳槽内，使TBE电泳液盖过凝胶。 取10-15ul提取的各组DNA样品液与上样缓冲液按4：1比例混匀后点样。 60V电泳1h，用紫外透射仪观察梯形条带。
病毒感染与靶细胞凋亡
病毒感染与靶细胞凋亡 【摘要】病毒感染与靶细胞凋亡之间存在着密切的关系,细胞凋亡在维护机体正常功能中发挥着重要作用,宿主细胞的凋亡,导致被感染细胞的死亡和病毒的清除;病毒为了生存与扩散而抑制凋亡。在病毒感染引起细胞凋亡的过程中有许多基因和蛋白得到表达,并参与作用。另外，细胞因子和免疫细胞也直接或间接地参与了该过程。对细胞凋亡与病毒感染关系的进一步研究,为病毒感染性疾病的预防和诊治提供新的思路和手段。 【关键词】细胞凋亡病毒感染 细胞凋亡（apoptosis）又称程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD）,是多细胞有机体为调控机体发育,维护内环境稳定,由基因控制的细胞主动死亡过程,是一种生理性细胞死亡。细胞凋亡既可自发产生,也可由特殊介导物在一定条件下诱导产生。 病毒（virus）是一种非细胞型的微生物,个体微小,结构简单,由蛋白质与核酸组成,缺乏产生能量的酶系统,只能在敏感的活细胞内以复制的方式进行增殖,为 严格细胞内寄生。病毒侵入机体并在易感细胞内复制增殖,与机体发生相互作用的过程称为病毒感染。病毒感染细胞后,宿主细胞对病毒感染表现出不同的反应:（1）细胞无明显变化；（2）因病毒的致细胞病变效应（cytopathic effect,CPE ）,引起细胞损伤、死亡；（3）引起细胞增生,继而使细胞死亡或使细胞继续生长失去生长控制,转化为癌细胞。
越来越多的资料表明,病毒感染与细胞凋亡有着密切的联系。一方面,病毒感染诱导细胞凋亡。另一方面,病毒感染抑制细胞凋亡。本文就近年来有关病毒感染诱导和抑制细胞凋亡的研究进展做一简述。 1 病毒感染诱导细胞凋亡 病毒感染细胞的凋亡,大多数由病毒编码的蛋白产物直接诱导,其次是病毒感染机体后,刺激机体细胞产生细胞免疫反应间接诱导。其机制是病毒感染细胞后通过关闭或干扰宿主细胞正常合成代谢诱发细胞凋亡,或由病毒编码的蛋白因子直接作用于细胞与凋亡有关的因子及蛋白水解酶而诱发细胞凋亡，主要有以下几种方式。 1.1 病毒蛋白直接诱导病毒进入机体细胞后,表达一些蛋白将会引起细胞凋亡过程。如人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus,HIV）是获得性免疫缺陷综合征（acquire immune deficiency syndrome,AIDS）病因。当HIV侵入人体后,能选择性地侵犯CD4分子的细胞,CD4分子是HIV包膜蛋白gp120的受体,结合后可激活钙通道,使CD4+细胞胞内Ca2+浓度增高,导致CD4+细胞凋亡。最终引起以CD4分子细胞缺损和功能障碍为中心的严重免疫缺陷,从而导致机会性感染和肿瘤。再如VBV的HBx蛋白、EB病病毒的gp350、HPV病毒的E2和E7蛋白［1，2］。 1.2 细胞毒性T淋巴细胞（CTL）间接诱导病毒感染机体后,刺激免疫系统,
指甲黑色素瘤早期症状黑色条纹
黑色素瘤一般指恶性黑素瘤，是一种能产生黑色素的高度恶性肿瘤。大多见于30岁以上成年人，发生于皮肤、粘膜和内脏器官。黑色素瘤的预后多数较差，晚期可有淋巴道及血液转移。是由皮肤和其他器官黑素细胞产生的肿瘤。虽其发病率低，但其恶性度高，转移发生早，死亡率高，因此早期诊断、早期治疗很重要。下面就给大家介绍一下指甲黑色素瘤的早期症状，帮助患者更好治疗疾病。 指甲黑色素瘤早期症状 指甲下黑线或黑褐色病变突然增大，尤其在45岁以上者;甲下损伤治疗经久不愈者;指(趾)外伤后持续存在甲下损害症状者;病情发展迅速，局部溃烂严重者。当患者发现以上几种情况时，应及时切取甲下组织行病理学检查，这样就可以及早明确诊断。 指甲黑色素瘤真正要担心的是只有一个指甲出现黑色条纹，此时可能是良性黑色素瘤、指甲下出血或恶性黑色素瘤，或反复局部外伤、摩擦刺激甚至是甲癣的结果。由此可见，指甲黑色素瘤患者要时刻注意自己的身体健康，当发现以上现象时一定要及时到正规的皮肤病医院进行检查治疗，以免引起慢性肾衰竭，进而威胁到患者朋友们的生命健康。 指甲黑色素瘤一旦诊断，患者一定要及时治疗，临床上治疗黑色素瘤的方法主要有手术、放化疗和中医治疗等。手术是黑色素瘤的首选治疗方法，尤其是早期患者。通过手术对癌肿的切除可快速、有效控制病情发展，提高患者的5年生存率。由于黑色素瘤对放化疗不敏感，放化疗多作为手术治疗的辅助治疗方法或晚期患者的姑息治疗方法，通过对机体内癌细胞的杀伤控制病情扩散、转移，在一定程度上延长患者的生存期。但需要注意的是，手术不仅会对机体造成较大创伤，而且还无法完全切除病灶，术后会伴随多种并发症，甚至出现复发、转移。而放化疗由于在杀伤癌细胞过程中也会损伤正常细胞，从而造成严重的毒副作用，需要患者特别警惕。 中医治疗是我国传统医学治疗方法，中医治疗的最大优势在于标本兼治，治疗过程中不仅能够杀伤机体内癌细胞，控制病情发展，而且还能够调理机体，增强机体的免疫力和抵抗力，对促进患者康复，降低其复发、转移几率有重要作用。如中医中口碑较好的三联平衡疗法，既可以单独作用于患者，而且还能够辅助其他治疗方法，如辅助手术、放化疗可达到增效排毒功效，促进患者早日实现康复或长期带瘤生存。 以上就是关于指甲黑色素瘤早期症状的介绍，希望对广大患者有帮助，总之患者一旦发现以上症状，及时的到正规的医院做检查，做到早发现早治疗，减少黑色素瘤对人们的伤害。
Annexin V-FITC PI细胞凋亡检测试剂盒
Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒 Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit 一、试剂盒说明 在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS ）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS ）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V 是一种分子量为35~36kD 的Ca 2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V 被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V 进行荧光素FITC 标记，以标记了的Annexin V 作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。 碘化丙啶（Propidium Iodide, PI ）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V 与PI 匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。 本试剂盒可应用于培养细胞凋亡检测（不推荐用于检测组织样本）。 二、试剂盒组份 组份 (20 assays) (50 assays) (100 assays) 储存条件 AnnexinV-FITC 100 μL 250μL 500 μL Propidium Iodide 100 μL 250μL 500 μL Binding Buffer 10.0 mL 25 mL 50 mL 注：1、Annexin V-FITC 组份建议按需分装小份冻存于-20 ℃，避免反复冻融； 2、Propidium Iodide 和Binding Buffer 组份不用时可放置于4℃保存，Propidium Iodide 需要避光。 3、Store at -20℃ for 12 months 三、试剂盒以外自备仪器和试剂 流式细胞仪或荧光显微镜、低速离心机、微量移液器 1.5m L Microtube 、载玻片、盖玻片（荧光显微镜观察需用）、PBS 、不含EDTA 的胰酶消化液 四、使用注意事项 1. 微量试剂取用前请离心集液。 2. Annexin V-FITC ，Propidium Iodide （PI ）避光保存及使用。对于Annexin V-FITC 这个组份，建议您在收到产品之后，分装为小份避光保存于-20℃，即用即取。 3. Propidium Iodide （PI ）有毒，操作时要戴手套。 4. 本试剂盒适用于检测活细胞，流式细胞仪检测时，细胞数量不以应低于1×105，不推荐用于检测组织样本。 5. 推荐使用悬浮培养细胞。如果是贴壁细胞，需用不含EDTA 的胰酶消化，如消化不当，可能引起假阳性，而 用细胞刮子会造成细胞粘连成团，而影响检测。可将胰酶消化后细胞的保存在含2%BSA 的PBS 中，防止进一步的损伤。 6. 细胞固定后可能导致荧光的淬灭，请不要固定样品。 7. 因检测细胞的类型、凋亡诱导剂种类、使用的检测仪器不同，因而流式检测的荧光补偿也不同，因此建议每 次检测均需使用未经凋亡诱导处理的细胞作为对照，进行荧光补偿的调节。 五、 操作方法 1. 悬浮细胞离心（2000rpm 离心5min ）收集；贴壁细胞用不含EDTA 的胰酶消化收集（注：胰酶消化时间不 易过长，否则容易引起假阳性）； -20℃避光 4℃避光 4℃
细胞凋亡与疾病
细胞凋亡与疾病 一、基本要求 （一）掌握细胞凋亡的概念、生物学意义 （二）掌握细胞凋亡的发生机制 （三）熟悉细胞凋亡的过程及细胞凋亡与坏死的差别 （四）熟悉细胞凋亡的主要变化 （五）熟悉细胞凋亡的调控 （六）了解细胞凋亡与常见疾病或病理过程的关系 （七）了解细胞凋亡在疾病防治中的意义 二、知识点纲要 一、基本概念 （一）细胞凋亡的定义：由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞自杀过程称为细胞凋亡(apoptosis)，也称为程序性细胞死亡(programmed cell death， PCD)。 （二）细胞凋亡的基本过程 1．凋亡信号转导 2．凋亡基因激活 3．细胞凋亡的执行 4．凋亡细胞的清除 （三）凋亡时细胞的主要变化 1．细胞凋亡的形态学改变：胞膜空泡化，细胞固缩，染色质边集，凋亡小体。 2．细胞凋亡的生化改变：DNA“梯”状条带，内源性核酸内切酶激活，caspases（凋亡蛋白酶）激活。 （四）细胞凋亡的调控 1．细胞凋亡相关因素 细胞凋亡相关因素分诱导性因素和抑制性因素两大类 (1) 诱导性因素:激素和生长因子失衡,理化因素,免疫性因素,微生物等 (2) 抑制性因素: 某些激素（ACTH、睾丸酮）或细胞因子(IL-2，神经生长因子等) 的去除,某些二价金属阳离子如:Zn2+，药物如: 苯巴比妥、半胱氨酸蛋白酶抑制剂，病毒如：EB病毒，牛痘病毒CrmA等及中性氨基酸具有抑制细胞凋亡的作用。 2. 细胞凋亡信号的转导 (1)特点:凋亡信号转导系统是连接凋亡诱导因素与核DNA片段化断裂及细胞结构蛋白降解的中间环节。这个系统的特点是:①多样性;②偶联性;③同一性;④)多途性。 （2）研究较多的信号转导系统有：①胞内Ca2+信号系统；②cAMP/ PKA信号系统；③) Fas蛋白/Fas配体信号系统；④神经酰胺信号系统；⑤二酰甘油/蛋白激酶C信号系统；⑥酪氨酸蛋白激酶信号系统。 （五）凋亡相关基因 细胞凋亡相关基因多达数十种，根据功能的不同可将其分为三类:抑制凋亡基因（EIB、I AP、Bcl-2），促进凋亡基因（Fas、Bax、ICE、P53），双向调控基因（c-myc、Bcl-x）。 1． Bcl-2 是抑制凋亡的基因。 2.Fas Fas基因的表达可促进细胞凋亡。 3．p53 野生型P53基因具有诱导细胞凋亡的功能，当该基因发生突变后反而可抑制细胞凋亡。 4. c-myc，Bcl-x c-myc是一种癌基因，它能诱导细胞增殖，也能诱导细胞凋亡，具有
细胞凋亡实验技术总结
细胞凋亡实验技术总结 一形态学检测 1、光学显微镜和倒置显微镜观察法 未染色细胞:凋亡细胞体积变小、变形，膜完整但出现发泡现象，晚期出现凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩，变圆，脱落。染色细胞:姬姆萨染色，瑞氏染色等。凋亡细胞染色质浓缩，边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状，形成凋亡小体。 2、荧光显微镜检测法-荧光染料 例如，碘化丙啶(PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核红染。选用536nm 激发光，细胞核呈红色荧光。 3、电子显微镜 收集细胞，2.5%戊二醛4°C 固定24h，1%四氧化锇后固定，丙酮梯度脱水，经包埋剂浸透后环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸铀和枸橼酸铅双重染色，透射电镜观察。凋亡Ⅰ期的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象的空泡结构。Ⅱa 期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。 4、激光扫描共焦显微镜技术 FITC-AnnexinV+PI双染，观察凋亡过程中细胞膜PS表面的变化，并区分正常细胞(An-PI-)，早期凋亡细胞(An+PI-)，晚期凋亡细胞及坏死细胞(An+PI+)，细胞收集过程中出现的损伤细胞(An-PI+)。 二、细胞凋亡的生化及分子生物学检测 1、DNA 断裂检测法 如使用琼脂糖凝胶电泳检测，细胞凋亡时，核染色质凝聚，染色质DNA 在核小体单位之间的连接处断裂。凋亡早期可形成50~300kbp 的DNA 大片段，晚期核酸内切酶在核小体之间剪切核DNA，产生大量长度在180~200bp 整数倍的寡核苷酸片段。 2、膜联蛋白V 法 磷脂酰丝氨酸(PS)位于正常细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS 可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜表面。Annexin-Ⅴ(膜联蛋白-V)是一种分子量为35-36KD 的Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白，与PS高亲和力。将Annexin-Ⅴ进行荧光素或生物素标记，以标记了的Annexin-Ⅴ作为探针，利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。 3、细胞凋亡的酶Caspase检测 检测Caspase活力可用免疫杂交技术分析酶原的加工和底物水解的产物，或用人工底物检测酶活力，也可对活化的Caspase做亲和标记。例如分析底物的水解产物，PARP(多聚ADP-核糖聚合酶)第一个被认识的caspase-3底物，它的相对分子质量为116000，水解后形成相对分子质量为85000 及相对分子质量为25000 的两个片段，用抗相对分子质量为85000 片段的抗体检测细胞是否发生凋亡。 4、线粒体膜势能变化的检测 线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱反映了线粒体内膜电负性的增高或降低流式细胞仪检测细胞的荧光强度或荧光显微镜观察，拍照正常细胞中, Rh123 能够依赖线粒体跨膜电位进入线粒体基质，荧光强度减弱或消失。而凋亡时，线粒体膜完整性破坏，线粒体膜通透性转运孔开放，引起线粒体跨膜电位的崩溃, Rh123 重新释放出线粒体, 从而发出强黄绿色荧光。
实验14-细胞凋亡的诱导和检测
实验14 细胞凋亡的诱导和检测 20世纪60年代人们注意到细胞存在着两种不同形式的死亡方式：凋亡（apoptosis）和坏死（necrosis）。细胞坏死指病理情况下细胞的意外死亡，坏死过程细胞膜通透性增高，细胞肿胀，核碎裂，继而溶酶体、细胞膜破坏，细胞容物溢出，细胞坏死常引起炎症反应。 细胞凋亡apoptosis一词来源于古希腊语，意思是花瓣或树叶凋落，意味着生命走到了尽头，细胞到了一定时期会像树叶那样自然死亡。凋亡是细胞在一定生理或病理条件下遵守自身程序的主动死亡过程。凋亡时细胞皱缩，表面微绒毛消失，染色质凝集并呈新月形或块状靠近核膜边缘，继而核裂解，由细胞膜包裹着核碎片或其他细胞器形成小球状凋亡小体凸出于细胞表面，最后凋亡小体脱落被吞噬细胞或邻周细胞吞噬。凋亡过程中溶酶体及细胞膜保持完整，不引起炎症反应。细胞凋亡时的生化变化特征是核酸切酶被激活，染色体DNA被降解，断裂为50～300 kb长的DNA片段，再进一步断裂成180～200bp整倍数的寡核苷酸片断，在琼脂糖凝胶电泳上呈现“梯状”电泳图谱(DNA Ladder)。细胞凋亡在个体正常发育、紫稳态维持、免疫耐受形成、肿瘤监控和抵御各种外界因素干扰等方面都起着关键性的作用。 1．细胞凋亡的检测方法 凋亡细胞具有一些列不同于坏死细胞的形态特征和生化特征，据此可以鉴别细胞的死亡形式。细胞凋亡的机制十分复杂，一般采用多种方法综合加以判断，同时不同类型细胞的凋亡分析方法有所不同，方法选择依赖于具体的研究体系和研究目的（表？）。
形态学观察方法：利用各种染色法可观察到凋亡细胞的各种形态学特征： （1）DAPI时常用的一种与DNA结合的荧光染料。借助于DAPI染色，可以观察细胞核的形态变化。 （2）Giemsa染色法可以观察到染色质固缩、趋边、凋亡小体形成等形态。 （3）吖啶橙(AO)染色，荧光显微镜观察，活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。 （4）吖啶橙(A())／溴化乙啶(EB)复染可以更可靠地确定凋亡细胞的变化，AO只进入活细胞，正常细胞及处于凋亡早期的细胞核呈现绿色；EB只进入死细胞，将死细胞及凋亡晚期的细胞的核染成橙红色。 （5）台盼蓝染色对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助，如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。使用透射电镜观察，可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。 （6）木精-伊红（HE）染色是经典的显示细胞核、细胞质的染色方法，染色结果清晰。发生凋亡的细胞经HE染色后，其细胞大小的变化及特征性细胞核的变化：染色质凝集、呈新月形或块状靠近核膜边缘，晚期核裂解、细胞膜包裹着核碎片“出芽”凸出于细胞表面形成凋亡小体等均可明显显示出来。 DNA凝胶电泳：细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞小分子 质量DNA片段增加，高分子DNA减少，胞质出现DNA片段。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180～200 bp DNA片段，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片段，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。
恶性黑色素瘤
恶性黑色素瘤 一、 流行病学恶性黑色素瘤是一种来源于黑色素细胞的高度恶性肿瘤。该病起病隐袭、高度恶性、预后很差，临床上也比较少见，约占皮肤恶性肿瘤的1%左右。恶性黑色素瘤可见于任何年龄，较多见于中年和老年，女性稍多于男性。该病多发生于白色人种，尤其是有日晒史的人群，美国的年发病率约为10-15/10万，澳大利亚的昆士兰邦的年发病率高达16／10万，而我国的发病率较低，约为0.4-0.5/10万。但是近年来，不论国内或国外，恶性黑色素瘤的发病率均在不断上升。同样，死亡率也在不断增加，澳大利亚、新西兰的恶性黑色素瘤死亡率最高（5－6/10万），中国和日本较低（约0.2/10万）。 二、 临床表现 （一）发生部位 恶性黑色素瘤可发生于身体的任何部位，最常见于女性的四肢和男性的躯干，多发生于皮肤和邻近皮肤的粘膜，故而也常称皮肤恶性黑色素瘤。亦可见于眼球的色素膜、脑膜的脉络膜丛、以及消化道粘膜等皮肤以外的部位。皮肤黑色素瘤起源于与黑色素细胞有关的皮损，起初通常为棕色或蓝黑色小点，呈浸润性生长，生长迅速，质韧无毛，大小不等，迅速破溃，沿淋巴管可见细线状色素沉着，围绕原发灶可出现多发的隆起型卫星结节。 （二）皮肤恶性黑色素瘤分型： 1．表浅播散型黑色素瘤（SSM）：占所有皮肤恶性黑色素瘤的70%，早期为扁平状，至垂直生长期时皮损进一步增大，周边呈锯齿状。 2．结节型黑色素瘤（NM）：占所有皮肤恶性黑色素瘤的15-30%，侵袭性较强，颜色较深，多为蓝黑色，类似血泡或血管瘤，也有红色、灰色、紫色，甚至无色。 3．雀斑型黑色素瘤（LMM）：较少见，约占所有皮肤恶性黑色素瘤的4-10%，几乎均局限于头颈部，多为棕黄色皮损，周边纤细迂曲，呈锯齿状，较少出现转移。 4．肢端雀斑型黑色素瘤（ALM）：仅占所有皮肤恶性黑色素瘤的2-8%，病变特征性出现于手掌、足底或甲床下，呈棕黄色或褐色，可突然出现颜色改变。多发生于老年人，发病较快，侵袭性强，容易出现转移。除了皮肤以外，约有10%的恶性黑色素瘤发生于皮肤以外的部位，其中常见的部位包括眼球的色素膜、脑膜的脉络膜丛、以及消化道粘膜等。其中色素膜黑色素瘤是眼内最常见的恶性肿瘤，根据发生的部位可以分为虹膜、睫状体和脉络膜黑色素瘤，一般生长缓慢、恶性程度较低、预后优于皮肤黑色素瘤。消化道粘膜黑色素瘤发生率不高，主要发生于肛门区，临床无特异性症状，淋巴结常受累，预后较差，还可发生于口腔粘膜或食管粘膜。淋巴结是恶性黑色素瘤最常见的转移部位，主要表现为区域淋巴结转移，远处转移常见的部位包括皮肤及软组织、肺、肝脏等。 三、诊断与鉴别诊断 皮肤黑色素瘤可发生于皮肤的任何部位，多见于白皙或光亮的皮肤，尤其有日光暴露史的人群。与含色素的皮损密切相关，当皮损出现以下变化时，常提示早期皮肤恶性黑色素瘤的可能：①颜色改变，尤其以蓝黑色、灰色、棕色和杂色最为重要；②表面不规则隆起、粗糙、脱屑和渗液等；③周边参差不齐，呈锯齿状；④皮损迅速增大、持续瘙痒、结痂或出现卫星
黑色素瘤的原因
黑色素瘤的原因 文章目录*一、黑色素瘤的简介*二、黑色素瘤的原因*三、黑色素瘤的危害*四、黑色素瘤的高发人群*五、黑色素瘤的预防方法黑色素瘤的简介黑色素瘤的征象包括:现有皮肤色素痣的形态或颜色改变、皮肤表面出现隆起物、色素痣瘙痒、局部出现破溃出血、指(趾)甲开裂等 黑色素瘤的原因1、紫外线照射 黑色素瘤的确切病因不清楚,有人认为紫外线照射与其发生有关。白人发病率高于黑人,其原因与白人的黑色素细胞易受紫外线伤害而恶变有关。 2、结构不良痣 恶性黑色素瘤可由表皮基底层内的黑色素细胞发生而来,亦可由原先存在的黑痣基础上恶变而来,一种被称为结构不良痣(DN)的患者易发生恶变,其主要特征为痣呈杂色,即在粉红色的基础上同时伴有红色、棕褐色或黑色,其直径〉5mm,边界不光整。 3、遗传 有家族史的人群中其发病概率比无者高1.7倍。 黑色素瘤的危害1、皮肤黑色素瘤的危害程度高,生长迅速,预后大多很差,因此早期诊断和及时正确治疗十分重要。治疗上
强调早期发现和局部扩大切除。但皮肤黑色素瘤临床表现复杂, 容易误诊,尤其是无色素型黑色素瘤。若未能早期诊断, 黑色素 瘤的病变呈侵袭性发展,早期黑色素瘤患者可出现淋巴转移,晚 期发生血行转移。黑色素瘤的病变位于肢端者,常需行截指(趾) 或截肢术。 2、黑色素瘤是皮肤癌中最危险的一种,黑色素瘤多见于老年人,尤以女性为多。可一开始黑色素瘤即为恶性,但约25%~40%由皮肤色素痣恶变而来。色素加深、体积增大、疼痛、瘙痒、破溃、发炎、出血、周围出现等都是黑色素瘤的恶变的征象。 黑色素瘤的高发人群从人种来看,白种人发病率最高,患此 病的白种人以每年2%—5%的速度递增,50岁以上发病率增高。黑色人种罕见,有色人种发病率也较低。男性与女性的发病机率均等。 常见发病部位为指甲下,手掌及足跖部,四肢及躯干表皮也 常有发现,深部器官如阴道,直肠、食道内发现黑色素瘤也有报道。 为了尽早发现病变,要经常进行皮肤检查,特别是父母子女 中曾有发病史及身上有超过100个黑痣和具有发育不全痣的人。当黑痣有以下情形时应引起高度重视:形状不对称,边界明显不 规则,隆起,色泽不匀,颜色变化大,出现如黑、棕、蓝色或进行性发白等,直径5毫米,无毛,并出现痒、痛,流水、流血等。
淋巴细胞分离和细胞凋亡诱导及形态学观察
细胞生物学实验报告 淋巴细胞分离和细胞凋亡诱导及形态学观察lymphocyte isolation and morphological observation of apoptosis induction 2012年6月2日
淋巴细胞分离和细胞凋亡诱导及形态学观察 lymphocyte isolation and morphological observation of apoptosis induction 摘要：目的了解细胞凋亡的原理，掌握离体诱导细胞凋亡的方法，及用普通光学显微镜和荧光显微镜观察凋亡细胞的形态学变化，并从观察结果初步推断和识别凋亡细胞具体阶段。方法实验所用Hoechst 33342/PI双染检测细胞凋亡、Giemsa染色。结果实验结束后得到了染色的结果以及照片。结论所提取的淋巴细胞发生凋亡。 Abstract：Objective Understand the principles of cell apoptosis, master the methods of cell apoptosis induced by in vitro, and by ordinary optical microscopy and fluorescence microscopy observation of morphological changes of apoptotic cells and preliminary inferred from observations and identifying apoptotic cells specific stages. Method Experimental method used in,Hoechst 33342/PI double dye test and the Giemsa stain. Results Be dyed after the end of the experiment results and photos. Conclusions The extraction of lymphocyte apoptosis. 关键词：细胞凋亡、Giemsa染色、Hoechst 33342/PI双染。 Keyword：cell apoptosis、Giemsa stain、Hoechst 33342/PI double staining 1.实验原理 1.1 关于淋巴细胞的分离 外周血中淋巴细胞比重约为1.070，而红细胞和粒细胞的比重较大，为1.902左右。因此，利用相对密度为1.077±0.002的淋巴细胞分离液（称为分层液）离心，可使一定比重的细胞按相应密度梯度分布（使比重中较大的红细胞和粒细胞沉于管底，淋巴细胞浮于分层液与血浆的界面上），从而将淋巴细胞分离出来。 1.2 关于细胞凋亡 细胞凋亡又称编程性死亡或程序性死亡。细胞凋亡是多细胞生物体在发育过程中或在某些环境因子的作用下发生的受基因调控的主动的死亡方式。细胞凋亡对于多细胞生物个体的正常发育、保持自稳平衡、抵御外界各种因素的干扰及多种病理过程具有极其重要的意义，起着非常重要的作用。细胞凋亡是多种生理、病理因子参与的由凋亡相关基因启动的细胞程序性死亡过程，其中由氧应激造成大量活性氧（reactive oxygen species, ROS）的产生以及继发性细胞损伤过程在细胞凋亡中起着重要作用，如电离辐射或紫外线照射产生大量H2O2、OH-等。 细胞凋亡的诱导因子包括三大类： 1.物理因子：包括射线、较温和的温度刺激（如热激或冷激）等； 2.化学因子：包括活性氧基团和分子、重金属离子等； 3.生物因子：肿瘤坏死因子、生物毒素、抗肿瘤药物、DNA和蛋白质合成的抑制剂等。 细胞凋亡的主要特征包括： 1.染色质凝集、质膜出芽、核裂解及凋亡小体的形成。 2.DNA特异性降解成200bp或其整数倍片断，通过凝胶电泳形成梯状条带，称为DNA Ladder。 3.由于DNA特异性降解而产生大量3’-OH末端，可被末端脱氧核糖核苷酸移换酶介导的dUTP 缺口末端原位标记法（TUNEL）标记，从而产生亮绿色荧光等。
常见的细胞凋亡诱导剂和抑制剂
表1 常见的细胞凋亡诱导剂和抑制剂 诱导剂与抑制剂靶细胞诱导剂 激素地塞米松T细胞 细胞因子IL—2 胸腺细胞 TGF—β肝细胞、上皮细胞、慢性B淋巴瘤细胞 IL—10 髓样白血病细胞 IFN—Υ前B细胞、T细胞抗体抗IgM抗体B细胞 抗IgD抗体B细胞 抗HLA—II抗体静止B细胞 超抗原SPE CD4+T细胞 胞内信号分子调节 剂 放线菌酮T细胞 PKC激活剂胸腺细胞 其他DNA拓扑异构酶抑制 剂 白血病细胞放射线淋巴样细胞 抑制剂 细胞因子IL—2 T H1细胞 IL—4 T H2细胞 IL—10 B、T细胞 IFN—ΥT细胞 IL—4 B细胞 黏附分子LFA—1、ICAM—1 B细胞 VLA—4、VCAM—1 B细胞 胞内信号分子调节 剂 PKC激活剂T、B细胞 细胞凋亡（apoptosis）是一种由基因控制的细胞自主死亡方式。1972年，英国教授Kerr首先提出凋亡的概念。近十余年来，细胞凋亡现象引起了广泛重视，有关的研究工作取得重要进展，并成为医学生物学各学科共同关注的极为活跃的研究领域。 细胞凋亡与组织器官的发育、肌体正常生理活动的维持、某些疾病的发生以及细胞恶变等过程均有密切的关系。
1．形态学变化： 细胞凋亡的形态变化大致可分为三个阶段： 1）胞体缩小，与周围细胞失去联系，细胞器变致密，核体积缩小，核仁消失，染色质浓集于核膜内表面下，形成新月形致密小斑块。 2）染色体断裂，核膜与细胞膜均内陷，包裹胞内成分（胞浆、细胞器、碎裂的染色质及核膜）形成“泡”样结构，此为“凋亡小体”。最后，整个细胞均裂解成这种“小体”。 3）凋亡小体被邻近的巨噬细胞、上皮细胞等识别、吞噬、消化。 上述三个阶段维持时间很短，通常在几分钟、十几分钟内即可完成。 2．细胞凋亡的生化改变： 1）胞内Ca2+浓度增高 所有细胞凋亡过程中均出现胞内Ca2+浓度增高，这可能是Ca2+内流所致。 2）内源性核酸内切酶激活 细胞发生凋亡时，由于内源性核酸内切酶被激活，DNA被从核小体连接处水解，形成180—200bp 或其整倍数的片段。 3）生物大分子的合成 凋亡过程的发生一般依赖于新的RNA和蛋白质的合成，如在激素、射线作用下，或由于去除生长因子等所引起的细胞凋亡中，情况均为如此。 常用的检测方法： 1．形态学方法 借助普通光学显微镜、荧光显微镜或透射电镜可对组织切片、切片涂片或细胞悬液进行形态学观察，凋亡细胞在组织中散在分布，表现为核致密浓染、核碎裂等。该方法简便、经济，可定性、定位。但在组织成分及细胞死亡类型复杂的情况下，难以判断结果，也无法定量。 2．电泳法 对凋亡细胞的基因组DNA进行琼脂凝胶电泳，由于存在180—200bp或其整倍数的片段，故电泳结果可见“梯状”（ladder）DNA条带。该法简便，可定性及定量，但无法显示组织细胞形态结构，也不能反映凋亡细胞与周围组织的关系。
恶性黑色素瘤有哪些常见的临床表现呢
恶性黑色素瘤有哪些常见的临床表现呢?恶性黑色素瘤的它一部分是从黑痣(特别是交界痣和复合痣)演变而来;另一部分则发源于皮肤或雀斑的基础上。黑痣演变为黑色素瘤的真正原因仍然不详，外伤或各种外在刺激常被视为诱因。虽然恶性黑色素瘤是一个发展迅速，容易广泛转移的高度恶性肿瘤。然而其生物行为也有很大变异性，病变可以静止多年，或仅缓慢增大;也可以很快增大，并在短期内转移。 恶性黑色素瘤常见的临床表现有以下几点： 1.良性交界痣镜下所见为良性大痣细胞。并无异性细胞，仅在真皮内生长，其炎性反应不明显。 2.幼年性黑色素瘤于小孩面部呈生长缓慢的圆形结节。镜下见细胞呈多形性，有核分裂，瘤细胞不向表皮浸润，且瘤体表面亦不形成溃疡。 3.细胞性蓝痣好发于臀、尾骶及腰部。呈淡蓝色结节，表面光滑而不规则，镜下可见树枝状突的深黑色细胞，大棱形细胞，并集合成细胞岛。有核分裂相或坏死区时，应考虑到有恶变的可能。 4.基底细胞癌是上皮细胞的恶性肿瘤。由表皮的基底层向深部浸润，癌巢周围为一层柱状或立方形细胞，癌细胞染色深，无一定排列，癌细胞内可含黑色素。 5.老年痣见于老年人体表呈疣状的痣。表皮过度角化，粒层部分增厚或萎缩，棘层肥厚，基层完整。亦可有色素增加，真皮乳头增殖，外观呈乳头瘤样增生。 6.硬化性血管瘤表皮过度角化。真皮乳状增殖，扩张的毛细血管常被向下延伸的表皮突围绕，貌似表皮内血肿一样。 7.脂溢性角化病病灶亦呈乳头瘤样增生。表皮下界限清楚，角化不完全。粒层先增厚，后变薄甚或消失，增生的表皮细胞内可有少量或较多的黑色素。 8.甲床下血肿多有相应外伤史。镜下为干枯的血细胞，可有上皮成纤维细胞增生。 据了解，以上这些恶性黑色素瘤常见的临床表现，对于及时发现和诊断恶性黑色素瘤是有很大作用的。
细胞凋亡的研究方法实验
细胞凋亡 同学们好，这一讲开始我们来学习细胞凋亡的检测方法。 细胞死亡的方式有很多种，最常见的有坏死（necrosis），它是细胞受到物理或化学损伤的情况下，以及缺氧时会发生的现象，另一种常见的死亡方式是细胞凋亡（apoptosis），又称细胞程序性死亡，它是细胞主动的有序的死亡过程，用来去除多余的，不需要的或异常的细胞，保障生物体内环境的稳定，是一种基本的生物学现象。其他死亡方式还有自噬性细胞死亡（autophagic cell death）和细胞焦亡（Pyroptosis）。随着生命科学的发展，这些死亡方式逐渐进入我们的视野，被关注。 不同的死亡方式有着各自的特征。比如坏死，从形态学上观察，胞体肿胀、胞质空泡化，胞膜破损、最后崩解，所以坏死又称细胞胀亡（Oncosis）。而细胞凋亡，胞体缩小，膜表面出芽状形成凋亡小体，最终从细胞表面脱落，膜基本保持完整、。 细胞凋亡研究有着非常重要的生理和病理意义，2002年诺贝尔生理学或医学奖就授予了细胞程序性死亡方面的研究工作。细胞凋亡参与机体的正常发育与分化、内环境的稳定、免疫系统防御等重要的生理过程，一旦凋亡异常就会导致一些重大疾病的发生与发展，比如肿瘤的发生，肿瘤早期阶段细胞凋亡都是受到抑制的，诱导肿瘤细胞凋亡已成为抗肿瘤药物研发的一个重要方向。 近年来，许多细胞凋亡检测方法得到广泛的应用。下面介绍四种近年来细胞凋亡的主要检测方法： 一、形态学观察 细胞发生凋亡时会出现一系列独特的形态学特征，如细胞体积变小;核固缩，染色质高度凝聚，且堆积在核膜内侧缘或聚集于核中央部;接着凋亡小体的产生，细胞膜皱褶、细胞表面产生了许多泡状或芽状突起，形成单个的凋亡小体。借用光学显微镜、电子显微镜或荧光显微镜可不同程度、不同层次地观测到这些形态学特征。这种细胞凋亡形态学检测的方法简易、直观和有较好定位，但也有不足之处:缺乏特定标准，主观性大，因人而异;又不能定量，有较大的局限性，因而形态学观察多用于固定组织细胞检测，常作为其他技术的辅助。 二、流式细胞术 流式细胞仪(flow cytometry，FCM)是一种对液相中分散着的细胞进行定性、定量分析与分选的设备，具有分析速度快、敏感性好，和精确度高的特点，能够对于不同细胞发生凋亡进度不同的过程，进行准确检测。当待检测的细胞随着液流系统经过探测点，检测到的前向散射光强度代表了细胞的大小，而侧向散射光反应细胞内颗粒的复杂程度。细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞的前向散射光降低，侧向散射光增高;而坏死细胞的前向散射光和侧向散射光同时增高。因此，可区分正常、坏死和凋亡细胞。FCM可以配合荧光染料进行多参数测定，凋亡检测中常用的是AnnexinV-FITC/PI双荧光标记，能够进行早、中期凋亡阶段凋亡率的测定。 三、细胞凋亡的DNA片段检测 DNA断裂是细胞凋亡最显著的生物化学特点，细胞凋亡时，核酸内切酶与相关蛋白水解酶被激活，将DNA降解，形成长度为180～200bp或其整倍数的
细胞凋亡诱导剂
细胞凋亡诱导剂 在凋亡研究中，成功的诱导细胞凋亡是最关键的前提条件。凋亡诱导试剂多种多样，每种诱导剂均有其敏感的细胞，而不同的细胞也有其最佳的诱导剂。因此，选择合适的、有效的、特异性的诱导剂也就成为至关重要的问题。Biovision公司作为世界主要的凋亡试剂供应商，提供各种不同的凋亡诱导剂供研究者选择。 放线菌素D（Actinomycin D） 放线菌素D是一种抗肿瘤的抗生素类药物。通过脱氧鸟苷残基与DNA形成复合物，从而抑制DNA依赖的RNA聚合酶的活性，阻断转录过程。是多种哺乳动物细胞强有力的凋亡诱导剂(1)。Camptothecin 可以结合并稳固拓普异构酶－DNA复合物，从而达到可逆性的抑制拓普异构酶I活性的目的，而诱导细胞凋亡。可抑制Tat介导的HIV-1的转录。常用于诱导Jurkat、骨肉瘤和肝细胞癌细胞的凋亡。Cycloheximide 是一种非常有效的抗多种酵母和真菌的抗生素，可抑制真核生物蛋白
质的合成，而多数原核生物则无效。在100ug/ml的浓度时可抑制多种霉菌，而对大部分的致病细菌则无抑制作用。通过作用于真核细胞60S核糖体而抑制蛋白质合成的起始和延长过程。常被作为抑制剂用于研究真核生物无细胞蛋白质合成，也被用于阻断体外核糖体依赖的多肽合成。可诱导多种细胞的凋亡。 Dexamethasone 是一种具有抗炎症作用的皮质类固醇，同时具有抗炎症和抗风湿的特性。可抑制血管内皮细胞表达诱导型一氧化氮合酶（iNOS），但对cNOS则无效。在主动脉平滑肌细胞通过刺激Na+-K+泵，可加速活化阳离子的转位。一般用于诱导人胸腺细胞凋亡（500-1000nM，37°C 6小时） Etoposide 是拓普异构酶II的抑制剂。是从鬼臼毒素来源的衍生物，主要可以抑制多种肿瘤，包括生殖细胞肿瘤、小细胞肺癌、恶性淋巴瘤。可用于诱导人T细胞、小鼠胸腺细胞、HL-60细胞凋亡。Staurosporine Staurosporine是蛋白激酶C和其他大部分激酶（包括酪氨酸蛋白激