参一胶囊Rg3诱导小鼠黑色素瘤细胞凋亡

文章编号：１００７－４２８７（２０１０）０４－０５２６－０２

参一胶囊（Ｒｇ３）诱导小鼠黑色素瘤细胞凋亡

孙宝胜１，张　矛２，刘林林２，孙　晶３，侯吉光４

（１．吉林省肿瘤医院放疗三科，吉林长春１３００２１；２．吉林大学第二医院肿瘤生物治疗科；

３．吉林大学第二医院药剂科；４畅吉林大学第二医院放疗科）

摘要：目的　探讨参一胶囊（Ｒｇ３）对小鼠黑色素瘤细胞的生长抑制及其诱导凋亡的作用。方法　ＭＴＴ法检测参一胶囊（Ｒｇ３）对黑色素瘤细胞生长的影响；流式细胞仪检测细胞凋亡。结果　参一胶囊（Ｒｇ３）对小鼠黑色素瘤细胞生长有显著的抑制作用，并能显著诱导细胞发生凋亡，其作用呈明显的量效和时间依赖性关系。结论　参一胶囊（Ｒｇ３）诱导小鼠Ｂ１６－４Ａ５黑色素瘤细胞凋亡，抑制细胞增殖。

关键词：参一胶囊；黑色素瘤细胞；细胞凋亡

中图分类号：Ｒ９６５文献标识码：Ａ

ＭｅｌａｎｏｍａｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｄｕｃｅｄｗｉｔｈＲｇ３　ＳＵＮＢａｏ－ｓｈｅｎｇ１，ＺＨＡＮＧＭａｏ２，ＬＩＵＬｉｎ－ｌｉｎ２，ｅｔａｌ．（１．ＪｉｌｉｎＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＴｕｍｏｒＨｏｓ－ｐｉｔａｌ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３００１２，Ｃｈｉｎａ；２．ＴｈｅＳｅｃｏｎｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＪｉｌｉｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆＲｇ３ｏｎｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆｍｅｌａｎｏｍａＢ１６－４Ａ５ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＴｈｅｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｗｅｒｅａｓｓｅｓｓｅｄｗｉｔｈＭＴＴｍｅｔｈｏｄａｎｄｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｒｇ３ｈａｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｏｎＢ１６－４Ａ５ｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈ，ａｎｄｉｎｄｕｃｅｄｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｗｉｔｈａｄｏｓｅ－ａｎｄｔｉｍｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｍａｎｎｅｒ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｒｇ３ｃａｎｉｎｈｉｂｉｔＢ１６－４Ａ５ｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈａｎｄｉｎｄｕｃｅａｐｏｐｔｏｓｉｓ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｒｇ３；ｍｅｌａｎｏｍａｃｅｌｌ；ａｐｏｔｏｓｉｓ

（ＣｈｉｎＪＬａｂＤｉａｇｎ，２０１０，１４：０５２６）

人参皂苷Ｒｇ３是从人参中提取的有效单体成分。研究证明，人参皂苷Ｒｇ３可通过抑制肿瘤血管形成，阻断肿瘤的浸润和转移［１，２］；提高肿瘤病人免疫力，抑制转移，并降低肿瘤病人放、化疗后毒副作用［３］。本文通过观察人参皂苷Ｒｇ３对黑色素瘤细胞的存活率及细胞凋亡的变化，为其临床应用提供重要的实验依据。

１　材料与方法

１．１　试剂

细胞培养液、小牛血清、青霉素、链霉素、谷氨酰胺、胰酶和磷酸盐缓冲液均购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司（Ｐａｉｓｌｅｙ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ，ＵＫ）。Ｔａｕｒｏｌｉｄｉｎｅ（Ｔａｕｒｏｌｉｎ）溶剂由ＧｅｉｓｔｌｉｃｈＰｈａｒｍＡＧ（Ｗｏｌｈｕｓｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）赠送。其他的化学试剂均购于ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ公司（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。

１．２　细胞及培养

小鼠黑色瘤细胞（Ｂ１６－４Ａ５）购于美国细胞库（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）。Ｂ１６－４Ａ细胞均在含有１０％小牛血清、青霉素（１００Ｕ・ｍｌ－１）和谷氨酰胺（２ｍｍｏｌ・Ｌ－１）的ＤＭＥＭ培养液培养，并在３７℃、５％ＣＯ２孵箱中贴壁生长。１×１０５・ｍｌ－１。将Ｂ１６－４Ａ５细胞种植在９６孔培养板（１００μｌ・ｗｅｌｌ－１）２４ｈ后，分别给予不同浓度的ｔａｕｒｏｌｉ－

ｄｉｎｅ，并确定最终浓度分别为０、１０、２５、５０、１００和２００μｍｏｌ・Ｌ－１。５％的ＰＶＰ作为空白对照组。Ｂ１６－４Ａ５细胞在３７℃、ＣＯ２孵箱中培养２４和４８ｈ后，给予１００μｌＭＴＴ（５．０ｇ・Ｌ－１），３７℃继续培养３ｈ，终止培养，吸去上清，每孔加入１５０μＬ二甲基亚砜，振荡１０ｍｉｎ在酶联免疫吸附仪上测量各孔光吸收值（ＣＰＭ）。细胞生长抑制率（％）＝（１－实验组ＣＰＭ值／对照组ＣＰＭ值）×１００％。

１．４　流式细胞术检测细胞凋亡

待Ｂ１６－４Ａ５细胞接近对数生长期，常规消化细胞，制成２．５×１０５・ｍＬ－１细胞悬液，接种于６孔培养板中。２４ｈ后，实验组给予上述不同浓度的ｔａｕｒｏｌｉ－ｄｉｎｅ。５％的ＰＶＰ作为空白对照组。Ｂ１６－４Ａ５细胞在３７℃，ＣＯ２孵箱中培养２４和４８ｈ后，将贴壁及悬浮的细胞离心，收集后震荡、混匀，在碘化丙啶（ＰＩ）混合溶液中（５０ｍｇ・Ｌ－１ＰＩ，３．４ｍｍｏｌ・Ｌ－１ｓｏｄｉｕｍｃｉｔ－ｒａｔｅ，１．０ｍｍｏｌ・Ｌ－１Ｔｒｉｓ，０．１ｍｍｏｌ・Ｌ－１ＥＤＴＡ，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００），并在４℃环境中避光培养４－６ｈ。流式细胞仪（ＢＤｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ，ＣＡ）进行

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—ＣｈｉｎＪＬａｂＤｉａｇｎ，Ａｐｒｉｌ，２０１０，Ｖｏｌ１４，Ｎｏ．４

１．５　统计学处理

数据均用ｘ—±ｓ表示，组间比较采用ｔ检验。２　结果

２．１　人参皂苷Ｒｇ３对Ｂ１６－４Ａ５细胞的生长抑制作用

表１是不同浓度人参皂苷Ｒｇ３分别作用于Ｂ１６－４Ａ５细胞２４和４８ｈ后，对Ｂ１６－４Ａ５细胞增殖能力的影响。从表１可见，人参皂苷Ｒｇ３抑制Ｂ１６－４Ａ５细胞生长是随时间和剂量而改变的，具有明显的时效和量效的关系。

表１　不同剂量Ｒｇ３对Ｂ１６－４Ａ５细胞生长抑制率的影响

２４ｈ

ＣＰＭＩｎｈｉｂｉｔｏｒｙ

ｒａｔｅ（η／％）

４８ｈ

ＣＰＭＩｎｈｉｂｉｔｏｒｙ

ｒａｔｅ（η／％）

Ｃｏｎｔｒｏｌ０．４７±０．０３００．３１±０．０２０ＰＶＰ０．４６±０．０４９９０．３１±０．０１９９Ｒｇ３（μｍｏｌ・Ｌ－１）

２５０．４５±０．０２９６０．３０±０．０１９８５００．４０±０．０２８５倡０．１６±０．０４５２倡１０００．２７±０．０１５７倡０．１６±０．０１３７倡 倡Ｐ＜０．０５ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｃｏｎｔｒｏｌ

表２　不同剂量Ｒｇ３对Ｂ１６－４Ａ５细胞凋亡的影响

２４ｈ

Ａｐｏｐｔｏｔｉｃｃｅｌｌｓ４８ｈ

ＡｐｏｐｔｏｔｉｃｃｅｌｌｓＣｏｎｔｒｏｌ２．２±０．３５２．５±０．２３ＰＶＰ２．１±０．２４２．１±０．０２Ｒｇ３（μｍｏｌ・Ｌ－１）

２５２．８±０．３０３．７±０．６０

５０１１．０±１．１０倡１３．３±１．５０倡

１００１３．２±１．６０倡２０．７±２．２０倡 倡Ｐ＜０．０５ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｃｏｎｔｒｏｌ２．２　人参皂苷Ｒｇ３对Ｂ１６－４Ａ５细胞凋亡的影响表２是不同浓度人参皂苷Ｒｇ３分别作用于Ｂ１６－４Ａ５细胞２４和４８ｈ后凋亡的影响。对照组的Ｂ１６－４Ａ５细胞在培养４８ｈ后，仅仅产生了小于５％的细胞凋亡；然而，细胞经过５０μｍｏｌ・Ｌ－１的人参皂苷Ｒｇ３作用后，能够诱导１５％的细胞凋亡，并显示了明显的时间和剂量依赖效应（表２）。

３　讨论

黑色素瘤作为皮肤癌的一种，其发病率一直在世界范围内居高不下［５，６］。由于恶性黑色素瘤细胞很难被化学药物及辐射诱导凋亡，所以对这些传统的治疗手段具有明显的抗性。

刘基［４］等研究表明，人参皂苷Ｒｇ３对小鼠Ｌｅｗｉｓ肺癌有抑瘤作用，本实验结果与其相符。结果显示，人参皂苷Ｒｇ３具有明显的诱导Ｂ１６－４Ａ５细胞凋亡以及抑制细胞生长的特性，并且显示了明显的时间与量效的依赖关系。

作者简介：孙宝胜（１９７２－），男，博士，主治医师，主要从事恶性肿瘤的凋亡机制方面研究。

参考文献：

［１］赵　翌．２０（Ｒ）－人参Ｒｇ３抗肿瘤作用的研究进展［Ｊ］．临床肿瘤学，２００１，６（１）：８１．

［２］明　月，朱玉琢，拱中华，等．人参二醇组皂甙对视网膜色素上皮细胞增生的抑制作用［Ｊ］．吉林大学学报，２００３，２（２９）：１４９．

［３］胡笑克，吴利华，胡祖光．薏苡仁酯对鼻咽癌细胞的放射增敏作用［Ｊ］．中山医科大学学报，２０００，１２（５）：２３４．

［４］刘　基，孙亮新，赵　翌，等．参一胶囊对乳腺癌化疗患者免疫扶正Ⅱ期临床研究［Ｊ］．中国肿瘤临床，２０００，２７：５３４．

［５］于勇华，陈延条，于金明，等．马蔺子素在食管癌放疗中增敏作用的临床研究［Ｊ］．中华放射医学与防护杂志，１９９９，１９（５）：３１３．［６］曹弃元，李永强，陈成欣，等．复方丹参、地龙、野木瓜对体外培养的人鼻咽癌细胞的放射增敏作用［Ｊ］．癌症，１９９８，１２（２）：１３１．

（收稿日期：２００９－０８－０９）

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中国实验诊断学　２０１０年４月　第１４卷　第４期