CK_MB时间分辨荧光免疫分析的建立
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
【Abstract】A IM : To make a fast quantitative detection of Crea2 tine Kinase2MB Isoenzyme ( CK2MB ) based on time2resolved fluoroimmunoassay ( TRF IA ). M ETHOD S: The sandw ich TRF IA was established for detection of serum CK2MB level using anti2 CK2MB mAbs(One monoclonal antibody was immobilized on sur2 face of m icrotiter p late strip wells, and another was labelled w ith Eu3 + ). RESUL TS: The linear measurement range of CK2MB TRF IA was 5 - 400 μg/L. The sensitivity was 0. 24 μg/L. The intra2 and inter2assay coefficients of variation (CV ) were 4. 9% 7. 3% and 8. 4% - 11. 7% , respectively. There was no cross2 reaction to CK2MM and CK2BB. The correlation coefficient of 82 blood samp les detected by CK2MB TRF IA and commercially avail2 able CL IA kit was 0. 895. CO NCL US IO N: CK2MB TRF IA is a new immunoassay which has several advantages including high sensitivity, specificity and w idely working range. It is suitable for routine clinical detection of serum CK2MB level. 【Keywords】creatine kinase2MB Isoenzyme ( CK2MB ) ; fluoro2
批间精密度
3批
6. 8 ± 0. 80 36. 8 ± 3. 39 119. 7 ±10. 05
CV ( % ) 7. 3 5. 4 4. 9
批内精密度
批号 : 050216
7. 8 ±0. 53 35. 4 ±2. 19 120. 6 ±6. 39
CV ( % ) 6. 8 6. 2 5. 3
批号 : 050407
7. 2 ±0. 51 34. 9 ±1. 99 117. 1 ±6. 44
CV ( % ) 7. 1 5. 7 5. 5
收稿日期 : 2006203213; 接受日期 : 2006206228 基金项目 :广州市重大科技攻关项目 (2003U130021) 通讯作者 :李 明. Tel: ( 020) 61648321 Email: m ingli@ fimmu. com 作者简介 :杭建峰. 住院医师 ,硕士. Tel: ( 020) 61648321 Email: hy2
标记试剂混匀后于 4℃过夜. 1. 2. 3 Eu3 + 标 记物 的纯 化 将标 记抗 体加 入 到 Sephadex G250层析柱 (1 ×30 cm )中 ,用洗脱液洗脱. 收集流出液 ( 1 mL /管 ) ,测定蛋白含量 ,合并洗脱峰 的各管 ,同时以 Eu3 +标记试剂盒中的 Eu3 + 标准测定 洗脱峰各管中 Eu3 + 的浓度 ,计算抗体的 Eu3 + 标记数 和纯化后回收率. 1. 2. 4 参考标准的制备 用含 50 mmol/L pH 7. 4 Tris2HC l缓冲液 , 将 CK2MB 抗 原 配 制 成 0, 5, 20, 100, 200 及 400 μg /L 系列浓度的标准溶液 ,每瓶 1 mL 分装冻干后于 - 20℃保存. 1. 2. 5 分析程序 向包被板中加入 50 μL CK2MB 参考标准或血清样品 ,同时加入 200 μL 反应缓冲液 后于室温孵育 1 h. 用洗涤液洗板 4 次 ,再加入 1 ∶50 稀释的 Eu3 +标记物 200 μL ,于室温孵育 40 m in. 用 洗涤液洗板 6次 ,最后加入 200μL 增强液振摇 5 m in 后由 Auto2Delfia 1235检测荧光值. 1. 2. 6 CK2MB TRF IA 的方法学评价 ①标准曲线 : CK2MB TRF IA 的标准曲线由 Auto Delfia 1235系统自 带的双对数函数处理. ② 灵敏度 : 以零参考标准品 测量 20次 ,计算其均值及标准差. 以其测定值的均 值加上 2倍的标准差所得荧光值 ,代入标准曲线方程 求得. ③精密度 : 三个质控血清 (低中高 ,期望值分 别为 7. 4, 36和 118 μg /L )各设 8个复孔进行测定 , 计算各质控血清检测值的均数 、标准差及变异系数
图 1 CK2MB TRF IA 的标准曲线
2. 3 精密度 批内的 CV < 10% ,批间的 CV < 15% (表 1).
表 1 CK2MB TRF IA 的精密度
指标
质控 低 质控 中 质控 高
批号 : 050123
7. 7 ±0. 56 37. 2 ±2. 01 121. 3 ±5. 94
CK2MB 浓度分布情况. ⑥ 与国内外其他方法比较 : 用 CK2MB TRF IA 和化学发光法同时检测 CK2MB 的 阳性标本 82份和正常标本 230份 ,计算真阳性率 、特 异度 、假阳性率和 Youden指数.
统计学处理 : 数据采用统计软件 SPSS11. 0进行 处理 ,参考值范围采用百分位数法计算.
(1 南方医科大学生物技术学院 ,广州 510515, 2 广州市达瑞抗体工程技术有限公司 ,广州 510663)
T im e2resolved fluoro imm unoa ssay of CK2M B
HAN G J ian2Feng1 , WU Y ing2S ong1 , XU W ei2W en1 , YU W ei2 Hong2 , L I M ing1 1 School of B iotechnology, Southern M edical University, Guang2 zhou 510515 China, 2 Guangzhou Darui Antibody CO. LTD , Guangzhou 510663, China
2 结果
2. 1 标记率和回收率 抗体的 Eu3 + 标记数和回收 率分别为 9. 58个 Eu3 + /抗体和 83%. 2. 2 标准曲线的线性范围和灵敏度 标准曲线的线 性范围为 5～400μg /L (图 1). 以零参考标准测定值 的均值加上 2倍的标准差所得的荧光值扣除本底的 荧光值 ,代入标准曲线方程计算所得灵敏度为 0. 24 μg /L.
1 材料和方法
1. 1 材料 用于包被和 Eu3 + 标记的配对抗 CK2MB 单抗及 CK2MB 抗原均购自 B iodesign公司 ; 96孔板为 厦门新创公司产品 ; Sephadex G250为 Pharmacia公司 产品 ; Eu3 + 标 记 试 剂 盒 、Eu3 + 荧 光 增 强 液 及 A uto2 Delfia 1235全自动时间分辨免疫荧光检测系统均为 Perkin Elmer公司产品 ;带有滤膜的离心管购自 M illi2 pore公司 ; CK2MB 血清标本 82 份 (年龄 45 ～78 岁 , 平均年龄 61岁 ,其中男性 43人 ,女性 39 人 ,包括急 性心肌梗塞患者血清 73 份 ,病毒性心肌炎病人血清 4份 ,心绞痛患者血清 5 份 )及正常人血清 423 份来 自南方医院和广州军区总医院 ;其他试剂均为国产分 析纯. 1. 2 方法 1. 2. 1 固相包被板的制备 用含 50 mmol/L , pH 9. 6的碳酸盐缓冲液 ,将包被抗体稀释至 8 mg /L ,加入 到 96孔板中 ,每孔 200 μL ,于 4℃过夜. 弃去包被 液 ,加入封闭液 (去金属离子的 20 g/L BSA) ,每孔 250 μL,于 37℃ 3 h. 弃去封闭液真空抽干 , - 20℃保存. 1. 2. 2 Eu3 +标记物的制备 将 0. 5 m g标记抗体加 入到带 有滤膜 的离 心管 中 , 以 7 000 r/m in 离 心 3 m in. 用标记缓冲液 ( 50 mmol/L , Na2 CO3 , pH 9. 5 ) 重复洗涤 6次后 ,将 250μL 标记抗体和 0. 5 m g Eu3 +
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
2104
第四军医大学学报 (J Fourth M il M ed Univ) 2006; 27 (22) http: / / journal. fmmu. edu. cn
第四军医大学学报 (J Fourth M il M ed Univ) 2006; 27 (22) http: / / journal. fmmu. edu. cn
2103
·研究原著 ·
CK2M B时间分辨荧光免疫分析的建立
文章编号 : 100022790 (2006) 2222103203
杭建峰 1 ,吴英松 1 ,徐伟文 1 ,余伟鸿 2 ,李 明 1
imm unoa ssay
【摘 要 】目的 : 利用时间分辨荧光免疫分析 ( TRF IA )技术 , 建立人血清 CK2MB的快速定量检测方法. 方法 : 采用双抗体 夹心法 (1株抗 CK2MB的单抗用于包被微孔板 ,另 1株抗 CK2 MB 的单抗用于铕标记 )建立 CK2MB TRF IA. 结果 : CK2MB TRF IA 的线性测量范围为 5 ～400 μg/L , 分析的 灵 敏 度 为 0. 24μg /L ,批内和批间的变异系数分别为 4. 9% ～7. 3%和 8. 4% ～11. 7%. 与 CK2MM 和 CK2BB 均无交叉反应. 将 82 份血清标本用本法与化学发光试剂盒同时检测 ,其相关系数 为 0. 895. 结论 : CK2MB TRF IA 的各项指标均达到临床检测
(CV , CV =标准差 /均数 ) ,按照 2000 版生物制品检 定规程 ,批内 CV 应 < 10% ,批间 CV 应 < 20%. ④特 异性 :将一定量的 CK2MM 和 CK2BB 稀释后进行测 定 ,观察与 CK2MB 的交叉反应. ⑤参考值范围 : CK2 MB TRF IA 检测 423份正常人血清 ,统计检测所得的
hy160@163. com
的要求 ,可用于临床血清 CK2MB水平的测定. 【Hale Waihona Puke Baidu键词 】肌酸激酶同工酶 2MB (CK2MB ) ;荧光免疫测定 【中图号 】R392. 33 【文献标识码 】B
0 引言
血清肌酸激酶同工酶 2MB ( CK2MB ) 在心肌不可 逆损伤后 4～6 h即开始升高 ,是反映心肌损伤灵敏 度高特异性强的一项指标 [ 1 ] ,近年来随着免疫学检 测技术的发展 , CK2MB 的检测技术趋于多样化 ,检测 时间也不断缩短. 但对一些亚急性心肌梗塞及小灶 性心肌梗塞的患者 ,用传统的免疫抑制法测定 CK2 MB活性仍有一定的局限性. 本研究使用三价稀土离 子作为标记物的时间分辨荧光免疫分析技术 [ 2 ]测定 血清 CK2MB ,并对相关指标进行了评价.
批间精密度
3批
6. 8 ± 0. 80 36. 8 ± 3. 39 119. 7 ±10. 05
CV ( % ) 7. 3 5. 4 4. 9
批内精密度
批号 : 050216
7. 8 ±0. 53 35. 4 ±2. 19 120. 6 ±6. 39
CV ( % ) 6. 8 6. 2 5. 3
批号 : 050407
7. 2 ±0. 51 34. 9 ±1. 99 117. 1 ±6. 44
CV ( % ) 7. 1 5. 7 5. 5
收稿日期 : 2006203213; 接受日期 : 2006206228 基金项目 :广州市重大科技攻关项目 (2003U130021) 通讯作者 :李 明. Tel: ( 020) 61648321 Email: m ingli@ fimmu. com 作者简介 :杭建峰. 住院医师 ,硕士. Tel: ( 020) 61648321 Email: hy2
标记试剂混匀后于 4℃过夜. 1. 2. 3 Eu3 + 标 记物 的纯 化 将标 记抗 体加 入 到 Sephadex G250层析柱 (1 ×30 cm )中 ,用洗脱液洗脱. 收集流出液 ( 1 mL /管 ) ,测定蛋白含量 ,合并洗脱峰 的各管 ,同时以 Eu3 +标记试剂盒中的 Eu3 + 标准测定 洗脱峰各管中 Eu3 + 的浓度 ,计算抗体的 Eu3 + 标记数 和纯化后回收率. 1. 2. 4 参考标准的制备 用含 50 mmol/L pH 7. 4 Tris2HC l缓冲液 , 将 CK2MB 抗 原 配 制 成 0, 5, 20, 100, 200 及 400 μg /L 系列浓度的标准溶液 ,每瓶 1 mL 分装冻干后于 - 20℃保存. 1. 2. 5 分析程序 向包被板中加入 50 μL CK2MB 参考标准或血清样品 ,同时加入 200 μL 反应缓冲液 后于室温孵育 1 h. 用洗涤液洗板 4 次 ,再加入 1 ∶50 稀释的 Eu3 +标记物 200 μL ,于室温孵育 40 m in. 用 洗涤液洗板 6次 ,最后加入 200μL 增强液振摇 5 m in 后由 Auto2Delfia 1235检测荧光值. 1. 2. 6 CK2MB TRF IA 的方法学评价 ①标准曲线 : CK2MB TRF IA 的标准曲线由 Auto Delfia 1235系统自 带的双对数函数处理. ② 灵敏度 : 以零参考标准品 测量 20次 ,计算其均值及标准差. 以其测定值的均 值加上 2倍的标准差所得荧光值 ,代入标准曲线方程 求得. ③精密度 : 三个质控血清 (低中高 ,期望值分 别为 7. 4, 36和 118 μg /L )各设 8个复孔进行测定 , 计算各质控血清检测值的均数 、标准差及变异系数
图 1 CK2MB TRF IA 的标准曲线
2. 3 精密度 批内的 CV < 10% ,批间的 CV < 15% (表 1).
表 1 CK2MB TRF IA 的精密度
指标
质控 低 质控 中 质控 高
批号 : 050123
7. 7 ±0. 56 37. 2 ±2. 01 121. 3 ±5. 94
CK2MB 浓度分布情况. ⑥ 与国内外其他方法比较 : 用 CK2MB TRF IA 和化学发光法同时检测 CK2MB 的 阳性标本 82份和正常标本 230份 ,计算真阳性率 、特 异度 、假阳性率和 Youden指数.
统计学处理 : 数据采用统计软件 SPSS11. 0进行 处理 ,参考值范围采用百分位数法计算.
(1 南方医科大学生物技术学院 ,广州 510515, 2 广州市达瑞抗体工程技术有限公司 ,广州 510663)
T im e2resolved fluoro imm unoa ssay of CK2M B
HAN G J ian2Feng1 , WU Y ing2S ong1 , XU W ei2W en1 , YU W ei2 Hong2 , L I M ing1 1 School of B iotechnology, Southern M edical University, Guang2 zhou 510515 China, 2 Guangzhou Darui Antibody CO. LTD , Guangzhou 510663, China
2 结果
2. 1 标记率和回收率 抗体的 Eu3 + 标记数和回收 率分别为 9. 58个 Eu3 + /抗体和 83%. 2. 2 标准曲线的线性范围和灵敏度 标准曲线的线 性范围为 5～400μg /L (图 1). 以零参考标准测定值 的均值加上 2倍的标准差所得的荧光值扣除本底的 荧光值 ,代入标准曲线方程计算所得灵敏度为 0. 24 μg /L.
1 材料和方法
1. 1 材料 用于包被和 Eu3 + 标记的配对抗 CK2MB 单抗及 CK2MB 抗原均购自 B iodesign公司 ; 96孔板为 厦门新创公司产品 ; Sephadex G250为 Pharmacia公司 产品 ; Eu3 + 标 记 试 剂 盒 、Eu3 + 荧 光 增 强 液 及 A uto2 Delfia 1235全自动时间分辨免疫荧光检测系统均为 Perkin Elmer公司产品 ;带有滤膜的离心管购自 M illi2 pore公司 ; CK2MB 血清标本 82 份 (年龄 45 ～78 岁 , 平均年龄 61岁 ,其中男性 43人 ,女性 39 人 ,包括急 性心肌梗塞患者血清 73 份 ,病毒性心肌炎病人血清 4份 ,心绞痛患者血清 5 份 )及正常人血清 423 份来 自南方医院和广州军区总医院 ;其他试剂均为国产分 析纯. 1. 2 方法 1. 2. 1 固相包被板的制备 用含 50 mmol/L , pH 9. 6的碳酸盐缓冲液 ,将包被抗体稀释至 8 mg /L ,加入 到 96孔板中 ,每孔 200 μL ,于 4℃过夜. 弃去包被 液 ,加入封闭液 (去金属离子的 20 g/L BSA) ,每孔 250 μL,于 37℃ 3 h. 弃去封闭液真空抽干 , - 20℃保存. 1. 2. 2 Eu3 +标记物的制备 将 0. 5 m g标记抗体加 入到带 有滤膜 的离 心管 中 , 以 7 000 r/m in 离 心 3 m in. 用标记缓冲液 ( 50 mmol/L , Na2 CO3 , pH 9. 5 ) 重复洗涤 6次后 ,将 250μL 标记抗体和 0. 5 m g Eu3 +
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
2104
第四军医大学学报 (J Fourth M il M ed Univ) 2006; 27 (22) http: / / journal. fmmu. edu. cn
第四军医大学学报 (J Fourth M il M ed Univ) 2006; 27 (22) http: / / journal. fmmu. edu. cn
2103
·研究原著 ·
CK2M B时间分辨荧光免疫分析的建立
文章编号 : 100022790 (2006) 2222103203
杭建峰 1 ,吴英松 1 ,徐伟文 1 ,余伟鸿 2 ,李 明 1
imm unoa ssay
【摘 要 】目的 : 利用时间分辨荧光免疫分析 ( TRF IA )技术 , 建立人血清 CK2MB的快速定量检测方法. 方法 : 采用双抗体 夹心法 (1株抗 CK2MB的单抗用于包被微孔板 ,另 1株抗 CK2 MB 的单抗用于铕标记 )建立 CK2MB TRF IA. 结果 : CK2MB TRF IA 的线性测量范围为 5 ～400 μg/L , 分析的 灵 敏 度 为 0. 24μg /L ,批内和批间的变异系数分别为 4. 9% ～7. 3%和 8. 4% ～11. 7%. 与 CK2MM 和 CK2BB 均无交叉反应. 将 82 份血清标本用本法与化学发光试剂盒同时检测 ,其相关系数 为 0. 895. 结论 : CK2MB TRF IA 的各项指标均达到临床检测
(CV , CV =标准差 /均数 ) ,按照 2000 版生物制品检 定规程 ,批内 CV 应 < 10% ,批间 CV 应 < 20%. ④特 异性 :将一定量的 CK2MM 和 CK2BB 稀释后进行测 定 ,观察与 CK2MB 的交叉反应. ⑤参考值范围 : CK2 MB TRF IA 检测 423份正常人血清 ,统计检测所得的
hy160@163. com
的要求 ,可用于临床血清 CK2MB水平的测定. 【Hale Waihona Puke Baidu键词 】肌酸激酶同工酶 2MB (CK2MB ) ;荧光免疫测定 【中图号 】R392. 33 【文献标识码 】B
0 引言
血清肌酸激酶同工酶 2MB ( CK2MB ) 在心肌不可 逆损伤后 4～6 h即开始升高 ,是反映心肌损伤灵敏 度高特异性强的一项指标 [ 1 ] ,近年来随着免疫学检 测技术的发展 , CK2MB 的检测技术趋于多样化 ,检测 时间也不断缩短. 但对一些亚急性心肌梗塞及小灶 性心肌梗塞的患者 ,用传统的免疫抑制法测定 CK2 MB活性仍有一定的局限性. 本研究使用三价稀土离 子作为标记物的时间分辨荧光免疫分析技术 [ 2 ]测定 血清 CK2MB ,并对相关指标进行了评价.