两种纳豆激酶活性测定方法对比及相关性分析

作者简介：杨明俊（１９７９－），男（汉），硕士研究生，研究方向：微生物药物学。

＊通讯作者
杨明俊１，杨晓彤１，＊，冯慧琴１，糜可１，杨庆尧２
（１．上海师范大学微生物与免疫学研究所，上海２００２３４；２．上海杨杨百草研究所，上海２００２３４）
两种纳豆激酶活性测定方法对比及相关性分析
摘
要：从线性和精密度两个方面对纤维蛋白平板法和四肽底物法测定纳豆激酶活性的两种方法进行了比较研
究，并验证了两种方法测定值之间的直线相关性。

结果表明：纤维蛋白平板法和四肽底物法分别在１０．７７ＩＵ／ｍＬ￣８０．７３ＩＵ／ｍＬ和０．０３Ｕ／ｍＬ￣０．０９Ｕ／ｍＬ浓度范围内呈线性，且日间和日内变异系数均小于１０％。

两者结果具有直线相关性，其关系为纤维蛋白平板法测定值（ＩＵ）＝２６４．８７×四肽底物法测定值（Ｕ）－１９．６３３，（Ｒ２＝０．９９４２）。

结论：纤维蛋白平板法与四肽底物法均能用于纳豆激酶活性测定，前者测定结果直接，但四肽底物法更灵敏，还可应用于高通量筛选。

关键词：纳豆激酶；纤维蛋白平板法；四肽底物法
ＡＣＯＭＰＡＲＩＳＯＮＡＮＤＣＯＲＲＥＬＡＴＩＯＮＳＴＵＤＹＯＦＴＷＯＭＥＴＨＯＤＳＦＯＲＮＡＴＴＯＫＩＮＡＳＥＡＣＴＩＶＩＴＹＤＥＴＥＣＴＩＯＮ
ＹＡＮＧＭｉｎｇ－ｊｕｎ１，ＹＡＮＧＸｉａｏ－ｔｏｎｇ１，＊，ＦＥＮＧＨｕｉ－ｑｉｎ１，ＭＩＫｅ１，ＹＡＮＧＱｉｎｇ－ｙａｏ２
（１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ＳｈａｎｇｈａｉＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２００２３４，Ｃｈｉｎａ；
２．ＳｈａｎｇｈａｉＹａｎｇ’ｓＨｅｒｂＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２００２３４，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｉｓｓｔｕｄｙｃｏｍｐａｒｅｄｔｈｅｌｉｎｅａｒｉｔｙａｎｄｐｒｅｃｉｓｉｏｎｏｆｆｉｂｒｉｎｐｌａｔｅ（ＦＰ）ｍｅｔｈｏｄｗｉｔｈｔｅｔｒａ－ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｓｕｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－ｐＮＡ）ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＳＳ）ｍｅｔｈｏｄ，ａｎｄｔｈｅｉｒｒｅｓｕｌｔｓ’ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｙｗａｓａｌｓｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｒｅ－ｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ：Ｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｌｉｎｅａｒｒａｎｇｅｓｗｅｒｅ１０．７７ＩＵ／ｍＬ￣８０．７３ＩＵ／ｍＬｆｏｒＦＰｍｅｔｈｏｄａｎｄ０．０３Ｕ／ｍＬ￣０．０９Ｕ／ｍＬｆｏｒＳＳｍｅｔｈｏｄｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｗｈｉｌｅｂｏｔｈＣＶｓｗｅｒｅｌｅｓｓｔｈａｎ１０％ｉｎｗｉｔｈｉｎ－ｄａｙａｎｄｄａｙ－ｔｏ－ｄａｙｔｅｓｔｓ．Ｔｈｅｔｗｏｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄａｇｏｏｄｌｉｎｅａｒｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎａｎｄｃｏｕｌｄｂｅｃｏｎｖｅｒｔｅｄａｓ：ＦＰｖａｌｕｅｓ（ＩＵ）＝２６４．８７×ＳＳｖａｌｕｅｓ（Ｕ）－１９．６３３，（Ｒ２＝０．９９４２）．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ：ｆｉｂｒｉｎｐｌａｔｅｍｅｔｈｏｄａｎｄｔｅｔｒａ－ｐｅｐｔｉｄｅｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＳＳ）ｍｅｔｈｏｄａｒｅｂｏｔｈａｐ－ｐｌｉｃａｂｌｅｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｎｇＮａｔｔｏｋｉｎａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｆｒｏｍＦＰｍｅｔｈｏｄｃａｎｄｉｒｅｃｔｌｙｒｅｆｌｅｃｔｎａｔｔｏｋｉｎａｓｅ’ｓｔｈｒｏｍ－ｂｏｌｙｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｔｈｅｔｅｔｒａ－ｐｅｐｔｉｄｅｓｕｂｓｔｒａｔｅｍｅｔｈｏｄｈａｓｔｈｅａｄｖａｎｔａｇｅｆｏｒｆａｓｔ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｎｄｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｎａｔｔｏｋｉｎａｓｅ；ｆｉｂｒｉｎｐｌａｔｅｍｅｔｈｏｄ；ｔｅｔｒａ－ｐｅｐｔｉｄｅｓｕｂｓｔｒａｔｅｍｅｔｈｏｄ纳豆（Ｎａｔｔｏ）是日本的传统发酵食品，以大豆为原料由纳豆芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓｖａｒ．ｎａｔｔｏ）发酵而成，其风味独特、营养丰富。

纳豆激酶（Ｎａｔｔｏｋｉｎａｓｅ，ＮＫ）是纳豆中的一种丝氨酸蛋白酶，具有较强纤溶活性，因此常食纳豆可减少血管栓塞的危险，有益于老年性心血管疾病的预防［１］。

纳豆激酶的活性反映了纳豆的保健功效，因此活性测定是纳豆研究和质量控制中必需也是关键的技术之一。

纳豆激酶活性测定方法常见的有纤维蛋白平板法［２］、
纤维蛋白块溶解时间法［３］、四肽底物法［４］、酶联免疫吸附法［５］和血清板法［６］等，其中使用得较多的是纤维蛋
白平板法，即根据纳豆激酶将纤维蛋白平板内纤维蛋白（Ｆｉｂｒｉｎ）水解而形成透明圈的原理，利用透明圈面积计算纳豆激酶纤溶活性。

该测定法的优点是结果比较直观，但由于所用试剂为生物制品，批次差异大，实验操作复杂，实验过程耗时，难以进行大批量样品高通量筛选。

已知纳豆激酶对Ｓｕｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－ｐＮＡ最为敏感［７］，可以将该底物水解生成对硝基苯胺（ｐ－ＮＡ）而使溶液呈黄色，根据单位时间内对硝基苯胺的释放量计算酶的活性。

此法底物为人工合成的小肽，品质容易控制，操作便捷，特别是可以进行大批样品的高通量筛选。

但其测定的纳豆激酶活性与纤溶活性的相关性一直未经验证，用于纳豆激酶测定的具体条件也未见报道。

本研究分别用纤维蛋白平板法和四肽底物法测
图１
尿激酶活性标准曲线
Ｆｉｇ．１ＳｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅｏｆＵｒｏｋｉｎａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ
定了纳豆激酶的活性，研究了与纤维蛋白平板法结果的相关性，并初步建立了纳豆激酶四肽底物测定法的具
体条件。

１材料与方法１．１材料和主要仪器
纳豆激酶粗酶提取冻干粉：由上海杨杨百草研究所提供；尿激酶标准品（６９０ＩＵ／支）：中国药品生物制品检定所；牛纤维蛋白原（７２ｍｇ可凝蛋白／支）：中国药品生物制品检定所；牛凝血酶（１９０ＢＰ单位／支）：中国药品生物制品检定所；琼脂糖：上海东海制药厂；四肽底物（Ｌ－１４００，Ｓｕｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－ｐＮＡ）：Ｂａｃｈｅｍ公司；对硝基苯胺：上海试剂三厂。

Ｍｏｄｅｌ６８０型酶标仪：Ｂｉｏ－Ｂａｄ公司；ＧＳＰ－９１６０ＭＢＥ隔水式恒温培养箱：上海博迅实业有限公司；ＤＫ－Ｓ２４型电热恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司。

１．２方法
１．２．１纤维蛋白平板法
首先用２％（ｗ／ｖ）牛纤维蛋白原巴比妥－氯化钠（ｐＨ７．８）溶液５ｍＬ；１０％（ｗ／ｖ）琼脂糖生理盐水溶液
５ｍＬ；２００ＢＰ单位／ｍＬ牛凝血酶溶液２５ｍＬ制成纤维蛋白平板。

用巴比妥－氯化钠缓冲液配制１００ＩＵ／ｍＬ尿激酶标准品溶液并稀释成８０ＩＵ／ｍＬ、６０ＩＵ／ｍＬ、４０ＩＵ／ｍＬ、
２０ＩＵ／ｍＬ和１０ＩＵ／ｍＬ的浓度梯度，然后各取１０ｍＬ滴加到纤维蛋白平板上，３７℃条件下孵育１８ｈ后测量形成透明圈两条相互垂直的直径，并计算其面积。

以尿激酶活力单位的对数值为横坐标，透明圈面积的对数值为纵坐标，绘制标准曲线。

样品溶液形成的透明圈按同样的方法测定，并计算透明圈面积的对数值，根据标准曲线以尿激酶活力单位表示其纤溶活性。

１．２．１．２纤维蛋白平板法的线性
以巴比妥－氯化钠缓冲液配制浓度分别为３０ｍｇ／ｍＬ、
２４ｍｇ／ｍＬ、１８ｍｇ／ｍＬ、１２ｍｇ／ｍＬ和６ｍｇ／ｍＬ的样品溶液，同法滴加在纤维蛋白平板上，测量透明圈的面积，每浓度重复５次取平均值，以ＳＰＳＳ１０．０对样品溶液浓度与相应透明圈面积的关系进行直线回归分析。

１．２．１．３纤维蛋白平板法的精密度
分别取各浓度的样品溶液滴加在纤维蛋白平板上，测量透明圈的面积，日内和日间各重复３次，以变异系数（ＣＶ）表示测定值批次间的差异。

１．２．２四肽底物法
用Ｔｒｉｓ－ＣａＣｌ２缓冲液（０．１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ，０．０１ｍｏｌ／ＬＣａＣｌ２，
ｐＨ８．０）配制１ｍｍｏｌ／Ｌ的四肽底物溶液。

３７℃条件下，分
别取５０ｍＬ不同浓度的样品溶液加入细胞培养孔中，再同时加入５０ｍＬ四肽底物溶液，振荡混匀，以４１５
ｎｍ为测定波长５５０ｎｍ为参比波长，用酶标仪测定１ｍｉｎ内酶促反应速度
（ｍＯＤ／ｍｉｎ）。

以对硝基苯胺标准溶液的浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标作出标准曲线。

根据标准曲线得到样品水解四肽底物生成对硝基苯胺的物质量。

活力单位定义为，３７℃条件下，１ｍｉｎ时间内１ｍＬ反应体系中，水解四肽底物生成１ｍｍｏｌ对硝基苯胺的酶活力为１Ｕ。

１．２．２．１四肽底物法的线性
以Ｔｒｉｓ－ＣａＣｌ２缓冲液配制浓度分别为７．５ｍｇ／ｍＬ、
６ｍｇ／ｍＬ、４．５ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ和１．５ｍｇ／ｍＬ的样品溶液，同法测酶促反应的速度，重复５次取平均值，以
ＳＰＳＳ１０．０对样品溶液的浓度与相应酶促反应速度的关系进行直线回归分析。

１．２．２．２四肽底物法的精密度
分别取各浓度的样品溶液测酶促反应的速度，日内和日间各重复３次，以变异系数表示测定值批次间的差异。

１．２．３纤维蛋白平板法和四肽底物法测定值的相关性
在３０ｍｇ／ｍＬ、２４ｍｇ／ｍＬ、１８ｍｇ／ｍＬ、１２ｍｇ／ｍＬ和
６ｍｇ／ｍＬ浓度梯度下，分别以纤维蛋白平板法和四肽底物法测定样品溶液的活性，以ＳＰＳＳ１０．０对测定的结果进行相关性分析。

２结果与分析２．１纤维蛋白平板法２．１．１尿激酶标准曲线
尿激酶标准溶液的活力单位与其形成透明圈面积的关系见图１。

在１０ＩＵ／ｍＬ￣１００ＩＵ／ｍＬ浓度范围内，尿激酶活力单位的对数值与透明圈面积的对数值呈线性关系，
Ｙ＝０．４０５６Ｘ－０．４７４９，Ｒ２＝０．９９０２。

图２样品溶液浓度对数值与透明圈面积对数值的线性关系
Ｆｉｇ．２Ｔｈｅｌｉｎｅａｒｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｌｏｇａｒｉｔｈｍｖａｌｕｅｏｆｓａｍｐｌｅ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄｌｙｔｉｃｃｉｒｃｌｅａｒｅａ
图３对硝基苯胺溶液吸光值的标准曲线
Ｆｉｇ．３Ｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅｓｏｆｐ－ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｎｅａｂｓｏｒｂｅｎｃｙ
图４
样品溶液浓度与反应速度的关系
Ｆｉｇ．４Ｔｈｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｏｆｓａｍｐｌｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄ
ｒｅａｃｔｉｏｎｖｅｌｏｃｉｔｙ
２．１．２纤维蛋白平板法的线性
以样品溶液浓度的对数值与透明圈面积的对数值作图，发现样品溶液不同浓度的对数值与相应透明圈面积的对数值呈线性关系，Ｙ＝０．５１１２Ｘ－０．４４２３，
Ｒ２＝０．９９０２。

以ＳＰＳＳ１０．０进行直线回归分析可见：显著性概率小于１％，二者之间有极显著的直线回归关系，见表１。

２．１．３纤维蛋白平板法的精密度
各浓度的样品溶液在日内和日间分别重复３次测定，其结果见表２。

由表２可见，在日间和日内各进行３次实验其变异系数均小于１０％，显示该方法具有较高的精密度，符合生物样品的测定要求。

在测定浓度范围内，随着样品溶液活性的升高变异系数明显降低。

在日间和日内进行测定具有相似变异系数的结
果，显示该方法具有较高的精密度和批次稳定性。

该法在低浓度时变异系数较高的原因可能由于样品溶液形成的透明圈的边界比较模糊容易引起测量误差，因为低浓度的样品溶液在形成的透明圈较小，该误差对测定结果的影响也就更加明显。

因此，在以该法进行测定时，应调整样品溶液的浓度使其活性不低于１０ＩＵ／ｍＬ。

２．２四肽底物法２．２．１吸光值标准曲线
该法采用的参考物质对硝基苯胺标准溶液的浓度与其吸光值的关系见图３。

在０．０４ｍｍｏｌ／Ｌ￣２ｍｍｏｌ／Ｌ浓度范围内，对硝基苯胺标准溶液的浓度与其吸光值呈线性关系Ｙ＝１．６４６６
Ｘ＋０．０２１２，Ｒ２＝０．９９９６。

２．２．２四肽底物法的线性
以样品溶液的浓度与相应酶促反应速度作图见图４，由图４可知，样品溶液的浓度与相应酶促反应的速度呈线性关系，Ｙ＝１７．９７３Ｘ＋４４．４５，Ｒ２＝０．９８２４。

以ＳＰＳＳ１０．０进行直线回归分析可见：显著性概率小于１％，二者之间有极显著的直线回归关系，见表３。

表１
样品溶液浓度对数值与透明圈面积对数值的回归关系
Ｔａｂｌｅ１
Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｒｅｌａｔｉｏｎｏｆｓａｍｐｌｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｌｏｇａｒｉｔｈｍ
ｖａｌｕｅａｎｄｌｙｔｉｃｃｉｒｃｌｅａｒｅａ
ＳＳ０．３０２０．００３０．３０５
ｄｆ１３４
ＭＳ０．３０２０．００１
Ｆ３０３．１４１
Ｓｉｇ０
变异来源Ｓｏｕｒｃｅｏｆｖａｒｉａｔｉｏｎ回归Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ残差Ｒｅｓｉｄｕａｌ
总变异Ｔｏｔａｌｖａｒｉａｔｉｏｎ
日内Ｗｉｔｈｉｎ－ｄａｙ日间Ｄａｙ－ｔｏ－ｄａｙ透明圈面积平均值／ｃｍ２
Ｍｅａｎｏｆｌｙｔｉｃｃｉｒｃｌｅａｒｅａ／ｃｍ２
０．８６１．３１１．６１１．８３２．００
变异系数／％
ＣＶ／％６．２８２．１８２．３８１．９３１．２０透明圈面积平均值／ｃｍ２
Ｍｅａｎｏｆｌｙｔｉｃｃｉｒｃｌｅａｒｅａ／ｃｍ２
０．８７１．３５１．６５１．８４１．９８
变异系数／％
ＣＶ／％６．４１３．４６２．３９１．４１１．７０
表２
纤维蛋白平板法的精密度分析结果
Ｔａｂｌｅ２Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎｔｅｓｔｒｅｓｕｌｔｓｏｆｆｉｂｒｉｎｐｌａｔｅｍｅｔｈｏｄ
样品溶液浓度／（ｍｇ／ｍＬ）
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ／（ｍｇ／ｍＬ）
６．００１２．００１８．００２４．００３０．００
日内Ｗｉｔｈｉｎ－ｄａｙ
日间Ｄａｙ－ｔｏ－ｄａｙ
ｄｆ１３４
变异来源Ｓｏｕｒｃｅｏｆｖａｒｉａｔｉｏｎ回归Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ残差Ｒｅｓｉｄｕａｌ总变异ＴｏｔａｌｖａｒｉａｔｉｏｎＳＳ７２９０．０００１３８．８００７４２８．８００ＭＳ７２９０．０００４６．２６７Ｆ１５７．５６５Ｓｉｇ．０．００１表３
样品稀释度与酶促反应速度的回归关系
Ｔａｂｌｅ３Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｒｅｌａｔｉｏｎｏｆｓａｍｐｌｅｄｉｌｕｔｉｏｎａｎｄｅｎｚｙｍｅ
ｒｅａｃｔｉｏｎｖｅｌｏｃｉｔｙ２．２．３四肽底物法的精密度
各浓度的样品溶液在日内和日间分别重复３次测定，其结果如表４。

由表４可见，在日间和日内各进行３次实验其变异系数均小于１０％，显示该方法具有较高的精密度，符合生物样品的测定要求。

在测定浓度范围内，随着样品溶液活性的升高变异系数明显降低。

当样品溶液浓度较低时，酶促反应产物的变化量不能被酶标仪准确读取；当样品溶液的浓度较高时，反应体系内的底物在极短时间内被耗尽，酶促反应进入混合级，引起测定结果的误差比较明显。

在此反应体系内，适当调整样品溶液的浓度使其活性不低于０．０３Ｕ／ｍＬ。

２．３纤维蛋白平板法和四肽底物法测定值的相关性
在相同浓度梯度条件下，将四肽底物法与纤维蛋白平板法所测定的结果以ＳＰＳＳ１０．０进行相关性统计学分析，呈极显著的正相关关系（Ｒ２＝０．９９４２，Ｐ＜０．０１）。

可见四肽底物法测得的数值可以表示纳豆激酶的纤溶活性，二者之间的关系为：纤维蛋白平板法测定值（ＩＵ）＝２６４．８７×四肽底物法测定值（Ｕ）－１９．６３３。

３小结
近年纳豆激酶因具有口服溶栓作用而备受关注。

目前纳豆激酶活性的测定大多为测定其溶栓作用，如纤维蛋白平板法［２］、纤维蛋白块溶解时间法［３］等，通过参考尿激酶标准品来定出活性。

这些方法直观，但难以进行大批量样品的高通量筛选。

四肽底物法则可进行高通量筛选，且实验操作简便、快速，但因为该法并非直接测定溶栓活性，而是测定其酰胺水解活性，其测定结果是否可代表纳豆激酶的溶栓作用一直受到质疑［８］。

本研究用纤维蛋白平板法和四肽底物法分别测定了纳豆激酶样品溶液的活性，并研究了两种方法所得结果间的相关性。

结果显示，用两种不同方法测定所得的结果之间呈极显著的正相关关系（Ｒ２＝０．９９４２，Ｐ＜０．０１），因此四肽底物法完全可作为纳豆激酶活性的测定方法，二者之间的关系为：纤维蛋白平板法测定值（ＩＵ）＝２６４．８７×
四肽底物法测定值（Ｕ）－１９．６３３。

精密度实验结果显示，纤维蛋白平板法精确测定的活性范围不宜低于１０ＩＵ／ｍＬ，而四肽底物法精确测定的最低活性约相当于２．５ＩＵ／ｍＬ。

可见，四肽低物法的灵敏度要明显高于纤维蛋白平板法。

纤维蛋白平板法和四肽底物法测得的结果还表明，样品活性在分别在１０．７７ＩＵ／ｍＬ￣８０．７３ＩＵ／ｍＬ和
０．０３Ｕ／ｍＬ￣０．０９Ｕ／ｍＬ时，样品溶液浓度与活性间都具有极显著的直线回归关系，且日内与日间不同批次测定值的变异系数均小于１０％，显示两种方法均具有较高的精密度。

总之，纤维蛋白平板法直接以尿激酶活性表示其测定值，适用于纳豆激酶的活性标定；而四肽底物法虽间接反映溶栓活性，但有简便、快捷、灵敏度高等优点，更适用于纳豆激酶的快速测定及发酵工艺、分离纯化等需要高通量筛选的分析。

致谢：本课题由上海杨杨百草研究所资助。

参考文献：
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表４
四肽底物法的精密度分析结果
Ｔａｂｌｅ４Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎｔｅｓｔｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｅｔｒａ－ｐｅｐｔｉｄｅｓｕｂｓｔｒａｔｅｍｅｔｈｏｄ样品溶液
浓度／（ｍｇ／ｍＬ）
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ／（ｍｇ／ｍＬ）１．５０３．００４．５０６．００７．５０反应速度平均值／（ｍＯＤ／ｍｉｎ）Ｍｅａｎｏｆｒｅａｃｔｉｏｎｖｅｌｏｃｉｔｙ／（ｍＯＤ／ｍｉｎ）６８．４７１０２．４３１２９．５０１５１．９０１６９．５０变异系数／％ＣＶ／％９．５７４．９３６．４９２．４１０．８２反应速度平均值／（ｍＯＤ／ｍｉｎ）Ｍｅａｎｏｆｒｅａｃｔｉｏｎｖｅｌｏｃｉｔｙ／（ｍＯＤ／ｍｉｎ）
６２．３７９９．９３１３３．５０１５９．０７１７６．６３
变异
系数／％ＣＶ／％７．６２５．９９５．５７１．７２３．３９
作者简介：于见亮（１９７９－），男（汉），在读硕士研究生，主要从事肉类科学的研究。

＊通讯作者：卢士玲（１９７６－），女，博士，讲师。

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ｔｉｏｎｏｆａｓｔｒｏｎｇｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃｅｎｚｙｍｅ（Ｎａｔｔｏｋｉｎａｓｅ）ｉｎｔｈｅｖｅｇｅｔａｂｌｅｃｈｅｅｓｅＮａｔｔｏ，ａｐｏｐｕｌａｒｓｏｙｂｅａｎｆｅｒｍｅｎｔｅｄｆｏｏｄｉｎＪａｐａｎ［Ｊ］．Ｂｉｏ－ｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９３，１９７（３）：１３４０－１３４７
［８］陈志文，徐尔尼，肖美燕．纳豆激酶的研究进展［Ｊ］．食品科学，２００２，
２３（１０）：１３０－１３４
收稿日期：２００７－０６－１８
应用ＫＤＹ－９８２０凯氏定氮仪测定羊肉中
挥发性盐基氮
摘要：应用ＫＤＹ－９８２０凯氏定氮仪测定羊肉中挥发性盐基氮，通过与半微量定氮法对比及精密度实验，结果表明
ＫＤＹ－９８２０全自动定氮仪能简便、
快速、准确地测定肉中的挥发性盐基氮。

关键词：ＫＤＹ－９８２０凯氏定氮仪；挥发性盐基氮；羊肉；检测方法
ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＴＩＯＮＯＦＴＨＥＴＶＢ－ＮＯＦＭＵＴＴＯＮＢＹＫＤＹ－９８２０ＴＹＰＥＡＵＴＯＭＡＴＩＣＡＺＯＴＯＭＥＴＥＲ
ＹＵＪｉａｎ－ｌｉａｎｇ１，ＬＩＫａｉ－ｘｉｏｎｇ１，ＬＵＳｈｉ－ｌｉｎｇ１，＊，ＨＵＡＮＧＣｈａｏ２，ＰＵＪｕ－ｓｈｕａｎｇ２，ＺＥＮＧＸｉａｏ－ｈｏｎｇ２（１．ＦｏｏｄＣｏｌｌｅｇｅｏｆＳｈｉｈｅｚｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｉｈｅｚｉ８３２００３，Ｘｉｎｊｉａｎｇ，Ｃｈｉｎａ；２．ＬｕＸｉａｎｇＡｎｉｍａｌＨｕｓｂａｎｄｒｙ
ＬｉｍｉｔｅｄＬｉａｂｉｌｉｔｙＣｏｍｐａｎｙｏｆＸｉｎｊｉａｎｇ，Ｔａｃｈｅｎｇ８３４６０１，Ｘｉｎｊｉａｎｇ，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴＶＢ－ＮｏｆｍｕｔｔｏｎｗａｓａｎａｌｙｓｅｄｂｙＫＤＹ－９８２０ｔｙｐｅａｕｔｏｍａｔｉｃａｚｏｔｏｍｅｔｅｒ，ｔｈｒｏｕｇｈｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｋｊｅｌｄａｈｌａｎｄｓｔｕｄｉｅｄｔｈｅｐｒｅｃｉｓｉｏｎ，ａｃｃｕｒａｃｙａｎｄｉｎａｃｃｕｒａｃｙｏｆＫＤＹ－９８２０ｔｙｐｅａｕｔｏｍａｔｉｃａｚｏｔｏｍｅｔｅｒ．Ａｓａｒｅ－ｓｕｌｔｏｆｔｅｓｔ，ａｓｉｍｐｌｅ，ｆａｓｔａｎｄａｃｃｕｒａｔｅａｎａｌｙｓｉｓｍｅｔｈｏｄｉｓｃｏｎｆｉｒｍｅｄｆｏｒｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＴＶＢ－ＮｏｆｍｅａｔｂｙｔｈｅＫＤＹ－９８２０ｔｙｐｅａｕｔｏｍａｔｉｃａｚｏｔｏｍｅｔｅｒ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＫＤＹ－９８２０ｔｙｐｅａｕｔｏｍａｔｉｃａｚｏｔｏｍｅｔｅｒ；ＴＶＢ－Ｎ；ｍｕｔｔｏｎ；ｔｅｓｔｉｎｇｍｅｔｈｏｄ于见亮１，李开雄１，卢士玲１，＊，黄超２，蒲菊霜２，曾小红２
（１．石河子大学食品学院，新疆石河子８３２００３；２．新疆绿翔牧业有限公司，新疆塔城８３４６０１）
挥发性盐基氮（ＴＶＢ－Ｎ）能有效地反映肉的新鲜度，新鲜肉、次鲜肉、变质肉之间挥发性盐基氮的差异非常明显，并与感官变化一致，是评定肉的新鲜度变化的客观指标。

目前，通常采用半微量定氮法测定肉中的挥发性盐基氮，但该方法有操作过程繁琐、费时的缺点，其次在加样蒸馏时，碱的作用会使反应室内样液剧烈沸腾而发泡，带有氧化镁颗粒的泡沫往往会污染反应室顶部使其难以清洗。

自动定氮仪具有自动加液、蒸馏、吸收等功能，操作简单、省时快速、结果准确，被广泛应用于各类食品和饲料等的蛋白质测定，但应用在
肉中测挥发性盐基氮的报导较少，且尚无标准的测定方法。

本研究应用ＫＤＹ－９８２０凯氏定氮仪测定羊肉中挥发性盐基氮含量，对测定处理条件进行探讨，从而建立适合于批量肉样品的挥发性盐基氮测定的一种快速而准确的检测方法。

１材料与方法１．１材料与仪器
材料：羊后腿瘦肉。

主要仪器为：ＫＤＹ－９８２０凯氏定氮仪：北京通润源机电技术有限责任公司；ＡＡＲ２１４０万分之一电子天平：美国奥豪斯公司；微量滴定管。

试剂：均为分析纯。

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