蛋白质泛素化修饰的技术路线

蛋白质翻译后修饰
——蛋白泛素化修饰
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CON TENTS
01 蛋白质翻译后修饰介绍 02 蛋白质泛素化修饰 03 技术路线 04 总结展望
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蛋白质翻译后修饰介绍
蛋白质翻译后修饰（PTM）是指蛋白质在翻译中或翻译后经历的一个共价加工过程，即通过1个或几个氨基 酸残基加上修饰基团或通过蛋白质水解剪去基团而改变蛋白质的性质。
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One Gene; More proteins.
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蛋白质翻译后修饰 （PTM）是指蛋白质在 翻译中或翻译后经历的 一个共价加工过程，即 通过1个或几个氨基酸 残基加上修饰基团或通 过蛋白质水解剪去基团 而改变蛋白质的性质。
Why Post‐translational Modification Of Proteins
翻译后修饰(Posttranslational modification, PTM)是 指对翻译后的蛋白质进行共价加工 的过程。它通过在一个或多个氨基 酸残基加上修饰基团，可以改变蛋 白质的物理、化学性质，进而影响 蛋白质的空间构象和活性状态、亚 细胞定位、折叠及其稳定性以及蛋 白质-蛋白质相互作用。蛋白质翻 译后修饰的丰度变化在生命活动研 究中具有重大意义，异常的翻译后 修饰会导致多种疾病的发生。
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Types Post‐translational Modification Of Proteins
从定义的角度，可以如下理解蛋白质翻译后修饰： 1. 对某氨基酸的修饰包括共价连接简单的官能团（如乙酰基或磷酸基）和引入一些复杂结构，如脂 类和糖类。 2.将已经结束翻译的转录本产物切割成成熟的形式，如信号肽或活性肽的加工等。 3. 氨基酸的交联，如丝氨酸和酪氨酸。
可以说，蛋白质组中任一蛋白质都能在翻译时或翻译后进行修饰，不同类型的修饰都会影响蛋白质 的电荷状态、疏水性、构象和（或）稳定性，终影响其功能。
诸多实例表明蛋白质的修饰都采取一种可逆模式‐“开”或“关” 的状态进行，或者调节蛋白质的 功能，或者作为真实的分子开关。
目前已发现300多种不同的翻译后修饰，主要形式包括“磷酸化、 糖基化、乙酰化、泛素化、羧基 化、核糖基化以及二硫键的配对“等。
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Types Post‐translational Modification Of Proteins
phosphorylation
Methylation Sulfation
Acetylation Amidation
Hydroxylation
PTMs
Sumoylation
Nitration
Formylation
Palmitoylation
Glycosylation
ubiquitination
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Ubiquitination
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蛋白质泛素化修饰
一直以来, 人们都忽视了蛋白质水解酶参与的细胞功能的调控。泛素和与其相关的蛋白水解酶的发现, 给整 个科学界带来了巨大的影响。
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Ubiquitination
泛素 泛素广泛存在于真核生物中，是由76个氨基酸组成的多肽，高度保守。（不容易发生突变，它在不
同的物种中的序列是高度一致的，因为如果这些序列发生突变的话，功能就会受到影响，生命体就不能 存活或者被自然选择就淘汰掉了，所以它在生物的进化过程中是很稳定的。比如人类和酵母的泛素只存 在三个残基的区别。）
泛素化 泛素化修饰是指泛素分子在一系列特殊的酶作用下，将细胞内的蛋白质分类，从中选出靶蛋白分子， 并对靶蛋白进行特异性修饰的过程。这些特殊的酶包括泛素激活酶，结合酶、连结酶和降解酶等。泛素 化在蛋白质的定位、代谢、功能、调节和降解中都起着十分重要的作用。同时，它也参与了细胞周期、 增殖、凋亡、分化、转移、基因表达、转录调节、信号传递、损伤修复、炎症免疫等几乎一切生命活动 的调控。泛素化与肿瘤、心血管等疾病的发病密切相关。因此，作为近年来生物化学研究的一个重大成 果，它已然成为研究、开发新药物的新靶点。
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Ubiquitination
首先在ATP(红色所示)供能的情况下酶E1(蛋白质编号1r4n)粘 附在泛素分子尾部(淡黄色所示)的Cys残基上(绿色所示,注意在这 个结构中,Cys突变为Ala)激活泛素,接着,E1将激活的泛素分子转移 到E2酶上(蛋白质编号1fxt),随后,E2酶和一些种类不同的E3酶共同 识别靶蛋白,对其进行泛素化修饰。根据E3与靶蛋白的相对比例可 以将靶蛋白单泛素化修饰和多聚泛素化修饰。E3酶(蛋白质编号 1ldk和1fqv)的外形就像一个夹子,靶蛋白连接在中间的空隙内(星 号所示)。酶的左侧结构域决定靶蛋白的特异性识别,右侧结构域定 位E2酶以转移泛素分子。蛋白质泛素化的结果是使得被标记的蛋白 质被蛋白酶分解为较小的多肽、氨基酸以及可以重复使用的泛素。
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Ubiquitination
The function of Ubiquitination
泛素化可以生产出单泛素化或多泛素化蛋白质。后者在当7个赖氨酸残基的泛素与另一 个泛素的甘氨酸C端连接形成。这种泛素分子链接在生物过程中起到重要的作用。共价结合 泛素的蛋白质能被蛋白酶识别并降解，这是细胞内短寿命蛋白质和一些异常蛋白降解的普遍 途径。泛素化及类泛素化蛋白在细胞分裂，自噬，DNA修复，免疫应答，细胞消亡等方面同 样起到关键作用。与消化道内进行的蛋白质水解不同，从泛素与蛋白的结合到将蛋白水解成 小的肽段，整个水解过程需要能量参与。人们开始意识到泛素-蛋白酶系统是一个对于真核 细胞非常重要的调节系统。
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技术路线
泛素化修饰是一种重要的翻译后修饰。泛素-蛋白酶体系统介导了真核生物体内80%~85%的蛋白质降解。此 外，泛素化修饰还可以直接影响蛋白质的活性和定位，调控包括细胞周期、细胞凋亡、转录调控、DNA 损伤修复 以及免疫应答等在内的多种细胞活动。
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泛素化实验方案
利用可以纯化泛素化底物的抗体（PTM-1101）富 集并利用高通量质谱检测，该方案具有高灵敏度及高特 异性。
His-tagged ubiquitin: 该方案具有高特异性，但在有些生
物样本中面临挑战，如动物组织及临床 样本。因为泛素化发生在个体分子中不 同位点不同水平上，往往会导致富集出 的蛋白在酶解后产生大量非修饰肽段影 响结果鉴定。
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泛素化研究挑战和解决方案
挑战
运用质谱检测泛素化会发生很多假阳性结果，所以在实验中需要非常小心的验证。虽然泛素化质量偏移 114.043 Da在质谱中可以精确检测出，但是还有其他的一些情况也会导致114Da的质量偏移结果干扰鉴定结 果。具体状况如下。 ①天冬酰胺但单同位素残基质量分数为114.043Da； ②在蛋白酶解过程中普遍运用碘乙酰胺（IAM）对肽段进行碘乙酰化反应，而此时半胱氨酸及赖氨酸（有时） 上会发生碘乙酰化修饰增加57.021Da分子量； ③其他氨基酸影响，亮氨酸与异亮氨酸单同位素质量分数为113.084Da以及他们m+1同位素质量分数为114 Da。
解决方案
①改变烷基化试剂或者调整烷基化孵化温度； ②设置更高的质量准确度阈值及手动或软件验证的单一同位素质量。
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泛素化（http://www.abace-biology.com/Ubiquitin.htm）技术流程
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总结与讨论
泛素化同时参与了细胞周期、增殖、凋亡、分化、转移、基因表达、转录调节、信号传递、损伤修复、炎 症免疫等几乎一切生命活动的调控。泛素化与肿瘤、心血管等疾病的发病密切相关。因此，作为近年来生物化学 研究的一个重大成果，它已然成为研究、开发新药物的新靶点。
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总结
泛素化同时参与了细胞周期、增殖、凋亡、分化、转移、 基因表达、转录调节、信号传递、损伤修复、炎症免疫等几乎 一切生命活动的调控。泛素化与肿瘤、心血管等疾病的发病密 切相关。因此，作为近年来生物化学研究的一个重大成果，它 已然成为研究、开发新药物的新靶点。
在体内，各种翻译后修饰过程不是孤立存在的．在很多 细胞活动中，需要各种翻译后修饰的蛋白共同作用。对于同一 个蛋白可以拥有一种以上的后修饰过程．各种翻译后修饰形式 相互影响、相互协调。
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感谢聆听， 敬请点评、指正！
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