高效液相色谱法教学【全】

§1-3 色谱柱的分离效率
一、塔板理论 塔板理论认为: 一根柱子可以分为n
段，每段内组分在两相间迅速达到平衡， 把每一段称为一块理论塔板。
设柱长为L，理论塔板高度为H，则
H=L/Ｎ
Ｎ为理论塔板数。
理论塔板数一N
①色谱峰对称 ： N 16(tR )2
说明：
tW
a. 在给定的操作条件下，N几乎相同
减小A、B、C 三项可提高柱效。 A，B，C 三项各与哪些因素有关？
A ─涡流扩散项
A = 2λdp dp：固定相的平均颗粒直径
λ：固定相的填充不均匀因子
固定相颗粒越小dp↓，填充得越均匀，A↓，H↓， 柱效Ｎ↑。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象
减轻，色谱峰较窄。
B/u —分子扩散项
B = 2 υD D：试样组分分子的扩散系数（cm2·s-1）
两个组分的分离度会随浓度比的增大而
减小 例： 对多组分而言：
整个色谱分离的分离度取决于Rs最小值 的两个峰。
二．分离度影响因素
Rs
2 (tR 2 tR1 ) W 2 W1
①峰的宽度（峰宽越小， Rs越大）
峰的宽窄主要反映了色谱分离的动力学特性
②两峰的保留时间之差（△tR越大， Rs越大） 反映了色谱分离的热力学特性
于世林编著)
第一章 高效液相色谱法基本原理 §1－1 概述 一、色谱法
混合物最有效的分离、分析方法。 是一种分离技术。 混合物分离过程：试样中各组分在 固液两相间不断进行着的分配。 一相固定不动，称为固定相。 另一相是携带试样混合物流过固定 相的液体，称为流动相。
液相色谱仪
高效液相色谱仪流程图
▪ 分配色谱(Partition Chromatography) 组分在固定相和流动相中的溶解度不同而分离
▪ 离子交换色谱(Ion Exchange Chromatography) 组份离子交换亲和力的差异而分离
▪ 体积排除色谱(Size Exclusion Chromatography) 组分分子量大小不同,对固定相的渗透力不同而 分离
出。
3.容量因子k’ (capacity factor)
一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的 质量比。
k’ 组 组分 分在 在流 固动 定相 相中 中的 的 m m 质 质 M S 量 量 1.Ｋ与k’都是与组分及固定相的热力学性质有
关的常数, 随分离柱温度、柱压的改变而变化 2. 容量因子可以由实验测得。 3.色谱的保留作用：组分理化性质不同→两相间
K值小，先流出柱子； K值大，保留作用强，后
流出柱子。
分配系数K 的讨论
组分在固定相中的浓度 K 组分在流动相中的浓度
一定温度下，组分分配系数K越大，出峰越慢； 每个组份在各种固定相上的分配系数K 不同；
选择适宜的固定相可改善分离效果；
各组分有不同K 值是分离的基础（差移速度） 某组分的K = 0时，即不被固定相保留，最先流
分，则柱效愈高，分离效果愈好。
塔板理论的特点和不足：
(1)当L一定时，N 越大(H 越小)，被测组
分在柱内被分配的次数越多，柱效越 高，所得色谱峰越窄。 (2)柱效不能表示被分离组分的实际分离
效果：如两组分的分配系数K 相同，
无论该色谱柱的柱效多大，都无法 分离。
(3)塔板理论无法解释同一色谱柱在 不同的流动相流速下柱效不同的 实验结果，也无法指出影响柱效 的因素及提高柱效的途径。
分离度基本 关系式：
Rs1 4 Nα α 1kk'1'
四．控制分离度方法
①改变k’ 调节溶剂强度可以改变k’ 增大ｋ’---使用较弱溶剂 降低ｋ’---使用较强溶剂
正相色谱---固定相极性大于移动相 （溶剂极性大→溶剂强度大→洗脱能力强→ｋ’小） 反相色谱---固定相极性小于移动相 （溶剂极性大→溶剂强度小→洗脱能力弱→ｋ’大）
一．分离度的数学表达式：
Rs
2(tR 2 tR1 ) W2 W1
2(tR 2 tR1 )
1.699 [Y1/ 2(2) Y1/ 2(1) ]
Rｓ=0.8：两峰的分离程度可达89%；
Rｓ=1：分离程度98%(达到定性定量分析的最低要求)
Rｓ=1.5：达99.7%（相邻两峰达到基线分离）。
对浓度不同组分而言：
以课堂教学内容为主。
课时安排：
第一章：高效液相色谱的基本原理 第二章：高效液相色谱的仪器装置 第三章：液固、键合相色谱 第四章：离子交换色谱和离子对色谱 第五章：凝胶渗透色谱 第六章：实验技术和辅助实验技术 复习
4学时 2学时 3学时 3学时 1学时 1学时 1学时
参考书籍：
1.色谱理论基础（卢佩章、戴朝政编） 2.高效液相色谱法 （邹汉法、张玉奎、 卢佩章编著） 3.高效液相色谱方法及应用 （色谱技术丛书、化学工业出版社、
色谱分离目的：
----------合理的时间内将样品中组分成功分离 分离度：表示分离状况的一种度量
分离度影响因素： 保留值之差──色谱过程的热力学因素； 峰的宽度──色谱过程的动力学因wk.baidu.com。
讨论：
色谱分离中的四种 情况：
① 柱效较高，ΔK(分配系数)较大，完全分离。 ② ΔK 不是很大，柱效较高，峰较窄，基本分离。 ③ 柱效较低，ΔK 较大，但分离的不好。 ④ ΔK 小，柱效低，分离效果更差。
四、HPLC与GC区别
1．分析对象的区别
GC：适于能气化、热稳定性好、沸点低的样 品， 占有机物的20%
HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品. 对分子量大、难气化、热稳定性差 样品均可检测 。 占有机物的80%
2．流动相的区别
GC：流动相为惰性，组分与流动相无相互作用 力，只与固定相有相互作用。
二.峰扩展和速率方程式
1.峰扩展--由于柱内柱外各种因素引起 的色谱峰变宽或变形，从而造成色谱柱 效的降低 峰扩展程度：取决于组分在柱内的
平衡分配次数 例： 引起峰扩展因素：柱内、柱外
2. 速率方程式（范·弟姆特方程式）
H = A + B/u + C ·u
H：理论塔板高度， u：流动相流速(cm/s)。
理论塔板高度H
H L N
N 16(tR )2 tW
H L ( tw )2 16 tR
物理意义：组分在两相间达到一次平衡对应 的柱长
H愈小→组分在两相间平衡分配次数越多 →柱效↑（不能说明分离一定实现）
说明：
①Ｎ大，固定相分离潜能大。 （分离与否，还取决于其他色谱条件）
②一定色谱条件下，对k’有差异的组
§１－２ 基本概念 一、色谱图
记录仪所记录 的浓度对分离时 间的函数，称为 色谱图。
色谱过程特点：
①浓度对分离时间呈高斯曲线 型
②色谱条件一定时，各组分都 有一特定时间在图谱中出现， 称为组分的保留时间。
③柱效一定时，组分保留值越 小，峰越窄；保留值越大，峰 越宽。
④相邻峰的保留时间相差越大， 越易分离。
分配量不同→柱内保留时间不同
4. 容量因子与保留时间的关系
tR = to(1+k’)
k ' tR to t0
k’太小---没有充分利用填料的分离能力
k’太大---分析时间太长
k’范围：１～
１０
k’ ∝1/ε0（ε0溶剂强度——使组分迁移快慢
的能力）
5. 选择性系数α 可用来衡量两物质的分离程度， 用α表示。
α K2 K1
k2' k1'
ttR R '' 12
色谱理论需要解决的问题？
色谱分离过程的热力学和动力学问题。
组分保留时间为何不同？色谱峰为何变宽？ 组分保留时间：色谱过程的热力学因素控制；
（组分和固定相的结构和性质） 色谱峰变宽：色谱过程的动力学因素控制；
（两相中的运动阻力，扩散） 两种色谱理论：塔板理论和速率理论。
ⅰ大分子，扩散系数小 ⅱ小分子，扩散系数大
5. 影响分离的因素与提高柱效的途径
• 液体的扩散系数仅为气体的万分之一，在高效液
相色谱中,速率方程中的分子扩散项B/u较小，可忽略 不计，即 H = A + C u
• 降低传质阻力是提高 柱效主要途径。 •气相和液相Ｈ－ｕ区别
§１－４ 分离度 (Rs)
P307~311
例: 流动相极性变化对组分k’的影响
②更换色谱柱（改变N）
措施： a.选择长柱子(N=L/H) b.填料颗粒尽量小 c.低流速(溶质传质阻力小，峰扩展小) d.低的溶剂粘度(提高柱效)
高灵敏度 ①紫外检测器的最小检测量可达(10-9 g)；
荧光检测器的灵敏度可达（10-11g）。
②所需试样很少；微升数量级 高选择性
可分离不同类型化合物和异构体，也可分析在 性质上极为相似的化合物 (同位素、同分异构体、空间异构体、手性化合物）
高效液相色谱法的特性:
高压、高效、高速、高灵敏。 适用：高沸点、热不稳定样品
高效液相色谱法
High Performance Liquid
Chromatography （HPLC）
前言:
HPLC是70年代以后发展最 快的一个分析化学分支，现 已成为生化、医学、药物、 化学化工、食品卫生、环保 检测等领域最常用的分离分 析手段。
我国：
开始仅为少数研究实验室拥有， 现很多的生产、研究、质检部门都拥有。 广泛应用于： 质量控制、分析化验、制备分离。 讲课目的：入门 教材：《实用色谱法》（詹益兴 编著） 学习要求：记好笔记，
(1) 存在着浓度差，产生纵向扩散;
(2) 扩散导致色谱峰变宽，H↑(Ｎ↓)，分离变差; (3) B/u与流速有关：流速↓→ 滞留时间↑→ 扩散↑
(＞0.5ml/min)
(4) 扩散系数D，Ｄ↓→B 值↓。
液相中，分子扩散可忽略
C ·u —传质项
传质—溶质分子在两相间浓度不同，由浓度 高的相不断迁移至浓度低的相，直到 浓度达到平衡。
b. N为常量时，tw 随 tR 成正比例变化 c. 与柱长有关: 比较不同长度色谱柱的柱效
时，应当比较它们在相同柱长下的N值。例
d. 是一种理想状态
② 有拖尾峰时: 可用半峰宽来表示N：
N＝5．54 ( tR / W1/2 ) 2
W1/2 -----半峰宽
例：测得tR=105mm、 W1/2 =4mm，求得 N=3789，若此柱长为250mm,折成每米的理 论塔板数约为15200.
根据传质形式分： 固定相传质 移动相传质 C =（Cs + Cm）
固定相传质原因： 进出固定相速度不同（固相，液相） 减小措施：①使用薄的固定相层 ②小颗粒填料
移动相传质原因：迁移 滞留 减小措施 ①填装均匀紧密 ②使用小颗粒填料和表面 多孔性填料
3. 速率理论的要点:
(1)柱内的峰扩展与涡流扩散、分子扩散、 传质阻力有关。
HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有相互作用 力，参与和影响色谱分离. 对分离起主要作用。
3．操作条件差别
GC：加温操作 HPLC：室温；高压 说明：气相、液相地位同样重要
两种互补不足的色谱方法 灵敏度：气相﹥液相 应用范围：液相﹥气相
五、色谱法的分类
▪ 吸附色谱(Absorption Chromatography) 组分对固定相表面吸附力的不同而分离
三、高效液相色谱法的特点
高压: 以液体作为流动相，液体流经色谱柱时，
受到阻力较大 必须对流动相施加高压。 一般可达到150～300kg／cm2， 甚至可达700kg／cm2以上。
高速:
分析时间较经典液相色谱少得多（交 换速度快），一个复杂样品的分析仅需几 分钟到几十分钟。
高效:
气相色谱的分离效能很高，高效液 相色谱的柱效则更高（化学键合相）， 一般约可达 6000理论塔板／米
二、色谱参数
1. 保留时间-tR 从进样开始到 柱后出现样品 的浓度极大值 所需的时间， 用tR表示。
2.分配系数K
在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的 浓度比（单位：g/mL），称为分配系数K
分配系数是色谱分离的依据。
K 组 组分 分在 在流 固动 定相 相中 中的 的浓 浓度 度 ccM S
(2) 通过选择适当的固定相粒度、液膜厚 度及流动相流速可提高柱效。
(3) 为色谱分离和操作条件选择提供了 理论指导。阐明了流速和填料对柱效及 分离的影响。
选择最佳条件，才能使柱效达到最高。
4.获得高柱效的几种方法：
①选用细的颗粒填料 ②流动相流速低 ③流动相粘度小 ④升高温度 ⑤溶质扩散系数与其结构有关
二、色谱法原理
– 混合物中各组份在不互溶的两相中溶解、 吸附等化学性能存在差异；
– 当两相相对运动时,各组分在两相中 反复多次进行平衡分配而达到相互 分离。
分离原理:
分离是一个物理过程。
固定相(Stationary Phase) 流动相(Mobile Phase) 进样 (Injection) 洗脱 (Elution) 相互作用(Interaction)