斑马鱼在药物早期毒性筛选中的应用进展_常嘉

1500 中国新药杂志 2013 年第 22 卷第 13 期
因信号和反映与人类相似。斑马鱼在遗传、生理和 药理反应方面与人类存在高度的相似性，其具有与 哺乳动物相似的心血管、造血、神经及代谢等系统， 更重要的是，之前对斑马鱼的基因或者化学筛选已 经证明，斑马鱼可以高度代表包括人类在内的其他 生物体。在斑马鱼器官生成筛选中所鉴定的基因在 小鼠和人类中同样得到证实。野生型的斑马鱼胚胎 暴露于一系列小分子化合物下，与人类的毒性反应 具有高度的相关性［3］。 1． 2 胚胎透明，体外发育，卵黄摄食，易于进行胚胎 畸形性评价 胚胎的透明性使研究者可以清楚地看 到各个发育阶段，方便进行突变的筛选和已知毒理 学终点的评价。斑马鱼幼鱼透明，可在显微镜下观 测到心跳的节律变化、血液流动，避免实验动物经过 剖杀的方法来观察体内的生理变化，可以更直观地 观察到活体动物体内的生理变化。胚胎可以从自身 的卵黄囊中获取营养物质，所以在受精后 9 d 内不 需要喂食，简化了实验操作［4］。同时方便进行转基 因操作，例如植入绿色荧光蛋白（ GFP） ，实现动态实 时监测。 1． 3 胚胎和幼鱼体态小，繁殖能力强，便于进行高 通量筛选 斑马鱼的胚胎很小，每次测定只需要很 少量的样品，而且可置于 96 或 384 孔板单孔内进 行同步试验，且每孔只需要 100 μL 水，方便实现自 动化。斑马鱼每次可以产卵 300 ～ 600 枚，一般受精 后 24 h 开始血液循环，受精后 48 ～ 72 h 开始孵化， 受精后 3 ～ 4 d 主要器官就已形成，3 ～ 4 个月后达到 性成熟［5］，从而提高了筛选的效率。 1． 4 作为有机整体生命体，可以更好的模拟人体发 育代谢过程 体外替代毒性实验，同样可以实现高 通量筛选，但由于其不能反映体内细胞的自然环境， 使得实验结果的可信度受到影响。体内哺乳动物实 验避免了这一缺陷，但会带来财力、物力以及动物福 利等方面的问题。相比之下，斑马鱼作为一个完整 的生物有机体，能够提供相对准确的毒理信息，起到 了有效的连接作用。 ２ 斑马鱼在药物早期毒性筛选中的应用
［Abstract］ Zebrafish，as an ideal model organism，was applied to the evaluation of the environmental toxicity in the last century and well recognized by the world． However，its application in drug toxicology study was relatively behind． In recent years，with the in-depth studies of zebrafish as well as the advantage of zebrafish itself，it has got more attention of drug toxicologists． The advantages and shortcomings of using zebrafish in early drug screening and the development in recent years are reviewed in this paper．
Chinese Journal of New Drugs 2013，22（ 13）
·重大新药创制专项巡礼·
斑马鱼在药物早期毒性筛选中的应用进展
常 嘉1 ，陆 亮1 ，王庆利2 ，常 艳1 ，马 璟1 （ 1 中国医药工业研究总院 国家上海新药安全评价研究中心，上海 201203；
2 国家食品药品监督管理局药品审评中心，北京 100038）
验方法也得到不断的验证和优化。 2． 1 胚胎发育毒性筛选 相对其他系统或靶器官 毒性的评价来说，用斑马鱼来评价药物的胚胎发育 毒性，已经比较成熟。欧洲实验替代方法研究中心 （ ECVAM） 认证的发育毒性替代试验： 小鼠胚胎干细 胞试验（ EST） 、哺乳动物微团试验（ MM） 、大鼠全胚 胎培养试验（ WEC） ［6］。但相比在体的、完整发育过 程的生物体，完全体外的试验可观测到的毒理学终 点十分有限，且不能覆盖胚胎发育的全过程。与此 同时，MM 试验和 WEC 试验仍然需要完整的哺乳动 物进行解剖实验，不能很好体现 3Ｒ 原则。Esther 等 用 6 种已知发育毒性的三唑类化合物分别对 WEC， EST，ZET（ 斑马鱼胚胎毒性试验） 进行了实验数据 比较，结果表明，ZET 与体内发育毒性实验的数据一 致性最好。Brannen 等［7］使用 31 种不同程度的致 畸药物对斑马鱼胚胎致畸试验进行验证，87% 与哺 乳动物体内试验一致，只出现两例假阳性、两例假阴 性。Selderslaghs 等［8］对 27 种在体外替代试验中用 于 验 证 的 化 合 物 进 行 试 验，通 过 药 效 曲 线 得 出 EC50，LC50，TI （ 致 畸 指 数） ，结 果 显 示，灵 敏 度 为 72% 、特异性为 100% 。对斑马鱼胚胎发育毒性的 验证还需要大量的试验，同时对于实验过程中遇到 的问题（ 例如胚胎对药物的吸收程度，药物在斑马 鱼体内的代谢与人类不同等） 也丞待解决。目前在 国外，已经不再单纯利用斑马鱼去评价药物的毒性 或致畸性，而是在此基础上对各种实验条件不断进 行优化完善，旨在保护动物福利的同时，使试验数据 更加准确且外推到人也同样适用。Mattson 等［9］以 抗寄生虫药阿苯达唑（ ABZ） 为受试药物，加入有氨 基丁三醇缓冲液和 NADPH 组成的代谢活 化 系 统 （ MAS） ，在 3 个不同的时间窗（ 2 ～ 3，12 ～ 14，24 ～ 48 h） 观察，结果显示，MAS 经过代谢失活后，降低了 ABZ 的毒性，说明这一经过修饰的斑马鱼胚胎毒性 试验可用于评价药物在不同发育阶段所产生的代谢 产物。 2． 2 心脏毒性筛选 新药的心血管毒性，是药物研 发过程中必须考虑的一个重要大问题，也是新药研 发失败和药物撤市的主要因素之一。QT 间期延长， 引起尖端性扭转型心动过速（ TdP） 以及致死性心率 失常，严 重 危 急 公 众 的 健 康 及 用 药 安 全。而 引 起 TdP 的首要原因则为 hEＲG 通道的抑制。因此，ICH 有一个特殊的指导原则（ S7B） ： ［10］ 人用药物延迟心 室复极化（ QT 间期延长） 潜在作用的非临床评价。
斑马鱼模型应用与药物毒性筛选试验，可进行 致畸性、心脏毒性、肝脏毒性、神经毒性等靶器官的 评价。通常是通过养鱼用水或 DMSO 将药物溶解， 渗透给药，在不同的时间窗内进行表型及行为学观 察，最后通过数据分析完成评价过程。斑马鱼模型， 随着研究的不断深入，在应用领域扩展的同时，其试
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认识不断更新，早期毒性筛选越来越受重视。药物 毒理学从单一式逐渐向全程式过度，斑马鱼模式涵 盖的毒理学终点广； 试验方法敏感性高； 使用的样品 量少； 试验周期短； 试剂及仪器费用低； 有效降低新 药研发的费用，加快研发进程等一系列优势得到药 学及毒理学家的亲睐，应用到新药筛选与安全评价 中来。虽然斑马鱼模型试验还需要很长时间的验证 和优化，但它可以在体外细胞或组织培养模型和体 内动物模型之间起到很好的连接作用，从而优化实 验结果。 1 斑马鱼应用于早期毒性筛选的优势 1． 1 与人类基因相似度高 种属差异性会对实验 结果的外推产生影响，而斑马鱼作为脊椎动物，与人 类基因的相似度高达 87%［2］，且胚胎发育早期的基
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此指导原则要求，任何新药在临床试验前都要做一 项体外试验来评价药物对细胞株中表达的 hEＲG 通 道的影响，以及一项体内试验来检测其是否引起 QT 间期延长。然而，这一指导原则存在一个很大的缺 陷就是不能检测其他机制引起的药物心脏毒性反 应，例如： 钠通道阻滞，钾通道激活等［11］。体外心血 管毒性试验的准确性差，传统的实验动物体内心血 管毒性评价模型操作繁琐、实验周期长、费用高。文 献表明，斑马鱼体内有与人类 hEＲG 通道相类似的 zEＲG 通道［12］，使得斑马鱼在评价药物的心脏毒性 方面，有显著的优势。Mittelstadt 等［13］使用受精后 3 d 的斑马鱼卵进行试验，选取临床上引起 QT 间期 延长的 9 种阳性药物，以及 9 中阴性药物分别进行 不同浓度梯度试验，结果发现斑马鱼可以用于药物 对 hEＲG 通道影响的评价。Eimon 等［14］对斑马鱼模 型心脏毒性的试验进行了验证实验，结果显示灵敏 度为 78% ～ 100% ，特异性为 77% ～ 100% ，造成实 验假阳性和假阴性的主要原因为胚胎对药物的吸收 不充分，这一结果符合 ECVAM 对替代试验的指标 （ ＞ 65% ） ，说明斑马鱼模型有评价药物诱导的心脏 毒性的潜能。近几年，随着新技术的不断发展，一些 新的技术不断涌现，其中无创技术在斑马鱼心脏指 标检测中得到应用。Tsutsui 等［15］用荧光共振能量 转移 体 系 对 心 脏 进 行 动 态 成 效 监 测，准 确 快 捷。 Chan 等［16］发明了一种简单无创的方法，通过对斑 马鱼尾部血流量的数字检测和波普分析来测定心 率。这些新技术都将使斑马鱼模型更好的应用于药 物心脏毒性评价试验。 2． 3 肝脏毒性筛选 用斑马鱼进行药物的肝毒性 评价，存在许多的优势，首先斑马鱼在受精后 72 h 完成血液灌注，肝脏功能完整，4 ～ 5 d 后既可以通过 口服进行试验，方便快捷。其次，斑马鱼体内有与人 类相似的 脂 代 谢 酶，例 如 HMG-COA 合 成 酶、裂 解 酶，过氧化物酶体增殖物激活受体（ PPAＲs） ［17］。研 究人员通过基因芯片技术和荧光定量聚合酶链式反 应测得斑马鱼在胚胎发育的不同阶段有 94 个 CYP 基因，其中大多数为人类 CYP 基因的直系同源基 因。进一步研究还发现，一些外源性代谢基因也与 人类 基 因 相 似，例 如： CYP1A，CYP2B6，CYP3A5 和 UGT（ A1 ） ，特 别 是 与 药 物 相 互 作 用 有 密 切 关 系 的 CYP3A4，在 斑 马 鱼 中 也 发 现 相 似 的 CYP3A65 基 因［18］。此外，Alderton 等［19］使用西沙必利，氯丙嗪， 维拉帕米，睾酮，和右美沙芬等为基质，发现斑马鱼
CHANG Jia1 ，LU Liang1 ，WANG Qing-li2 ，CHANG Yan1 ，MA Jing1 （ 1 National Shanghai Center for New Drug Safety Evaluation and Ｒesearch，
State Institute of Pharmaceutical Industry，Shanghai 201203，China； 2 Center for Drug Evaluation，State of Food and Drug Administration，Beijing 100038，China）
［摘要］ 斑马鱼作为一种较理想的模式生物早在上世纪便应用于环境毒性的评价，并得到了世界的公 认。但其应用于药物毒理学却相对比较滞后。近些年来随着对斑马鱼的深入研究பைடு நூலகம்及其本身具有的优势， 得到了药物毒理学家的重视。本文对斑马鱼应用于药物早期筛选的优势及存在的不足进行了简单概述，并 对其近年来的在早筛中的应用进展进行了综述。
［基金项目］ 国家“重大新药创制”科技重大专项( 2012ZX09505001003) ［作者简介］ 常嘉，女，硕士研究生。 ［通讯作者］ 马璟，女，博士，教授，主要从事新药安全评价与研究工 作。联系电话: ( 021) 50800333 － 101，E-mail: jma@ ncdser． com。
［Key words］ zebrafish； animalmodels； drug early screening
斑马鱼模型应用于毒理学研究历史比较悠久， 从 20 世纪 70 年代开始，斑马鱼已经得到环境毒理 学家的重视，国外使用斑马鱼进行化合物的急性毒 性 研 究。 并 得 到 了 包 括 经 济 合 作 发 展 组 织 （ OECD） 、国际标准化组织 （ ISO） 等权威机构的认 可［1］。80 年代之后，向遗传学发展，成为应用最广 泛的脊椎动物模型。20 世纪末斑马鱼开始应用于 生物医药领域，主要是作为疾病模型用于新的治疗 方法的探索。进入 21 世纪，随着对新药研发过程的
［关键词］ 斑马鱼； 模式动物； 早筛 ［中图分类号］ Ｒ965 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 1003 － 3734（ 2013） 13 － 1500 － 05
Progress of application of zebrafish in early drug toxicology screening