第九章原生质体育种优秀课件

2．原生质体的鉴别 （1）低渗爆破法： （2）荧光染色法：0.05%-0.1%的荧光增白剂（VBL） 3．原生质体的收集和纯化 （1）过滤法：使用砂芯漏斗。 （2）密度梯度离心法： （3）界面法： （4）漂浮法：
4．原生质体的活力鉴定
（1）荧光素双醋酸盐（FDA）染色法 （2）酚藏花红染色法（0.01%染料染色，活红，死白） （3）伊文思篮染色法 （0.25%伊文思篮，活无色，死蓝色）
5．原生质体的保存
（1）立即进行融合或其它方式育种 （2） 5％的二甲亚砜或甘油等其他保护剂；液氮。
（1）培养基组成 （2）菌体培养方式：丝状菌常用平板玻璃纸法，细菌
和酵母菌多用振Hale Waihona Puke Baidu沉没培养法。 （3）菌体菌龄：丝状真菌以年轻的菌丝用来分离原生
质体最佳。尤其是菌丝体尖端细胞。认为对数期的前 期和对数期效果最好。
酵母菌制备原生质体时，要使菌体同步化，才能大幅度地提高
制备率；放线菌制备原生质体，以对数期到静止期的转换期比较理想 ，不仅制备量多，而且细胞壁再生能力也比较强；细菌适合在对数期 分离原生质体
原生质体诱变周期一般比常规诱变育种要长，难度更 大。
（二）原生质体诱变育种实例
1．扩展青霉原生质体制备 2、原生质体再生 3、原生质体诱变 4、突变株筛选
三、微生物原生质体转化育种
整条DNA或DNA片段的转化
四、微生物原生质融合育种
五、其他微生物原生质体育种
第二节 微生物原生质体融合育种
用水解酶除去遗传物质转移的最大障碍—细胞壁，制 成由原生质膜包被的裸细胞，然后用物理、化学或生物学 方法，诱导遗传特性不同的两亲本原生质体融合，经染色 体交换、重组而达到杂交的目的，经筛选获得具有双亲优
（4）稳定剂：高渗溶液；无机盐对丝状真菌效果较好，而糖和糖醇 对酵母更为合适，细菌多使用蔗糖或NaCl （5）酶解前的预处理：SH-化合物（如巯基乙醇）广泛应用于酵母和 某些丝状真菌中 （6）酶系和酶的浓度：真菌-0.5％蜗牛酶和0.5%纤维素酶 （7）酶的作用温度和作用pH值及作用时间：通常细菌水解细胞壁的 温度在 35℃左右。一般放线菌的温度在 30～32℃。霉菌一般在 pH5.4-6.5，放线菌在pH6.5-7.0。作用时间也是影响原生体生成的重 要因素。 （8）菌体密度： （9）酶解方式：酶解时保持较好的通气条件和适当振荡可促进原生 质体释放和分离。
原生质体融合育种五大步骤：
直接亲本及其遗传标记选择； 双亲本原生质体制备与再生； 亲本原生质体诱导融合； 融合重组体（称为融合子）分离； 遗传特性分析与测定；
①超声波处理菌体释放原
一、直接亲本及其遗传标生记质的体 选择
②酶解脱壁释放原生质体
一般把诱变系谱中筛选获得的不同正突变株作为 直接亲本
直接亲本都带有遗传标记
第九章原生质体育种
• 原生质体育种 • 微生物原生质体融合育种 • 细菌原生质体融合育种 • 放线菌原生质体融合育种 • 酵母菌原生质体融合育种 • 霉菌原生质体融合育种
第一节 原生质体育种
什么是原生质体？
原生质体具有的新特性： 1、对诱变剂敏感 2、对噬菌体不敏感 3、不受感受态影响
包括：原生质体再生育种，原生质体诱变育种，原 生质体转化育种，原生质体融合育种及其他原生质 体育种。
良性状于一体的稳定融合子。
聚乙二醇诱导和电融和 聚乙二醇种内融合率可高达27%，种间的融合率也 可达10%，比常规的杂交重组频率提高千倍以上。电场诱 导融合又将融合率提高10倍。
原生质体融合育种的特点
1、杂交率高 2、受接合型或致育型的限制小 3、遗传物质传递更为完整 4、存在着两株以上亲株同时参与融合形成融合子的可能 5、有可能采用产量性状较高的菌株作融合亲株 6、提高菌株产量的潜力较大 7、有助于建立工业微生物转化体系
几丁质酶 Chitinase 商品酶
Novozyme234来自 Trichoderma harzianum Lywallzyme 广东微生物研究所溶壁酶 Glucuronidase 葡聚糖苷酸酶 (for yeast)
原生质体的好坏与培养基成分、培养条件，菌龄和预处 理等因素有关。 1、 酶法分离原生质体的影响因素
2．化学诱变剂诱变原生质体的一般程序
通常操作程序包括：出发菌株培养和原生质体制备及 再生→选择合适的化学诱变剂，配制成合适的浓度→加入 原生质体悬浮液，混合（含有高渗溶液，稳定原生质体） →诱变处理→离心弃诱变剂、原生质体沉淀用稳定液洗涤 →稀释、分离到再生平板上（双层平板法）→再生培养→ 观察、筛选突变株→复筛→突变株鉴定。
2．原生质体再生育种实例 小单孢菌福堤霉素
敏感，细胞壁的重建
和分裂能力的再生， 对数期细胞，不需要
遗传标记
二、微生物原生质体诱变育种
（一）原生质体诱变育种方法
1是．以物微理生诱物变原剂生质诱体变为原育生种质材体料，的采一用般物程理序或：化学诱变
剂中，处筛无理选菌，高取水然产1洗后突0 涤分变ml→离菌对离到株数心再。生，生长菌培期体养微沉基生淀中物物再培用生养酶，物液并，悬从离浮再心，生收水菌集解落菌去体壁 制成原生质体→离心，高渗溶液洗涤原生质体→原生质体 悬浮液稀释至一定密度，取适量放入无菌培养皿内→将培 养皿移至紫外灯下诱变处理→置暗处后处理一定时间→移 入再生培养基中再生培养（由于原生质体较脆弱，用双层 平板法再生）→分离优质菌株→突变株稳定性试验→突变 株鉴定。
一、微生物原生质体再生育种 1．原生质体再生育种的一般程序 ：
微生物制备原 生质体后直接 再生，从再生 菌落中分离筛 选变异菌株， 最终得到优良 性状提高的正
突变株。
出发菌株的选择→菌种活化和预培养→原生质体 制备→原生质体再生→高产菌株分离（初筛） →复筛→遗传稳定性鉴定→菌种特性及发酵特 性研究。
二、原生质体制备与再生
（一）原生质体制备
最有效和最常用的是酶法。
处理细菌细胞壁用酶 处理放线菌细胞壁用酶
溶菌酶Lysozyme Lytic Enzyme裂解酶、
Lysozyme溶菌酶
原生质体的分离
制
收集
备
纯化
流
活性鉴定
程
保存
处理真菌用酶
纤维素酶 Cellulase 酵母裂解酶 Zymolyase β-1,3葡聚糖酶