9胚胎工程技术1_(NXPowerLite)

配种后3天的供卵巢
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供体羊胚胎收集
收集到的冲洗液静臵，冲洗液分离。
拣胚：将胚胎移至培养液或保存液中。
胚胎鉴定：根据透明带、胚胎细胞、发育 阶段及细胞在透明带中的比例确定胚胎级 别。
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4.胚胎的检查
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4.胚胎的检查
收集到的冲冼液，需静臵10min，使胚胎下沉到容器底 部，然后移去上清液，再放于解剖镜下检查胚胎的数量 和发育情况，再将发育正常的胚胎收集到注射器或移植 管内供移植用。
胚胎和配子生物工程(1) (Embryonic and gametal bioengineering)
陈从英
2009.10.16
一、胚胎移植的含义
胚胎移植技术— ET（embryo transfer） 胚胎移植：将一头良种母畜（供体）配种后的早期胚胎 取出，移植到另一头同种（受体）的生理状态相同的 母畜体内，使胚胎继续发育成为新个体，俗称借腹怀 胎。
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5.胚胎的保存
胚胎冷冻的难点： 冷冻液的毒副损伤 降温过程的冷冻损伤 三步平衡冷冻法 胚胎分别用含3%、6%、10%甘油且含10%牛血清 的PBS液的保存液浸渍5分钟后，用含10%甘油的PBS 装管冷冻。 一步法冷冻 胚胎用含10%血清的乙二醇溶液平衡后直接冷冻
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6、胚胎冷冻
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2、胚胎移植的意义
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相同生理环境条件下空间位臵
的转换，而胚胎本身的遗传物
质并不发生改变，因此各种性
状均能保持其原来的优良特性。
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胚胎移植的实质
胚胎移植实质上是早期胚胎在
为什么胚胎移植能成功?
移动到任何一头动物子宫内都能发育吗?

为什么能收集到胚胎?

供体和受体会不会发生排斥/
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步骤
↓ ↓ ↓
(5)对胚胎质量检查(此时的胚胎处于桑椹期或囊胚期)
(6)胚胎移植或保存(保存条件：-196℃的液氮)
(7)胚胎移植操作方法(手术法和非手术法) ↓ (8)对受体母牛进行是否妊娠的检查
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↓
(9)体内孕育，产下胚胎移植的犊牛
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四、牛胚胎移植的技术路线
１、供体牛和受体牛的选择 供体应具有相当高的育种价值(供体牛选择遗传性能和生 产性能优良个体，而受体选择则重在健康的体质和正常 的繁殖能力，供体牛一般为引进的优良个体，受体为本 地牛；） 供体生殖机能应处于较高的状态：产后60天以上，无生 殖系统疾病，体质强健 受体应容易购买，繁殖性能好，对地方适应性强，体型 中上等，非优良品种 受体健康状况良好，已进入发情季节 供受体发情时间应接近或一致。
③冲胚所用的液体为PBS液，其主要成分有： Nacl、Kcl、KH2PO4、Mgcl2.6H2O、Na2HPO4、丙酮
酸钠、葡萄糖、牛血清白蛋白、青霉素、链霉素
④无菌操作的重要性
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3、胚胎回收（冲胚）
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移胚
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胚胎的检查项目：
1.受精卵整体的形态和体积大小； 2.透明带形状，厚度及损伤程度； 3.发育正常胚胎的卵裂球应该具有整齐的外形，大小一 致，分布均匀而紧密，发育速度与胚龄一致； 4.卵细胞表面颗粒的状态和多少等。
牛胚胎大小直径约为0.15-0.16mm（第七天）
一般分为A、B、C三个等级 A级：胚胎形态完整，轮廓清晰，分裂球大小均匀，结 构紧凑，无附着的细胞和液泡或很少； B级：轮廓清晰，色调及细胞密度好，可见到一些附着 的细胞和液泡；
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7、胚胎移植
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胚胎装管
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7、胚胎移植
牛胚胎的移植采用非手术法，用 移植枪将胚胎移入子宫角的前端。
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8.胚胎移植后观察及处理
供体和受体的抗炎处理 健康状况检查 返情状况检查 妊娠检查及妊娠确定
PMSG+ PGF2а法： 在母牛发情期第8—12天，肌注PMSG 2000单位，48小 时后，肌注15-甲基前列腺素 4mg。 பைடு நூலகம்情后12小时进行第一次输精； 第一次输精后8小时进行第二次输精。 现在使用的超数排卵的方法一般为ＦＳＨ＋ＰＧ法； 具体操作方法为：在供体牛发情后的９－１２天，经检 查黄体较好的牛，采用四天减量注射ＦＳＨ的方法； 羊：发情周期的第12-15天，促性腺激素处理的第二天或 第三天，注射PG
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牛的异常胚胎示意图
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1～2级牛胚胎
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6天收集的胚胎（未拣）
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二细胞至四细胞胚胎
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胚胎的降温：使胚胎停止发育，延长其体 外生存时间 体外培养：将胚胎臵于体温条件下，在培 养液中，使其继续发育 胚胎冷冻：通过一定的处理程序，将胚胎 降温冷冻后，保存于液氮中
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２、超数排卵和人工授精
③为什么在９－１２天开始？ ④为什么要使用ＰＧ？
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ＦＳＨ剂 量
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ＰＧ 剂量
牛超数排卵时间表
时间 第一天 第二天 第三天 第四天 第五天 第六天
早上
２.０
１.５
１.０
０.５
发情
人工授精
下午
２.０
１.５
１.０
０.５
发情
人工授精
四支
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供体超排处理
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供体母畜的配种
必须用优秀的种公畜进行多次配种，一般隔812小时进行一次配种，直到发情结束。 配种前应对种公畜的精液进行质量检查。
可优秀种公畜不足时，可考虑首次采用本交， 以后采用人工授精，也可以全部采用人工授精。
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供体配种
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4.胚胎的收集
胚胎冲洗液的配制：杜氏磷酸缓冲液PBS，布
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牛胚胎冷冻程序示意图
自然发情（妊娠率更高）
一次同期法（PG）（妊娠率较低）
两次同期法（PG）（妊娠率更高）
11天内注射两次PG
发情观察极为重要
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7、受体的同期发情处理
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7.胚胎移植
手术法移植
非手术法移植
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受体移胚
受体牛发情后的第七天经检查黄体合格后移植 对黄体的要求？ 移植步骤主要有：直肠检查、解冻胚胎检查、 胚胎装管、麻醉、移植
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9.1 概述
提供胚胎的个体为 “供体”，接受胚 胎的个体为“受 体”，不管供体还 是受体动物都应为 雌性个体。
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.
①、大大提高优良母畜的使用效率； ②、缩短世代间隔，大大提高品种改良的速度； ③、通过冷冻胚胎进口，可实现更有利的种畜遗传物质 的跨国界交换； ④、有利于防疫工作； ⑤、可以克服不孕； ⑥、利用胚胎冷冻保存品种资源。 ⑦、是发展家畜生物技术重要的研究手段。

为什么移植的胚胎能保留供体双亲的特性?

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同种动物发情排卵后,在一段时间内供体\受体具 有相同的生理环境
早期胚胎一定时间内处于游离状态
同种动物之间基本上不排斥
生 理 学 基 础
胚胎虽然与受体有生理和组织上的联系,但遗传特 性不受受体的影响
.
①、1890首次实现了兔的胚胎移植； ②、1934年成功地进行羊的胚胎移植； ③、50年代初羊、猪、牛的胚胎移植取得成功； ④、1964年在日本完成了世界上首次非手术牛胚胎移植并 得到犊牛； ⑤、国外，1976年牛的非手术胚胎移植技术推广，1977年 开始商业化应用； ⑥、在国内，牛胚胎移植在1978年实验成功，80年代后期 到90年代初，奶牛胚胎移植开始在国内生产中应用。
1、乳汁孕酮测定法
2、B超诊断法 3、直肠检查法 孕角及子宫体明显增大，孕角较空角粗约一倍；角 间沟已不清楚；子宫角的一部分进入腹腔；孕角壁软、 薄，内有液体波动；子宫体触诊一般不收缩。
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9、妊娠诊断
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胚胎移植产出的犊牛
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一次移入三枚胚全部成活
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受体母羊与所生羔羊
林斯特液SOF合成输卵管液
手术法收集胚胎 输卵管冲胚：顺向冲胚、逆向冲胚 子宫角冲胚 非手术法收集胚胎 二路法 三路法
①牛胚胎回收（冲胚）：在牛发情后（发情之日计为第
0天）的第七天采用非手术法回收胚胎。
②一般供体牛每两个月超排一次，平均每次超排能获得
可用胚胎6-7枚。在新疆的最高记录是一头牛一次超排获 得48枚可用胚胎。
C级：轮廓不清晰，色调发暗，结构较松散，游离的细 胞和液泡较多。
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4、胚胎质量鉴定
时 期 早期桑椹胚（EM） 桑椹胚（M） 致密桑椹胚（CM） 早期囊胚（EBL） 囊胚（BL） 扩张囊胚（EXBL） 孵化囊胚（HBL）
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目前，胚胎的发育阶段采用以下系统来划分
天 数 发情后 5-6 天采集的胚胎 6 天胚胎 6-7 天胚胎 7 天胚胎 7-8 天胚胎 8-9 天胚胎 9 天胚胎
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3、家畜胚胎移植的发展历史
• 对供体\受体的选择和处 • • • •
理 配种或人工授精 对胚胎的收集\检查\培养 \保存 移植胚胎 移植后检查
.激素 经受体产生更多后代
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流程图
示意图.
(1)对供、受体的选择，用促性腺激素进行同期发情处理 ↓ (2)用激素对供体母牛做超数排卵处理(对供体注射促性腺激素， 促进排卵) ↓ (3)选择同种优秀的公牛进行配种或人工授精(多个卵子与多个 精了结合形成多个受精卵，受精的部位在输卵管)；受精卵→卵裂 →早期胚胎 ↓ (4)胚胎收集(特制的冲卵装置从母体子宫中冲出胚胎)
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The end！