1.种传病毒的检测方法——原理和方案

种传病毒的检测方法——原理和方案

1、前言

病毒和类病毒是两类独特的病源，和其他病源，如真菌和细菌相比完全不一样。

病毒是一类颗粒，此颗粒由蛋白质外壳和核酸组成。绝大多数植物病毒的（基因组）核酸是单链RNA；只有一小部分植物病毒的基因组是双链RNA或者DNA。类病毒是迄今为止已知最小的植物病源体；它只含有单链环形RNA，并不含蛋白质外壳。马铃薯纺锤体茎病就是由类病毒引起的植物疾病之一。病毒和类病毒一样都没有蛋白质合成体系，而是完全依赖宿主（Hull，2002）。

长久以来，科学家们认为病毒经由种子从病株传播到后代只是偶然的现象。时至今日，我们已经知道，在已知的植物病毒中大约有七分之一可以经由种子从病株传播到后代（Hull，2002），并且此类病毒的数量正与日俱增。病毒种传的三个重要影响是：（ⅰ）对作物造成直接损伤或间接损伤，因为即便是种植了很少量的带毒种子，也会造成病毒病源大量地、随机地扩散，从而有利于寄主对病毒的二次传播；（ⅱ）病毒可以在农作物一季又一季的耕作中存活下来；（ⅲ）毫无疑问的一点就是，带毒种子的贸易使得某些病毒和类病毒在全世界传播开来。

1．1 种传病毒和类病毒

如今，大家都已经知道，病株的种子中往往会出现多种病毒的身影，但是这些种子并不能把病毒传递给子代，只能说这些病毒能在种子中生存，而并不是所谓的种传病毒。

种传病毒的一个主要特征就是它们都能够侵染种子胚胎。当然也有例外，比如说烟草花叶病毒属的某些病毒并不能进入种子的胚胎，但是可以在种子上稳定存活，从而侵染子代。2002年，Hull对各属病毒中种传病毒的种类进行了统计。其中，隐病毒属中含有31种种传病毒，这些病毒往往不会造成多大的经济损失，一般经由种子和花粉传播。

种传病毒所占比例相对较高的病毒属有：苜蓿花叶病毒属（1/1），豇豆花叶病毒属（6/15），黄瓜花叶病毒属（3/3），烟草线条病毒属（8/17），线虫传多面体病毒（17/40），马铃薯Y病毒属（16/179），南方菜豆花叶病毒属（4/14），烟草花叶病毒属（7/17）和烟草脆裂病毒属（3/3），而在诸如香石竹环斑病毒属，黄矮病毒属，玉米雷亚多非纳病毒属以及纤细病毒属中并没有种传病毒。在双生病毒属（102种）中也没有种传病毒。

在已知的28种类病毒中有10种是种传病毒。附录一列出了种传病毒和类病毒以及它们所属的病毒属、种名，而表4.1则就对农业生产造成巨大损失的34种病毒和类病毒以及它们的主要宿主一一列出。

1．2 种传病毒的研究历程

1910年，Westerdijk首次怀疑烟草花叶病毒在番茄上存在种传现象，在随后的很长一段时间里，科学家们先后发现BCMV在黄豆上、黄瓜花叶病毒在野生黄瓜上、莴苣花叶病毒在莴苣上、蚕豆花叶病毒在蚕豆上存在种传现象。截止到1951年为止，只发现了6种种传病毒，但仅仅过了六年之后，人们就在40种植物上发现了20种种传病毒。到了1964年，种传病毒的种类已经达到36种，而宿主的数量也达到63种，而1969年种传病毒的种类则达到47种，1974年85种，到1988年时，据Agarwal和Sinclair 的估计种传病毒的数量则多达156种。

自从1951年之后，科学界先后有多篇有关种传病毒的综述发表，比如，Bennett(1969)，Bos(1977)，Neergarrd(1977)，Mandahar(1981)，Mink(1993)以及Johansen et al. (1994)等。其中，Mink于1993年发表的综述主要针对种传病毒研究中出现的问题进行了修正，他发现许多病毒被误归为种传病毒，并认为108种病毒（除隐病毒属之外）

和七种类病毒可以归为种传病毒。从那以后，种传病毒新的发现以及病毒分类原则的更改所导致的变更就时时地在种传病毒名称列表中体现出来。附录一中的内容也相应地进行更新（但并不一定完全）。在本书以后章节中出现的种传病毒缩写形式的全名以及种传病毒的归属请参见表4.2。

种子在植物病毒传播生态学上的重要性越来越受到各界的重视，从而也导致了国际上检验检疫机构对种子健康加大了检查的力度。与此同时，科学界对于多种杂草作为种传病毒的宿主以及除非杂草得到控制否则杂草种子将成田间病毒库等问题的认识日渐清晰。

1．2．1 从种子中检测病毒

种子中检测病毒即使一门科学又是一门技术，它被种子检测站和植物检疫实验室用来从大批的种子中筛选出具有耕种价值的种子。

最早用来检测种子是否携带病毒的方法是检测由种子培育的幼苗，也就是所谓的生长实验。该方法最早被Fajardo用于从大豆中检测BCMV。后来该方法又被Mckinney 用于从稗草中检测稗草条状花叶病毒，此外Rohloff和Hampton还把该方法用于检测莴苣花叶病毒。在生长实验中，Rohloff（1966）和Phatak（1974）都认为光线的强度以及光源的类型对病毒症状的形成起着至关重要的作用，同时，病毒的株系以及宿主的种类也同病毒在幼苗上症状的发生有着紧密的关系。

与此同时，Lister和Murant研究发现，种子在受到由线虫所传播的病毒侵染之后的特征就是在生长实验时不显示症状。由于病毒在种子中的潜伏性或者症状不明显以及由其它因素所引起的症状和带毒症状之间的相似，从而使得种传病毒的研究人员意识到在生长实验之外必需辅以生物学或者血清学的检测。尽管如此，生长实验在研究种子携带子株传播病毒方面依然具有无可比拟的优势。Quantz发表了检测BCMV的方法，首先，接种超敏大豆株系‘Top Crop’的初叶，然后将初叶剪下，接着将初叶放在培养皿中的湿润滤纸上于32℃下用恒定人造光孵育3天。后来，在1962年，这种方法又被用来从大豆种子中检测病毒，略微的修改是让种子在滤纸上预先萌发3-4天。用生物学方法从莴苣种子中高灵敏地检测莴苣花叶病毒率先由Pelet和Gagnebin于1963年提出，随后在1967年又得到Marrou和Messiaen的补充，具体的方法是，把莴苣种子在缓冲液中磨成粉末然后接种在昆诺阿黎的幼苗上，使用该方法可以从700粒种子中检测出一粒带毒种子。

Hamilton（1965）是率先把血清学技术应用于从种子中检测病毒的人之一，具体的做法就是，把从大麦种子中分离出来的胚压碎涂在小的滤纸盘上，然后把滤纸盘放在琼脂上，琼脂的另一侧则放着浸满BSMV抗血清的另外一块滤纸盘，如果稗草种子的胚受到BSMV侵染的话，则琼脂上则呈现用肉眼就可见到的沉淀。在琼脂中加入去污剂可以防止病毒粒子凝结的同时也可把病毒裂解成具有迁移能力的抗原，从而提高检测的灵敏度。病毒和病毒抗血清所形成的特异性条带在大约48小时后依然可见。后来，Slack 和Shepherd对用琼脂法从小麦和稗草种质中检测BSMV的方法进行了改良，形成了所谓的放射扩散法。在该法中，把种子刚刚萌发所生成的小叶片（1mm）压进琼脂中，在琼脂中含有稀释过的抗血清、去污剂以及叠氮化钠。此外，此处制备的抗血清是抗经四氢吡咯消解的病毒蛋白，因此，针对完整病毒颗粒制备的抗血清和经去污剂降解的病毒粒子之间反应较弱。在经过24-36个小时的孵育之后，可以用立体显微镜观察结果。

该方法可以在直径为9cm的琼脂盘上同时观察500-600个样品，其优点就在于可以直接计算带毒率，与此同时，没有携带病毒的种子就可以直接生长，于是就使得种质资源得以保存。在美国蒙大拿州，这两种检测方法都已经成为种子商品评级的常规方法。截