2018 免疫组库测序
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IR-SEQ
目录
一． 免疫组库（IR） 二． 免疫组库测序技术 三． 信息分析
1、免疫组库概念
免疫组库（Immune Repertoire，IR）是指 在任何指定时间，某个个体的循环系统中 所有功能多样性B细胞和T细胞的总和。研 究免疫组库就要测定免疫系统中的BCR和 TCR的基因或RNA分子序列。
4、BCR/TCR多样性产生机制
1. 不同VDJ基因片段组合的多样化； 2. 不同基因片段连接时随机插入删除造成连
接的多样化，V(D)J连接区核苷酸的插入和 删除，体现为互补决定区簇CDR3)序列多 样性； 3. 不同重链和轻链组合的多样化； 4. 以及 B 细胞受体特有的随机高频突变。
5、研究免疫组库的流程
1. 提取样本DNA/RNA:根据所要研究的问题设计试验方案， 提取血液或组织样本，分离B细胞或T细胞，然后提取 和纯化DNA/RNA。
2. 构建测序文库:根据不同实验情况加入不同扩增引物进 行PCR扩增，从而扩增出想要测序的免疫基因，最后 构建测序文库。
3. 测序:利用二代高通量测序仪，如Roche 454、Illumina Hi Seq2500、Illumina Mi Seq等进行测序。
决定B淋巴细胞识别抗原的关键部位是最具 多样性的重链CDR3区，其多样性的产生源 于IGHV（51个功能性基因片段）末端IGHD(23个功能性基因片段）-IGHJ前端（6 个功能性基因片段）基因重排及V-D和D-J连 接时非模板依赖性核苷酸插入或剪切和体 细胞高频突变等。
ຫໍສະໝຸດ Baidu
3、TCR
T细胞受（TCR）是由T细胞分泌的膜蛋白分子，与BCR 不同的是TCR只在细胞表面而不分泌出去。一个T细胞的 TCR可以是α链和β链组成的，或者由γ链和δ链组成的。α 链和γ链由V-J-C基因片段重组而来，β链和δ链由V-D-J-C 基因片段重组而来，这也类似于BCR的重链和轻链。参 与特异性免疫应答的T淋巴细胞主要是α/β T淋巴细胞，占 外周Ｔ淋巴细胞的90-95%。TCR β 链CDR3在抗原特异性 识别中起关键作用，是直接与抗原肽的结合位点，其编 码基因位于人类7号染色体（7q34），全长620kb，由50 多个可变区（V区）基因片段、2组上游D基因片段/下游 恒定区（C区） 基因片段、6~7个J区基因片段组成，这些 基因在T淋巴细胞发育早期不连续分布，在胸腺内原始T 细胞阶段，D-J区片段连接为 DJ片段；在成熟T淋巴细胞 阶段，V、D、J、C区基因片段相连成 VDJC片段。
2、两种PCR技术的优缺点
Arm-PCR是最新开创的一种高效扩增子救援多重 PCR，它克服了传统多重PCR的缺限。通过在扩 增的早期使用基因靶点特异性的引物，而在指数 扩增期使用共用的引物，使得所有模板的扩增效 率大大提高，因而具有较高的特异性和灵敏性。
3、模板比较
基因组虽然DNA容易制备，但PCR扩增过程 中易产生非产出性的重组序列，且J-C区之 间存在的大量内含子使其下游引物只能位 于J区，PCR扩增的敏感性一般由细胞的拷 贝量决定；相对而言，RNA需取自新鲜的标 本，其产物多为产出性的CDR3序列，下游 引物可选自C区，具有高度的敏感性。
高效靶向覆盖-运用多重PCR设计实现平均 97%靶向覆盖
读长-可选择200bp或400bp读长
5、信息分析
1、基本数据统计 数据过滤，对原始数据进行去除接头污染序列及低质量 reads的处理 数据搭建，数据拼接，消除测序背景及有效数据构建 数据统计，数据产出统计及测序数据的成分和质量评估
2、数据比对分析 比对分析，与数据库（IMGT）V/D/J基因片段比对 重新比对，寻找最佳V/D/J比对结果
6、IR-SEQ存在的问题
1、构建免疫组库的过程实际上是基于多重引 物PCR来覆盖BCR或TCR序列多样性的过程， 这就会涉及多重引物之间扩增效率导致的 偏好性的问题，一套好的多重引物总会平 衡各对引物之间的扩增效率以及尽量避免 引物间的非特异性扩增和二（多）聚体， 可以说构建的免疫组库质量的好坏直接取 决于其多重引物质量的高低。
4、主流测序技术及优缺点
免疫组库分析的精确性依赖于HTS数据的 可靠性。而HTS数据的可靠性又依赖于测序 的准确性和覆盖的深度。
Thermo测序平台
Ion Torrent:革新性的半导体芯片测序技术 平台
原理是：向 DNA 聚合物中加入 dNTP，会 释放出氢离子。我们采用半导体测定这些 氢离子引起的 pH 变化，通过同时测量数百 万起此类变化，可以测定各个片段的序列。
3、免疫组库的多重引物并不通用，每个物 种甚至每个种系的引物都可能不尽相同。 这意味着每研究一种新的物种的免疫组库， 我们都要重新设计合成该物种的多重引物 以及PCR条件等。另一反面，有的物种胚系 基因序列不全甚至没有，这也给多重引物 的设计带来一定的麻烦。
影响免疫组库组成的因素有很多种。比如 年龄、疾病、免疫记忆、免疫缺陷遗传疾 病、疫苗、器官移植、癌症治疗等。
根据淋巴细胞DNA来源的不同，对于免疫组库 的研究分为以下几大类：健康人士一般采用抽 取外周血的方式；特殊人群比如白血病人或者 白血病细胞微小残留病（MRD）患者，为了深 入研究其免疫组库的变化也将骨髓血作为淋巴 细胞DNA的来源；刚出生的婴儿，其脐带血可 以用于研究人在出生早期与母亲在免疫组库方 面的联系与区别；而对于动物来说尤其是小型 动物，脾脏也是常见淋巴细胞的DNA来源脏器。
以唾液和尿液作为淋巴细胞DNA来源的方式。
2、BCR
B细胞受体（BCR）又称为免疫球蛋白（IG）， 它是由B细胞分泌的可以和抗原结合的蛋白质 分子。成熟的B细胞可以将IG分泌到细胞外面 以中和抗原。免疫球蛋白由两条重链（heavy chain, H），两条轻链（light chain, L）中间通 过二硫键连接而成。重链（IGH）由 Variable （V），Diversity（D），Joining（J）和 Constant（C）基因片段重组而来；轻链（IGL） 只由V-J-C重组而来。重链（H链）又分为V区、 C区、跨膜区及胞质区；而轻链（L链）则只有 V区和C区。V区由VH和VL两个结构域组成，各 有3个CDR即CDR1、CDR2和CDR3。
4. 信息分析:对测出来的序列数据进行信息挖掘，来发掘 出生物学意义与结果。数据分析主要包括数据清理、 质量控制、不同样本数据分离、序列比对、序列注释 以及下游的各种分析。
二、免疫组库测序
1、免疫组库测序概念
免疫组库测序（Immune Repertoire sequencing(IR-SEQ)）是以 T/B 淋巴细胞为 研究目标，用多重PCR技术或5’RACE扩增决 定B细胞受体（BCR）或T细胞受体（TCR） 多样性的互补决定区（CDR3区），再结合 高通量测序技术（HTS），全面评估免疫系 统的多样性，深入挖掘免疫组库与疾病的 关系。
2、以人体内BCR为例，保守估计BCR的种类多 样性在1011这一数量级级别上，其中骨髓方面 占17%，全身淋巴结占到28%，脾脏和粘膜系 统占23%，外周血方面仅占2%，其他约占 30%。然而我们对人免疫组库的研究往往是以 来源方便的外周血，显然外周血对免疫组库多 样性的贡献率2%远远不足，为了能尽量完全 地反映人群的免疫组库全貌，我们可以通过增 加样本量的方式来弥补单个人外周血免疫组库 不能反映免疫组库全貌的不足，但是巨大的样 本量又让人望而却步。
据推测，胚系VDJC基因片段随机组合、重排以及 TCR α/β链和γ/δ 链V区基因重排产生的TCR克隆数 量高达1015-1018，构成多样性极其丰富的T淋巴细 胞抗原受体库。不同T淋巴细胞克隆有不同序列或 长度的TCR-CDR3基因，翻译出不同的CDR3多肽序 列，从而反映T淋巴细胞功能状态。在发生特异性 免疫应答时，TCR多样性发生变化，出现寡克隆甚 至单克隆扩增，随着胸腺再生，大量原始T淋巴细 胞增殖，TCR免疫组库多样性得以恢复和重建。
3、序列结构分析 分析CDR序列组成及序列碱基成分 分析CDR序列的碱基插入和缺失 编码CDR序列翻译成氨基酸和肽链
4、免疫组库构建 构建免疫组库表达谱，统计多样性抗体库克隆表达情况 免疫组库多样性呈现，绘制V/J基因表达的2D、3D图
5、免疫组库差异分析 样品间多样性差异分析（辛普森系数、香农威纳系数） 样品间克隆表达差异分析（CDR3，V-D-J） 分组样品间的克隆表达差异分析（CDR3，V-D-J）
目录
一． 免疫组库（IR） 二． 免疫组库测序技术 三． 信息分析
1、免疫组库概念
免疫组库（Immune Repertoire，IR）是指 在任何指定时间，某个个体的循环系统中 所有功能多样性B细胞和T细胞的总和。研 究免疫组库就要测定免疫系统中的BCR和 TCR的基因或RNA分子序列。
4、BCR/TCR多样性产生机制
1. 不同VDJ基因片段组合的多样化； 2. 不同基因片段连接时随机插入删除造成连
接的多样化，V(D)J连接区核苷酸的插入和 删除，体现为互补决定区簇CDR3)序列多 样性； 3. 不同重链和轻链组合的多样化； 4. 以及 B 细胞受体特有的随机高频突变。
5、研究免疫组库的流程
1. 提取样本DNA/RNA:根据所要研究的问题设计试验方案， 提取血液或组织样本，分离B细胞或T细胞，然后提取 和纯化DNA/RNA。
2. 构建测序文库:根据不同实验情况加入不同扩增引物进 行PCR扩增，从而扩增出想要测序的免疫基因，最后 构建测序文库。
3. 测序:利用二代高通量测序仪，如Roche 454、Illumina Hi Seq2500、Illumina Mi Seq等进行测序。
决定B淋巴细胞识别抗原的关键部位是最具 多样性的重链CDR3区，其多样性的产生源 于IGHV（51个功能性基因片段）末端IGHD(23个功能性基因片段）-IGHJ前端（6 个功能性基因片段）基因重排及V-D和D-J连 接时非模板依赖性核苷酸插入或剪切和体 细胞高频突变等。
ຫໍສະໝຸດ Baidu
3、TCR
T细胞受（TCR）是由T细胞分泌的膜蛋白分子，与BCR 不同的是TCR只在细胞表面而不分泌出去。一个T细胞的 TCR可以是α链和β链组成的，或者由γ链和δ链组成的。α 链和γ链由V-J-C基因片段重组而来，β链和δ链由V-D-J-C 基因片段重组而来，这也类似于BCR的重链和轻链。参 与特异性免疫应答的T淋巴细胞主要是α/β T淋巴细胞，占 外周Ｔ淋巴细胞的90-95%。TCR β 链CDR3在抗原特异性 识别中起关键作用，是直接与抗原肽的结合位点，其编 码基因位于人类7号染色体（7q34），全长620kb，由50 多个可变区（V区）基因片段、2组上游D基因片段/下游 恒定区（C区） 基因片段、6~7个J区基因片段组成，这些 基因在T淋巴细胞发育早期不连续分布，在胸腺内原始T 细胞阶段，D-J区片段连接为 DJ片段；在成熟T淋巴细胞 阶段，V、D、J、C区基因片段相连成 VDJC片段。
2、两种PCR技术的优缺点
Arm-PCR是最新开创的一种高效扩增子救援多重 PCR，它克服了传统多重PCR的缺限。通过在扩 增的早期使用基因靶点特异性的引物，而在指数 扩增期使用共用的引物，使得所有模板的扩增效 率大大提高，因而具有较高的特异性和灵敏性。
3、模板比较
基因组虽然DNA容易制备，但PCR扩增过程 中易产生非产出性的重组序列，且J-C区之 间存在的大量内含子使其下游引物只能位 于J区，PCR扩增的敏感性一般由细胞的拷 贝量决定；相对而言，RNA需取自新鲜的标 本，其产物多为产出性的CDR3序列，下游 引物可选自C区，具有高度的敏感性。
高效靶向覆盖-运用多重PCR设计实现平均 97%靶向覆盖
读长-可选择200bp或400bp读长
5、信息分析
1、基本数据统计 数据过滤，对原始数据进行去除接头污染序列及低质量 reads的处理 数据搭建，数据拼接，消除测序背景及有效数据构建 数据统计，数据产出统计及测序数据的成分和质量评估
2、数据比对分析 比对分析，与数据库（IMGT）V/D/J基因片段比对 重新比对，寻找最佳V/D/J比对结果
6、IR-SEQ存在的问题
1、构建免疫组库的过程实际上是基于多重引 物PCR来覆盖BCR或TCR序列多样性的过程， 这就会涉及多重引物之间扩增效率导致的 偏好性的问题，一套好的多重引物总会平 衡各对引物之间的扩增效率以及尽量避免 引物间的非特异性扩增和二（多）聚体， 可以说构建的免疫组库质量的好坏直接取 决于其多重引物质量的高低。
4、主流测序技术及优缺点
免疫组库分析的精确性依赖于HTS数据的 可靠性。而HTS数据的可靠性又依赖于测序 的准确性和覆盖的深度。
Thermo测序平台
Ion Torrent:革新性的半导体芯片测序技术 平台
原理是：向 DNA 聚合物中加入 dNTP，会 释放出氢离子。我们采用半导体测定这些 氢离子引起的 pH 变化，通过同时测量数百 万起此类变化，可以测定各个片段的序列。
3、免疫组库的多重引物并不通用，每个物 种甚至每个种系的引物都可能不尽相同。 这意味着每研究一种新的物种的免疫组库， 我们都要重新设计合成该物种的多重引物 以及PCR条件等。另一反面，有的物种胚系 基因序列不全甚至没有，这也给多重引物 的设计带来一定的麻烦。
影响免疫组库组成的因素有很多种。比如 年龄、疾病、免疫记忆、免疫缺陷遗传疾 病、疫苗、器官移植、癌症治疗等。
根据淋巴细胞DNA来源的不同，对于免疫组库 的研究分为以下几大类：健康人士一般采用抽 取外周血的方式；特殊人群比如白血病人或者 白血病细胞微小残留病（MRD）患者，为了深 入研究其免疫组库的变化也将骨髓血作为淋巴 细胞DNA的来源；刚出生的婴儿，其脐带血可 以用于研究人在出生早期与母亲在免疫组库方 面的联系与区别；而对于动物来说尤其是小型 动物，脾脏也是常见淋巴细胞的DNA来源脏器。
以唾液和尿液作为淋巴细胞DNA来源的方式。
2、BCR
B细胞受体（BCR）又称为免疫球蛋白（IG）， 它是由B细胞分泌的可以和抗原结合的蛋白质 分子。成熟的B细胞可以将IG分泌到细胞外面 以中和抗原。免疫球蛋白由两条重链（heavy chain, H），两条轻链（light chain, L）中间通 过二硫键连接而成。重链（IGH）由 Variable （V），Diversity（D），Joining（J）和 Constant（C）基因片段重组而来；轻链（IGL） 只由V-J-C重组而来。重链（H链）又分为V区、 C区、跨膜区及胞质区；而轻链（L链）则只有 V区和C区。V区由VH和VL两个结构域组成，各 有3个CDR即CDR1、CDR2和CDR3。
4. 信息分析:对测出来的序列数据进行信息挖掘，来发掘 出生物学意义与结果。数据分析主要包括数据清理、 质量控制、不同样本数据分离、序列比对、序列注释 以及下游的各种分析。
二、免疫组库测序
1、免疫组库测序概念
免疫组库测序（Immune Repertoire sequencing(IR-SEQ)）是以 T/B 淋巴细胞为 研究目标，用多重PCR技术或5’RACE扩增决 定B细胞受体（BCR）或T细胞受体（TCR） 多样性的互补决定区（CDR3区），再结合 高通量测序技术（HTS），全面评估免疫系 统的多样性，深入挖掘免疫组库与疾病的 关系。
2、以人体内BCR为例，保守估计BCR的种类多 样性在1011这一数量级级别上，其中骨髓方面 占17%，全身淋巴结占到28%，脾脏和粘膜系 统占23%，外周血方面仅占2%，其他约占 30%。然而我们对人免疫组库的研究往往是以 来源方便的外周血，显然外周血对免疫组库多 样性的贡献率2%远远不足，为了能尽量完全 地反映人群的免疫组库全貌，我们可以通过增 加样本量的方式来弥补单个人外周血免疫组库 不能反映免疫组库全貌的不足，但是巨大的样 本量又让人望而却步。
据推测，胚系VDJC基因片段随机组合、重排以及 TCR α/β链和γ/δ 链V区基因重排产生的TCR克隆数 量高达1015-1018，构成多样性极其丰富的T淋巴细 胞抗原受体库。不同T淋巴细胞克隆有不同序列或 长度的TCR-CDR3基因，翻译出不同的CDR3多肽序 列，从而反映T淋巴细胞功能状态。在发生特异性 免疫应答时，TCR多样性发生变化，出现寡克隆甚 至单克隆扩增，随着胸腺再生，大量原始T淋巴细 胞增殖，TCR免疫组库多样性得以恢复和重建。
3、序列结构分析 分析CDR序列组成及序列碱基成分 分析CDR序列的碱基插入和缺失 编码CDR序列翻译成氨基酸和肽链
4、免疫组库构建 构建免疫组库表达谱，统计多样性抗体库克隆表达情况 免疫组库多样性呈现，绘制V/J基因表达的2D、3D图
5、免疫组库差异分析 样品间多样性差异分析（辛普森系数、香农威纳系数） 样品间克隆表达差异分析（CDR3，V-D-J） 分组样品间的克隆表达差异分析（CDR3，V-D-J）