乳腺癌相关基因启动子甲基化的研究进展

·综 述·
乳腺癌相关基因启动子甲基化的研究进展
赵玉凤，李　锋，曹玉文，蒋金芳
收稿日期：2010-03-04
基金项目：国家自然科学基金资助项目（No 30760072）作者单位：石河子大学医学院病理学教研室，石河子　832000作者简介：赵玉凤，女，在读硕士生。

E⁃mail ：zhaoyuf999999@
曹玉文，女，硕士生导师，通讯作者。

E⁃mail ：cywwb @ya⁃
摘要：表基因的改变是乳腺癌发生发展过程中非常重要的机制。

DNA 甲基化是一种表观遗传修饰，是基因表达调控的一种方式。

目前，已发现许多肿瘤相关基因启动子区CpG 岛的甲基化异常与乳腺癌的发生密切相关。

该文就乳腺癌相关基因甲基化的研究进展作一综述。

关键词：乳腺肿瘤；DNA 甲基化；基因中图分类号：R 737.9 文献标识码：A 文章编号：1001-7399（2010）03-0350-03
乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，在西方发达国家其
发病率更居女性恶性肿瘤首位［1］。

近年来我国一些大城市
及沿海经济发展较快地区，乳腺癌的发病率不断上升。

而且有年轻化趋势，严重危害着广大妇女的身体健康，因此，对其进行研究尤为必要。

然而乳腺癌的发生发展却是复杂、多步骤和多阶段不断演进的过程。

研究证明：在正常细胞转化为肿瘤细胞以及肿瘤细胞侵袭性不断增强的过程中表观遗传学的改变，特别是基因的异常甲基化在肿瘤的发生与演进过程起重要作用。

DNA 甲基化是指在DNA 甲基转移酶（DNA methyltrans⁃
ferase ，
Dnmt ）的作用下，以S⁃腺苷甲硫氨酸（SAM ）为甲基供体。

将甲基基团转移到胞嘧啶和鸟嘌呤（CpG ）二核苷酸的胞嘧啶中5位碳原子上，并与其3'端的鸟嘌呤形成mCpG ，在DNA 双链中对称出现。

基因启动子区甲基化可在转录水平抑制基因表达。

在肿瘤组织中，常有DNA 损伤修复、信号转
导通路等有关基因的失活，从而导致恶性肿瘤的发生和发展。

迄今已发现许多恶性肿瘤存在1个或多个肿瘤抑制基因CpG 岛甲基化。

肿瘤抑制基因CpG 岛甲基化是当今肿瘤分子生物学研究的热点。

因此，在肿瘤研究中检测基因启动子区CpG 岛甲基化状态，对于阐明肿瘤发生、发展的机制及建立早期诊断方法均具重要意义。

1　DNA 修复相关基因
1.1　BRCA1和乳腺癌　由Hall 等
［2］
在1990年发现的乳腺
和卵巢肿瘤易感基因BRCA1（breast and ovarian cancer sus⁃
ceptibility gene ）定位于人染色体17q21，基因全长100kb ，内含高达41.5%的Alu 重复序列，24个外显子，包括22个编
码外显子和2个非编码外显子（外显子1和4）。

BRCA1具有转录调控活性及DNA 损伤修复功能。

国内学者杨海捷
等［3］
报道原发性乳腺癌组织中，BRCA1甲基化率为65.22%
（15/23）；乳腺不典型导管增生组织中BRCA1基因甲基化率33.33%（2/6），认为BRCA1基因启动子区CpG 岛甲基化是散发性乳腺癌发生过程中的早期事件，可能在乳腺癌发生中和乳腺增生病癌变过程中起重要生物学作用。

Karray⁃Chouayekh 等
［4］
研究发现BRCA1在乳腺癌中的甲基化率是46%，且发现BRCA1甲基化与年龄（P =0.15）和5年无瘤生存率无关（P =0.16）。

1.2　hMLH1和乳腺癌　hMLH1基因是1994年Bronner
等［5］在研究遗传性非息肉性结直肠癌的过程中发现的。

hMLH1是一种DNA 错配修复基因，位于3P21.3⁃23，基因组全长58kb ，含19个外显子，其编码的蛋白质产物参与hPMS2结合，形成异源二聚体，识别错配位点，参与错配修复，主要作用是保持遗传物质的完整性和稳定性保证复制
的忠实性。

Karray 等［6］
在乳腺癌中检测到hMLH1的甲基化
率24.3%，且hMLH1甲基化与大的肿瘤（P =0.02）及远处转移（P =0.04）有关。

2　信号通路相关基因
2.1　EphA5和乳腺癌　酪氨酸蛋白激酶受体（receptor tyro⁃sine kinases ，RTKs ）在细胞的生长及分化中起重要作用。

近来研究表明，作为RTK 最大亚族Eph 受体激酶家族中的一员，RTK 是细胞信号转导的关键，参与了胚胎发育、细胞生长、恶性转化及肿瘤侵袭转移等许多过程，Eph 是最大的酪
氨酸蛋白激酶受体家族，有研究发现［7］，受体在许多不同的
肿瘤组织和细胞系中均为高表达。

EphA5是Eph 受体酪氨酸激酶家族的成员，在调节癌症的发生中起了关键性作用。

最近研究发现［8］，在乳腺癌中检测到EphA5甲基化率达
64.1%，与之相匹配的乳腺正常组织的甲基化率则为
28.2%。

研究还发现：EphA5甲基化与较高的肿瘤分级、淋巴结转移及PR 阴性相关，EphA5可能是预测乳腺癌发生发展的有用分子标记物。

2.2　WIF1和乳腺癌　Wnt 抑制因子⁃1（Wnt inhibitory fac⁃tor⁃1，WIF⁃1）是近年来发现的肿瘤抑制因子，它通过结合Wnt 蛋白抑制Wnt 通路的活性，并因此被命名。

编码WIF21的基因定位12q14.3染色体上。

包含10个外显子在内，全
长约200kb 在GenBank 上储存的cDNA 序列长度为2014bp ，但这个cDNA 序列不完全。

在人体内WIF2主要转录产物为2034bp ，其转录的mRNA 长度为2.2kb 。

此外还发现另外3种分别长约2.4kb 、2.7kb 和3.2kb 的转录产物·
053·临床与实验病理学杂志　J Clin Exp Pathol 2010Jun ；26（3）
WIF21为保守型分泌型蛋白和sFRP家族共同属于第一类Wnt抑制物［9］。

Veeck等［10］最近在乳癌中检测到WIF1的甲基化率为63.3%，并且发现WIF1的甲基化和DKK3的甲基化有显著相似相关性（P=0.009）。

2.3　DKK3和乳腺癌　DKK3位于11p15.1，其编码的蛋白是Wnt受体复合体的对抗物能够阻止信号转导通路的规则途径，它的失活使WNT和受体Frizzled结合，使Wnt通路异常激活或调节基因的失调，从而导致肿瘤发生［11］。

Kurose 等［12］发现Dickkopf家族的DKK3和DKK1有着相似的抑制增殖的能力。

研究者在乳癌中检测到DKK3的为61.3%［10］，且发现与WIF1的甲基化有相关性。

DKK3甲基化在病人的整体存活率和无瘤生存率方面是一个可预测的因素。

估计DKK3甲基化的乳癌病人10年整体存活率是54%，反之，则生存率是97%。

同样的，DKK3甲基化的乳癌病人10年无瘤生存率是58%，反之为78%。

DKK3甲基化已显示是一个新的预后标记物，在临床治疗方面很有帮助。

2.4　SFRP2与乳腺癌　SFRP2定位于染色体4q31.3，包含2个内含子和3个外显子，在SFRP2基因的第1个外显子周围有着高密度的CpG岛，这个CpG岛与肿瘤细胞DNA甲基化密切相关。

SFRP2是一种分泌型糖蛋白，它可竞争性结合Wnt蛋白，阻断Wnt信号通路的转导。

作为Wnt信号的调控基因，涉及肿瘤的发生和进展。

Veeck等［13］在原发乳腺癌中SFRP2启动子甲基化率高达83%。

2.5　ARHI与乳腺癌　ARHI基因也称NOEY2基因，是1999年报道的一种新的抑癌基因，系小GTP结合蛋白中Ras 亚家族的成员之一，系母系印迹基因，定位于染色体1p3l，cDNA全长1495bp，共2个外显子，编码区长687bp，蛋白产物的相对分子质量为26000。

可参与细胞周期调控和信号通路转导，从而负向调节细胞生长。

国内杨举伦等［14］研究发现乳腺癌发生过程中所有MCF10模型的细胞系该基因均发生高甲基化。

认为NOEY2基因启动子区高度甲基化及相应的mRNA表达减少是乳腺癌发生过程中的早期事件，与乳腺癌发生有关，可能成为早期诊断乳腺癌的潜在分子生物学标记。

3　其他
3.1　ADAM33和乳腺癌　ADAM33（hADAM33）基因属于锌指依赖性金属蛋白酶基因超家族，定位于20号染色体短臂（20p13），跨度约14kb，包含22个外显子和21个内含子，编码的蛋白质包含813个氨基酸，其结构有8个域（信号肽域、前导肽域、催化域、去整合素域、半胱氨酸富含域及类表皮生长因子域，跨膜域和胞质域）［13］。

该基因编码具有裂解蛋白质活性的酶，属于Ⅰ型跨膜蛋白。

ADAM33基因广泛表达，但在大脑、心脏、肾脏、肺、睾丸等组织中高表达，现已被认为是哮喘的易感基因。

Gerusa等［16］检测到40%的原发性乳癌ADAM33启动子发生甲基化。

在小叶癌中是76.2%，在导管癌中是25.5%，这种不同有显著的统计学意义，认为ADAM33启动子甲基化是一种区分浸润性小叶癌和浸润性
导管癌有用的分子标记物。

3.2　MAL和乳腺癌　1987年Alonson等［17］发现了在T细胞分化中晚期时表达的抑癌基因，命名为MAL基因。

该基因定位于2q13，由4个外显子和3个内含子组成，其cDNA 全长为1051bp，为相对分子质量16170的蛋白质。

MAL基因失活及异常与细胞信号转导、肿瘤的发生发展和临床预后有一定关系。

Horne等［18］在乳腺癌中检测到MAL基因的甲基化率为（41.7%）。

4　DNA甲基化的检测方法
随着DNA甲基化研究的不断深入，其检测方法也层出不穷。

常用的方法有：硫酸氢钠-限制性酶切法（CO⁃BRA），亚硫酸氢钠⁃MSP和直接测序法。

COBRA具有简便快捷的特点，在检测完全甲基化和完全不甲基化的样品时最常用；缺点是它仅限于检测数量有限的限制性酶切位点甲基化；亚硫酸氢钠⁃MSP是Herman等1996年建立的异常甲基化检测方法（MSP），其灵敏度高、特异性好、操作简便、样品容易获得且用量少；其缺点是需要两组已知的关键性CpG 位点设计上下游引物，并且这些位点必须完全甲基化或完全不甲基化；与巢式PCR法联用能够提高其特异性。

该方法高度的敏感性使它能够用于血清或血浆样品中微量模板的甲基化检测；直接测序法：这种方法的可靠性及精确度都很高，能检测到目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态，但需要大量的克隆测序，过程较为繁琐，费用也比较高。

5　展望
目前单从DNA突变等遗传学途径尚不能完全解释乳腺癌的发生机制，甲基化和乙酰化等表观遗传学途径的探索为乳腺癌发生机制的研究开辟了一条崭新的道路。

DNA甲基化是一可逆过程，是肿瘤发生过程中的早期事件；基因甲基化改变早于恶性表型的出现，若对甲基化的癌基因和抑癌基因人为进行药物逆转，可为乳腺癌早期治疗提供新的思路；对乳腺癌相关抑癌基因异常甲基化谱的检测，则有助于对乳腺癌的早期诊断；抑癌基因甲基化状态与临床肿瘤分期相结合还可用于判断患者的预后。

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·国外期刊文摘·
儿童及青少年结内弥漫性大B细胞淋巴瘤：免疫表型及c⁃myc易位与临床预后相关
Gualco G，Weiss L M，Harrington Jr W J，et al.Nodal diffuse large B⁃cell lymphomas in children and adolescents：immunohis⁃tochemical expression patterns and c⁃myc translocation in rela⁃tion to clinical outcome.Am J Surg Pathol，2009，33（12）：1815 -22.
作者研究了16例儿童及青少年结内弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large B⁃cell lymphoma，DLBCL），其中2例表现纵隔淋巴结肿大，4例同时伴有外周及纵隔淋巴结肿大，10例伴有浅表和（或）腹腔淋巴结肿大。

患者年龄为10至18岁，男9例，女7例。

该组病例均按照2008年WHO分类标准进行分型，即采用免疫组化方法检测CD10、Bcl6和MUM1蛋白表达，并根据其表达模式分为生发中心B细胞样（GCB）和非生发中心B细胞样（non⁃GCB）两个亚组。

此外，作者还对TCL1、Bcl⁃2蛋白表达以及Ki⁃67增殖指数进行了评价，并采用荧光原位杂交方法检测了c⁃myc和Bcl⁃2基因易位。

原癌基因c⁃myc作为转录因子，其功能涉及细胞增殖与成熟分化的调控。

当c⁃myc失调时可阻止B细胞分化并具有癌基因活性。

TCL1（T cell leukemia1）是调控B细胞的
癌基因，涉及各种成熟B细胞淋巴瘤的发病机制。

这些参数均与DLBCL的临床特征及预后相关。

研究结果显示，该组病例以中心母细胞形态和生发中心B细胞样DLBCL较多见（63%，10/16），其中CD10阳性4例（24%），Bcl6阳性14例（87%），Bcl2阳性10例（63%），MUM1阳性7例（44%），
TCL1阳性5例（31%），平均Ki⁃67增殖指数为71%（范围30%耀90%）。

细胞遗传学结果显示具有c⁃myc易位的病例达到37%（6/16），仅有1例表现Bcl⁃2易位。

另外，研究发现该组病例的Bcl⁃2阳性表达率要高于以前的文献报道，但是进行单因素或多因素分析证实其对疾病预后并无直接影响。

之前的文献报道对TCL1在儿童及青少年DLBCL中的表达并无具体研究，而该组病例的研究结果显示TCL1的阳性表达率达到31%，并且TCL1阳性表达与患者临床预后之间存在明显正相关；在这些病例中MUM1的阳性表达率达到44%，并且MUM1阳性表达与患者临床预后之间存在明显负相关。

研究还证实TCL1表达、c⁃myc易位及Ki⁃67高增殖指数之间存在明显的直接关联。

结果提示发生于儿童及青少年的结内DLBCL主要为生发中心B细胞样亚组，可表现Bcl⁃2高表达以及常存在c⁃myc易位，临床预后较好。

这些病例可表现TCL1和MUM1高表达，并且TCL1阳性表达提示与预后良好相关，而MUM1阳性表达则提示预后不佳。

（刘勇摘译/江西省人民医院病理科，南昌　330006）
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·临床与实验病理学杂志　J Clin Exp Pathol　2010Jun；26（3）。