植物染色体制片技术的比较研究

植物染色体制片技术的比较研究
摘要本文以韭兰为材料，对植物染色体常规压片、去壁低渗法制片技术染色效果进行了比较。

实验表明：去壁低渗法获得细胞和染色体都较分散，Giemsa 染色使得背景与材料的对比度较大，便与观察。

不足之处在于去壁低渗过程中，时间特别不易掌握，耗材多，且成功率较低，染色体容易丢失、形态也不太理想。

常规压片耗材少，成功率较高，但不易做分带制片。

关键词植物染色体；常规压片；去壁低渗
一、材料与方法
1.供试材料试验用植株由校园内采集
2.根尖制片
（1）常规压片。

首先在早上9：00—10：00采集韭兰的根，在室温下放入0.1%秋水仙素溶液中进行预处理处理8h。

然后在常温下把材料放在卡诺氏固定液下固定10min，接下来就在1 mol/L盐酸溶液中解离到松软刚合适为止。

最后用蒸馏水将韭兰根冲洗干净，这样前处理就结束。

处理完后就可以用醋酸洋红染色或改良苯酚品红染色。

压片/涂片后选取典型的染色体，在40倍物镜及油镜下显微照相。

（2）去壁低渗法。

首先把材料放0.1%秋水仙素溶液中进行预处理处理8h。

然后前低渗，即将根尖放在0.075tool/LKCI低渗液中，在20-25℃条件下处理0.5h。

接下来就是最关键的去壁，倒去KCI溶液，加入2.5%混合酶液，在25-30℃温度下处理2-5h左右。

去壁后要进行后低渗，使细胞完全膨胀，即是用20-30℃蒸馏水慢慢冲洗2-3次后，再将根尖放在0.075tool/LKCI低渗液中处理。

将后低渗后的材料先经固定液固定后，就可以把去壁固定的根尖放在清洁的载片上，将材料夹碎，加1滴固定液。

放于酒精灯上微微加热烤干。

最后用Giemsa染色，后选取典型的染色体，在40倍物镜及油镜下显微照相。

二、结果与分析
1.常规压片法
常规压片法操作简单，醋酸洋红对于染色体染色均匀，由于它对RNA也有染色效果，以此种方法染色的染色体十分饱满，倘若制片操作合适，加上脱色、沉淀等步骤，能够制出背景清晰、效果良好的装片，可供染色体核型分析。

但由于细胞壁的存在使染色体分散不完全，染色体易重叠。

另外，由于染料原因，染色体与细胞质反差小，不易于照相。

醋酸洋红的着色能力和分色效果会影响到显微摄影的效果。

2.去壁低渗法制片
去壁低渗制片技术是利用前低渗先使细胞吸水膨胀，再经酶解细胞壁，便于染色体分散。

去除细胞壁是该技术的关键。

此方法可以提高染色体的分散程度和平整性。

用Giemsa染色获得的染色体形态比较完整均一，染色体各组成部分——长臂、短臂、着丝点、随体的显示都比较清楚，有利于染色体的测量和分析。

试验中染色体种制片技术的效果对比着色深，此法所得制片背景十分清爽，为染色体形态数目的观察创造了良好的条件。

3.去壁低渗染色注意事项
压片法是最常用的方法，去壁低渗法是较新的一种方法。

采用常规压片方法简便、快捷、经济、成功率高实用于材料较少的植物的核型分析制片，是研究细胞分裂和染色体动态变化首先使用的方法。

但用压片法制得的标本片在脱片过程中染色体易丢失。

采用去壁低渗法，可得到染色体分散好的细胞，特别是对染色体数目多、形态小的植物。

去壁低渗法使植物染色体分带成为可能，从而为更高层次的研究植物染色体奠定基础。

因此，进行染色体分带时，去壁低渗法比压片法更易获得完整染色体组的分裂相。

但在去壁低渗法中要注意以下几个因素：
第一，在去壁过程中，酶解的时间特别不易掌握，受材料种类（单子叶植物，双子叶植物）、大小及温度的影响。

因为酶在25℃时活性最强，因此在这种情况下，酶解多几分钟就很可能造成酶解过度，材料解体，找不到染色体。

而酶解少几分钟就又有可能使得酶解不足，达不到去壁的目的，染色体分散不开。

因而在温度上建议使用低温最好是0—3℃酶在0—3℃时活性就大大降低了，酶解也就比较缓和了。

这样酶解多或少几十分钟关系均不甚大。

酶解时间变幅宽，就较易掌握了。

第二，酶解去壁后，低渗的时间也很难掌握，细胞酶解去壁后，剩下的只是质膜了。

这时，通过后低渗，水分子就会通过质膜向细胞质中渗透，使质膜渐渐膨胀。

如果细胞质吸水过多，质膜的伸展性达到极限，势必胀破，同样造成材料解体；吸水不足，细胞质膨胀较小，体积小，染色体不能均匀地分散在细胞质中，所得分散相也不会太好。

根据渗透原理在温度上建议使用低温最好是0—3℃，因为渗透速度随温度升高而加快，也就是说，在0—3℃时物质渗透速度比在25℃时要慢得多。

因此在低温下后低渗多或少几十分钟关系并不紧要。

后低渗透时间变幅宽，就较容易掌握了。

第三，用火焰干燥制片时，务必使载片上有足够的固定液。

因为固定液过多，片上火焰燃烧时间长，染色体分散性可能较好，但染色体结构易受破坏，往往出现解螺旋现象，反之，固定液过少则染色体分散度差。

选择适宜的染色体制片方法，对于确定染色体数目、倍性水平、染色体形态等有助于植物细胞水平的遗传变异研究。

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