基因诊断ppt课件
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合成原料：dNTP
(Polymerase Chain
反应过程：
（20-35个循环）
引物：一对
变性：95℃ 10-45s
高温DNA聚合酶： Taq
酶
退火：55-643;
H2O
精品课件
延伸: 72 ℃ 30-60s 23
3’ 5 ‘
3’ 5’
3’ 5’
5’ 3’
5’ 3’
• 外源基因的入侵
（感染性疾病）
精品课件
5
基因诊断的定义与特点
• 定义：
利用分子生物学技术，从DNA/RNA水 平检测基因的存在、分析基因的结构变异 和表达状态，从而对疾病作出诊断。
精品课件
6
• 特点：
1.直接检测导致疾病发生的基因改变，特异性强
2.应用PCR等信号放大技术，灵敏度高，需样品量少
硝酸纤维素膜（NC膜） 尼龙膜 PVDF膜等
(1) DNA印渍技术：
Southern Blotting
(2) RNA印渍技术：
Northern Blotting
(3) 蛋白质印渍技术：
Western Blotting
精品课件
13
探针的制备 样品的制备 电泳分离
预杂交 杂交
封闭样品中非特异性的结合位点 鲑精DNA、脱脂奶粉
转膜 杂交 结果检测
➢种类：DNA, RNA, 寡核苷酸 ➢标记物：
放射性核素，生物素，地高辛，荧 光素 ➢制备方法:
(1)化学法 (2) 酶促法： 精品课件末端标记；切口平移法；随10机引 物法
探针的制备
样品的制备
电泳分离 转膜 杂交
组织中提取：
基因组DNA/限杂交（in situ
hybridization）
• 菌落原位杂交用于基因克隆和基因的筛选• 组织细胞原位杂交
确定特定核酸序列在染色体上的定位； 组织 细胞中特定基因的表达水平（即相应mRNA的水平）
精品课件
18
等位基因特异的寡核苷酸探针杂交
（allele specific oligonucleotide hybridization, ASOH）
5’ 3’
3’ 5’
核酸印迹杂交：Southern blot, Northern blot
斑点印迹杂交（Dot blot）
原位杂交（in situ hybridization）
精品课件
基因芯片（gene chip）
9
探针的制备 样品的制备 电泳分离
探针（probe）——用放射性核素或其他标
记物标记的短的核酸片段（几十至几百核苷 酸），它具有特定的序列，能够与待测的核 酸片段互补结合，因此可以用以检测核酸样 品中的特定DNA或RNA。
确定得了什么病
精品课件
8
第一层次：基因诊断的基本方法 （用什么技术去诊断）
一、核酸分子杂交
原理：核酸的变性复性理论。
双链的核酸分子在某些理化因素（如高 温等）作用下，双链解开，待条件恢复时，又按 碱基互补配对规律形成双链结构。在这一过程中， 不同来源的DNA（RNA）分子，只要具有部分互补 配对的碱基序列，即可形成杂合双链。
正常 突变 突变 杂合子 纯合子
精品课件
20
基因芯片
(gene chip, gene microarray)
•生物芯片
DNA芯片、蛋白质芯片、组织芯片
•基因芯片技术 (一种高通量的固相核酸杂交技
术)
将大量预先合成的DNA探针以显微打印的方式有
序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，
通过对杂交信号的检测分析，可得出样品的遗传信
3.可以检测患病者，和致病基因携带者
4.在疾病尚无临床症状时作出早期诊断
5.检测样品获取方便，不受组织或时相限制
6.检测对象可以是自体基因或外源基因，适用于多种疾病的诊断
精品课件
7
基因诊断的三个层次
• 基因诊断的基本方法
用什么技术去诊断
• 基因诊断的目标
检测遗传物质发生了什么变化
• 基因诊断的结论
息（基因序列和表达信息）。由于常用计算机硅芯
片作为固相支持物，故名基因芯片。
精品课件
21
应用基因芯片筛选差异表达基因
Cy3标记病变细胞cDNA 叠加分析
Cy5标精记品正课件常细胞cDNA
两图22
第一层次：基因诊断的基本方法
（用什么技术去诊断）
二. 聚合酶链式反应
Reaction) 组分：
DNA模板
基因诊 断
Gene Diagnosis
精品课件
1
实验室诊断技术
• 第一类实验室诊断技术
以细胞学检查为主，根据疾病所导致的细胞形态 或/和数量的改变提供诊断依据
• 第二类实验室诊断技术
通过分析代谢产物和酶的活性变化为诊断提供信 息
• 第三类实验室诊断技术
以免疫学检查技术为主，通过识别特定蛋白质分子 的差异为诊断提供依据
将探针溶于杂交缓冲液 膜浸于其中进行杂交
转膜 杂交 结果检测
洗膜
缓冲液洗涤去除未杂交探针
精品课件
14
探针的制备 样品的制备 电泳分离
转膜 杂交 结果检测
同位素
放射自显影
荧光、化学发光 压X光片
生物素
酶标亲和素—底物显色
地高辛
酶标抗体—底物显色
精品课件
15
精品课件
16
点杂交（dot blot）
将RNA或DNA变性后直接点样于膜上， 再采用特定的探针进行杂交。
如果基因的某一位点发生了突变，那么 根据已知基因突变位点的核苷酸序列，设计 并合成两种寡核苷酸探针，一种与突变基因 的碱基序列互补（M） ，另一种与正常基因 在相应位点上的核苷酸序列互补（N），通过
杂交即可确定待检的2个等位基因是否有一个 或全部发生了突变。
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19
M
杂交
N
M
N
正常 突变 突变 杂合子 纯合子
核酸混合物
结果检测
精品课件
11
探针的制备 样品的制备 电泳分离
转膜 杂交 结果检测
待测样品按照分子量大小分离 分子量marker
DNA
琼脂糖凝胶电泳
RNA、蛋白质等
聚丙烯酰胺凝胶电泳
精品课件
12
探针的制备 样品的制备 电泳分离
转膜 杂交 结果检测
印渍技术：
将存在于凝胶中的生物大分子转移到 固定化介质上并加以分析的技术。用于 DNA、RNA、蛋白质的检测。
基因诊精品断课件 技术
2
1978年，美国科学院院士美籍华裔科 学家Kan（简悦威 ）和Dozy应用液相DNA分子 杂交成功地进行了镰形细胞贫血症的基因诊 断，标志着检验诊断进入基因诊断时代。
精品课件
3
Southern吸附法
精品课件
4
基因致病
• 内源基因的变异
人自身基因的结构或表达异常导致多种疾病 （遗传性疾病、肿瘤、心血管病、糖尿病等）
(Polymerase Chain
反应过程：
（20-35个循环）
引物：一对
变性：95℃ 10-45s
高温DNA聚合酶： Taq
酶
退火：55-643;
H2O
精品课件
延伸: 72 ℃ 30-60s 23
3’ 5 ‘
3’ 5’
3’ 5’
5’ 3’
5’ 3’
• 外源基因的入侵
（感染性疾病）
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5
基因诊断的定义与特点
• 定义：
利用分子生物学技术，从DNA/RNA水 平检测基因的存在、分析基因的结构变异 和表达状态，从而对疾病作出诊断。
精品课件
6
• 特点：
1.直接检测导致疾病发生的基因改变，特异性强
2.应用PCR等信号放大技术，灵敏度高，需样品量少
硝酸纤维素膜（NC膜） 尼龙膜 PVDF膜等
(1) DNA印渍技术：
Southern Blotting
(2) RNA印渍技术：
Northern Blotting
(3) 蛋白质印渍技术：
Western Blotting
精品课件
13
探针的制备 样品的制备 电泳分离
预杂交 杂交
封闭样品中非特异性的结合位点 鲑精DNA、脱脂奶粉
转膜 杂交 结果检测
➢种类：DNA, RNA, 寡核苷酸 ➢标记物：
放射性核素，生物素，地高辛，荧 光素 ➢制备方法:
(1)化学法 (2) 酶促法： 精品课件末端标记；切口平移法；随10机引 物法
探针的制备
样品的制备
电泳分离 转膜 杂交
组织中提取：
基因组DNA/限杂交（in situ
hybridization）
• 菌落原位杂交用于基因克隆和基因的筛选• 组织细胞原位杂交
确定特定核酸序列在染色体上的定位； 组织 细胞中特定基因的表达水平（即相应mRNA的水平）
精品课件
18
等位基因特异的寡核苷酸探针杂交
（allele specific oligonucleotide hybridization, ASOH）
5’ 3’
3’ 5’
核酸印迹杂交：Southern blot, Northern blot
斑点印迹杂交（Dot blot）
原位杂交（in situ hybridization）
精品课件
基因芯片（gene chip）
9
探针的制备 样品的制备 电泳分离
探针（probe）——用放射性核素或其他标
记物标记的短的核酸片段（几十至几百核苷 酸），它具有特定的序列，能够与待测的核 酸片段互补结合，因此可以用以检测核酸样 品中的特定DNA或RNA。
确定得了什么病
精品课件
8
第一层次：基因诊断的基本方法 （用什么技术去诊断）
一、核酸分子杂交
原理：核酸的变性复性理论。
双链的核酸分子在某些理化因素（如高 温等）作用下，双链解开，待条件恢复时，又按 碱基互补配对规律形成双链结构。在这一过程中， 不同来源的DNA（RNA）分子，只要具有部分互补 配对的碱基序列，即可形成杂合双链。
正常 突变 突变 杂合子 纯合子
精品课件
20
基因芯片
(gene chip, gene microarray)
•生物芯片
DNA芯片、蛋白质芯片、组织芯片
•基因芯片技术 (一种高通量的固相核酸杂交技
术)
将大量预先合成的DNA探针以显微打印的方式有
序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，
通过对杂交信号的检测分析，可得出样品的遗传信
3.可以检测患病者，和致病基因携带者
4.在疾病尚无临床症状时作出早期诊断
5.检测样品获取方便，不受组织或时相限制
6.检测对象可以是自体基因或外源基因，适用于多种疾病的诊断
精品课件
7
基因诊断的三个层次
• 基因诊断的基本方法
用什么技术去诊断
• 基因诊断的目标
检测遗传物质发生了什么变化
• 基因诊断的结论
息（基因序列和表达信息）。由于常用计算机硅芯
片作为固相支持物，故名基因芯片。
精品课件
21
应用基因芯片筛选差异表达基因
Cy3标记病变细胞cDNA 叠加分析
Cy5标精记品正课件常细胞cDNA
两图22
第一层次：基因诊断的基本方法
（用什么技术去诊断）
二. 聚合酶链式反应
Reaction) 组分：
DNA模板
基因诊 断
Gene Diagnosis
精品课件
1
实验室诊断技术
• 第一类实验室诊断技术
以细胞学检查为主，根据疾病所导致的细胞形态 或/和数量的改变提供诊断依据
• 第二类实验室诊断技术
通过分析代谢产物和酶的活性变化为诊断提供信 息
• 第三类实验室诊断技术
以免疫学检查技术为主，通过识别特定蛋白质分子 的差异为诊断提供依据
将探针溶于杂交缓冲液 膜浸于其中进行杂交
转膜 杂交 结果检测
洗膜
缓冲液洗涤去除未杂交探针
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14
探针的制备 样品的制备 电泳分离
转膜 杂交 结果检测
同位素
放射自显影
荧光、化学发光 压X光片
生物素
酶标亲和素—底物显色
地高辛
酶标抗体—底物显色
精品课件
15
精品课件
16
点杂交（dot blot）
将RNA或DNA变性后直接点样于膜上， 再采用特定的探针进行杂交。
如果基因的某一位点发生了突变，那么 根据已知基因突变位点的核苷酸序列，设计 并合成两种寡核苷酸探针，一种与突变基因 的碱基序列互补（M） ，另一种与正常基因 在相应位点上的核苷酸序列互补（N），通过
杂交即可确定待检的2个等位基因是否有一个 或全部发生了突变。
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19
M
杂交
N
M
N
正常 突变 突变 杂合子 纯合子
核酸混合物
结果检测
精品课件
11
探针的制备 样品的制备 电泳分离
转膜 杂交 结果检测
待测样品按照分子量大小分离 分子量marker
DNA
琼脂糖凝胶电泳
RNA、蛋白质等
聚丙烯酰胺凝胶电泳
精品课件
12
探针的制备 样品的制备 电泳分离
转膜 杂交 结果检测
印渍技术：
将存在于凝胶中的生物大分子转移到 固定化介质上并加以分析的技术。用于 DNA、RNA、蛋白质的检测。
基因诊精品断课件 技术
2
1978年，美国科学院院士美籍华裔科 学家Kan（简悦威 ）和Dozy应用液相DNA分子 杂交成功地进行了镰形细胞贫血症的基因诊 断，标志着检验诊断进入基因诊断时代。
精品课件
3
Southern吸附法
精品课件
4
基因致病
• 内源基因的变异
人自身基因的结构或表达异常导致多种疾病 （遗传性疾病、肿瘤、心血管病、糖尿病等）