简易的精子冷冻保存法
精子冷冻保护剂
精子冷冻保护剂 简介： 正常精液是一种混合物，在射精时由睾丸和附睾的分泌物及悬浮其中的精子与前列腺、精囊腺和尿道球腺的分泌物混合而成，最终射出的混合物是一种粘稠的液体。精子分析的方法有很多，其中可通过培养进行检测。 Leagene 精子冷冻保护剂主要由甘油、葡萄糖、枸橼酸钠、抗生素等组成，经无菌处理，其基本原理是在细胞冷冻过程中随着温度不断下降，细胞外液中作为各种电解质溶剂的水分首先形成细小的颗粒状冰晶，导致细胞外水份减少，电解质浓度增加，细胞外液渗透压升高，，用冷冻过程中产生的渗透压的梯度使细胞皱缩，而不损伤细胞。该试剂仅用于科研领域，不适用于临床诊断或其他用途。 组成： 操作步骤(仅供参考)： (一)人类精液快速冷冻步骤 1、精液取出后，在37℃的水浴箱中液化。 2、精液液化后按照WHO 的标准进行常规分析，包括精液量、颜色、气味、PH 值、液化状况、精子密度、活动率、圆细胞数等，并做好相关记录。 3、提前将冷冻保护剂复温至室温。 4、将精液与冷冻保护剂按的比例混匀，并分装于冷冻管中，冷冻管做好标记。 5、将冷冻管置入4℃冰箱。 6、将冷冻管置入－80℃液氮蒸气。 7、将冷冻管投入液氮中冻存。 (二)人类精液程序冷冻步骤 1、精液取出后，在37℃的水浴箱中液化。 2、精液液化后按照WHO 的标准进行常规分析，包括精液量、颜色、气味、PH 值、液化状况、精子密度、活动率、圆细胞数等，并做好相关记录。 3、提前将冷冻保护剂复温至室温。 4、将精液与冷冻保护剂按的比例混匀，并分装于冷冻管中，冷冻管做好标记。 5、将冷冻管置于程序冷冻仪中，开始程序冷冻。冷冻程序如下：编号 名称CZ0150Storage 精子冷冻保护剂 100ml -20℃ 使用说明书1份
精子冷冻贮存
精子冷冻贮存 6.1 引言 精子冷冻保存是男科实验室工作中的一个重要组成部分，特别对不孕不育门诊的男科实验室来说。 从19世纪40年代末起，人类就开始研究精子低温生物学。发现甘油能保护精子免受冷冻损伤，可以将人类精子冷藏在–79℃的干冰上(Polge et al., 1949; Bunge &herman, 1953; Bunge et al., 1954)。随着液氮广泛应用，人类精子冷冻贮存技术取得快速发展，在许多国家建立起商业用途的精子库和国际间合作服务项目(Perloff et al., 1964; David et al., 1980; Clarke et al., 1997; Leibo et al., 2002)。 由于采用不同的冷冻保护剂和不同冷冻程序，出现许多冷冻贮存实验设计方案。冻融后细胞存活率主要取决于细胞内冰晶形成量能降低至何种程度，通过选择恰当的冷冻保护剂和采用最适冷冻速率和复融速率来减少细胞内水形成冰晶提高细胞的存活率(Sherman, 1990; Keel & Webster, 1993; Watson, 1995)。特别在复融过程中，当精子处于–130℃（玻璃化转化状态的关键温度）以上时间太长，细胞内有害的冰晶增多发生重结晶。 人类精子能够耐受一定范围内的冷冻和复融率。它们对快速冷冻（冷体克）产生损伤不敏感，主要原因可能是精子细胞膜中脂质双分子层结构的不饱和脂肪酸增加细胞膜流动性。而且因为细胞内水分含量少（约为50%），精子比其它细胞更能耐受低温导致损伤。但是低温仍对精子功能仍产生不良影响，特别是对精子活力影响比较大。一般而言，只有大约50%的活动精子能在冻存后复苏保持活力(Keel & Webster, 1993)。优化精子冷冻保存方法减低对活动精子的损害从而提高妊娠率(Woodset al., 2004)。 影响供精人工授精的妊娠率的因素包括复融后精子质量、人工授精的时机，而最为关键的是受方因素如年龄，前次供精妊娠情况以及与排卵、子宫输卵管相关疾病(Le Lannou & Lansac, 1993)。如果精子保存方法合适，精子质量不会随着冻存时间的延长而下降。冷冻保存超过28年的精子仍能使妇女受孕分娩婴儿(Clarke et al., 2006; Feldschuh et al., 2005)。 精子冷冻可适用于很多情况（见表6.1），在某些特殊情况下，冻存过程需要进行一些更改（见章节6.2.2）。
稀少精子冷冻技术
稀少精子冷冻技术 薛松果 临床应用价值高： 男方因素约占不孕症病因的30-40％，无精症约占男方因素的10％左右。1992年Palermo等首先将卵胞浆内单精子显微注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)技术应用于临床，解决了男性严重少、弱、畸形精子症患者不能生育子代的难题。而ICSI技术结合显微外科取精术如附睾精子抽吸术(microsurgical epididymal sperm aspiration，MESA)、经皮附睾穿刺取精术(percutaneous epididymal sperm aspiration，PESA)和睾丸精子抽取术(testicular sperm extraction，TESE)则使无精症患者养育遗传学子代成为可能。 然而，MESA、PESA和TESE等都是创伤性手术，多次反复手术可能造成睾丸、附睾组织纤维化，导致不可逆的睾丸萎缩、生精功能退化，为了尽可能地减少患者反复穿刺取精的痛苦，更好地保全男性的生精功能，医学工作者试图对无精子症患者诊断性穿刺或ICSI治疗周期剩余的微量活动精子进行冷冻保存，在女方采卵当日将复苏后存活的精子用于ICSI，这将大大提高该类患者辅助生育治疗的灵活性和可靠性。 技术难度大： 但是，传统的精子冷冻采用 1.8mL的冷冻管(Cryovial)或0.25－0.5mL麦管(Straw)作为冷冻载体，冷冻/复苏过程还需要对精子作2-3次离心洗涤，每一步操作都会造成精子不同程度的损失。而睾丸或附睾穿刺获得的精子一般数量少、活力差，常规冻存复苏后，往往难以找到足够的活动精子进行ICSI，所以传统方法不适用于对穿刺获得的精子进行冷冻保存。 现状：
精子保存的一般步骤
保存的一般步骤 （一）精子的收集 禁欲期（通常为 3～ 5d）后，用**方法将精子收集于 10～ 20mL 无菌的聚丙烯样品收集容器中。要求禁欲期是为了更好地冷冻保存样品。通常而言，这样的精子与收集前禁欲期较短及不规则的精子相比，冷冻保存后的特性更恒定且更完善。 射出的精液是液态的，但正常情况下立即凝聚成胶状。凝聚后的精液通常在 30min内液化，此时就可测定其体积。为了使精子获得最大的冷冻存活力，应在收集精液后 1min内开始对液化精子进行冷冻保存处理。 （二）体积的丈量 体积可用较准的加样器或带针头的 5mL 注射器来丈量，有时也可根据收集精液前后采样瓶的重量之差来计算。取 0.1～ 0.2mL 精液作精液分析（活动精子的百分数及其质量、精子密度等，参见本书有关章节），此外尚需取出一些精液，同时以用来做筛选某种性传染疾病的检测、进行某些检测以筛选导致性病的微生物如奈瑟淋球菌等（详见有关章节）。 （三）甘油化 甘油作为冷冻保护剂，可以分步方式直接加入到未经处理的精液之中。每次加入后混匀，时间间隔为 1min；或间接地作为扩张液或基液的组分，经稀释后逐步加入精液。而在美国与加拿大，40% 以上的著名精子库，仍单独使用甘油作为冷冻保护剂，而越来越多的新的精子库则使用扩张剂，尤其是含甘油的两性离子缓冲系统。 甘油化的条件不一定涉及温度的特殊条件（除了室温之外）和接触时间（除了加入甘油及混匀所需时间之外）。 （四）包装和存活力观察 甘油化的精液可吸入塑料吸管（可用封口剂，加热，或用尼龙塞来密封）或放入玻璃安瓿（用火焰封口），也可放入塑料冷冻管（冷冻小瓶）后用螺口盖拧紧。每份冷冻精液的体积通常是 0.4～ 0.8mL，这可作为人工授精的一个单位。当然假如合适，人工授精也可能使用一个单位以上的精液，选择用于冷冻保存精子的容器是很重要的。这种容器应是易于标记、操纵、储存，同样也应具有很好的生物兼容性以及抗压性能。高质量的聚丙烯吸管或小瓶看来最符合这些标准，而没有易碎及被洗涤剂污染等玻璃容器所具有的缺点。 放入液氮冷冻之前，除了要对被冷冻和储备的精子进行分装以外，还需预备一份质量控制检测样品。对收集后未经处理的精液、用冷冻保护剂处理过的精液以及储存前、冻融后的精液均应观察其中的活动精子及其活动力。通过观察能追踪冷冻保存各阶段的精子生存情况，并能确保了解冷冻精子的存活能力。
冷冻保存精子,把“根”留住
冷冻保存精子，把“根”留住 利用“精子银行”留“根” “不等了，我们离婚吧!”在男科门诊常常能够听到这种无奈的话语。结婚多年的夫妻，因为丈夫的精液质量问题(无精子、少精、弱精、畸形精子等)而最终导致劳燕分飞。“精子荒”已经成为一个严峻的社会问题。当代男人的精子和生育能力正在经受严峻的考验，许多男人不约而同地将自救措施瞄准了“精子银行”或“精子库”，希望将自己的生育种子寄存在那里，以备不时之需。所谓“精子银行”或“精子库”，就是指超低温冷冻存放精子的地方和设备。 精液冷冻是保存生育能力的一个有效办法，在接受具有生殖毒性药物和仪器治疗前先保存精子，已成为一种选择。目前认为，“精子银行”主要适合于下列几类人： 第一，对于那些还没有完成“传宗接代”任务，而又处在高危因素笼罩下的男人来说，“精子银行”可以起到储备生育能力的作用，防止因为某些损害因素，包括药物、手术、损伤等造成的生育能力的永久性丧失。例如某些即将长期接触有害睾丸健康的特殊职业(辐射和放射线等)人群，因某些疾病(恶性肿瘤)不得不使用损害
睾丸的化疗药物，不得不手术切除睾丸(睾丸肿瘤)等的 人群，可以预先冷冻精液，起到“生殖储备”的作用。 这也是使用“精子银行”的主要人群。 第二，“精子银行”可作为用于治疗男性不育症的 手段，可以多次保存少精子症者的精液，起到积少成多 的作用，最后可以“集中优势兵力”，用于人工授精， 期望一举获得成功。另外，“精子银行”也是计划生育 措施顺利实行的有力保证。 精子冷冻安全，并非人人需要 低温冷藏的精子具有较高的质量和安全性，在零下196摄氏度的低温下可以将精子良好保存达数十年之久，且这些精子仍然具有生育能力。在低温保存过程中，还 可以淘汰许多发育异常的精子。一些携带传染性病原体 的献精员，例如艾滋病病毒携带者，也可以在精子冷藏 保存过程被发现而淘汰其精液。因此，采用“精子银行”的精子是比较安全且让人放心的，获得怀孕者自然流产 机会少，出生孩子畸形者少，后代素质高。 从理论上讲，所有男人的精子都可以保存在“精子 银行”里，从而使生育能力获得万无一失的保障。以现 今的科学技术，保存精子已经是非常简单的常规手段， 费用(每年2000～3000元)也可以承受，但并不是所有的男人都需要“精子银行”的帮助。
小鼠胚胎-精子冷冻保种申请表-清华大学试验动物中心
小鼠胚胎/精子冷冻保种申请表 需要填写的资料： 说明： 1.*表示必须填写； 2.保种方式的选择：我们采用精子冻存和胚胎冻存的方法进行保种；假如为杂合子，雄性数量≥3 只并且可以和B6交配做净化，我们推荐安乐死一只雄鼠使用精子冻存的方式保种，可以有效控制保种周期，不受雌鼠排卵多少的限制。 3.保种对提供小鼠的要求： 精子冻存 冷冻精子需要提供的小鼠信息：阳性纯合子雄鼠，2-3只，12-18W（最佳），生育能力良好，在实验前7d内进行过成功交配，而在3d内未交配过；冻存2只/品系，20个麦管。 费用：200元/麦管 冷冻的流程和所需的时间： 1)提前1周邮件预约申请，写明小鼠品系名称、数量、出生日期、所在位置。 2)通过申请后安排实验，精子冻存后至少1周进行复苏检测实验（1麦管）。 3)等待代孕小鼠生仔（孕期19.5天，小鼠出生后10-12天剪尾，通知取回鼠尾检测，（一周内反 馈检测结果。） 冷冻后的保存：液氮中保存 终生免费保存。 精子复苏（除复苏检测外） a、外来精子复苏 提前1周邮件预约申请，写明小鼠冻精信息（品系，数量），送达时间。
从接收之日起，1周内安排复苏实验 精子复苏采用体外受精的方式得到2-cell期胚胎，输卵管移植生仔。（孕期19.5天，小鼠出生后10-12天剪尾，通知取回鼠尾检测，一周内反馈检测结果。） 费用：IVF 500元，IVF用B6（含激素）40元/只，移植用受体单侧100元/只，双侧180元/只，试剂和人工费100元。 如需其他品系雌鼠，需从外单位订购。 b、动物中心精子复苏 提前1周邮件预约申请，写明复苏品系。 精子复苏采用体外受精的方式得到2-cell期胚胎，输卵管移植生仔。（孕期19.5天，小鼠出生后10-12天剪尾，通知取回鼠尾检测，一周内反馈检测结果。） 费用：IVF 500元，IVF用B6（含激素）40元/只，移植用受体单侧100元/只，双侧180元/只，试剂和人工费100元。 注意事项： 1. 运输过程中：请使用专业运输工具（航空罐）进行运输，运输过程中请避免磕碰，注意液氮充足。 2. 由于各家单位使用冷冻精子的方法和试剂并不相同，请一定提供冷冻和复苏的protocol作为参考，且不保证100%复苏成功。截止2015年9月，我们复苏精子平均成功率是40%。 胚胎冻存 品系内冻存需要提供的小鼠信息：雄鼠2-3只12-18W,雌鼠至少10只，3-4W或9-12W。正常情况下可冻存200枚胚胎左右。 费用3000元/品系。 与B6冻存：雄性小鼠，2-3只12-18W，中心提供雌性B6小鼠3-4W，30只。正常情况下可冻存500-600枚胚胎左右。 费用3000元/品系+B6费用40元/只。 c．冷冻流程和所需时间 提前1周邮件预约申请，写明小鼠品系名称、数量、出生日期、所在位置。 通过申请后一周左右安排实验，胚胎冻存采用体外受精的方式得到2-cell期胚胎，玻璃化冻存。胚胎冻存后至少1周进行复苏检测实验（1个冻存管，30 -50枚胚胎/管） 复苏回收的成活2-cell，采用输卵管移植到代孕母鼠体内，19.5天生仔，1-12天剪尾通知取回检测，（一周内反馈检测结果。） 冷冻后的保存：液氮中保存 终生免费保存。 胚胎复苏（除复苏检测外） a、外来胚胎复苏 提前1周邮件预约申请，写明小鼠冻存胚胎信息（品系，数量）送达时间。 从接收之日起，1周内安排复苏实验，输卵管移植生仔。（孕期19.5天，小鼠出生后10-12天剪尾，通知取回鼠尾检测，一周内反馈检测结果。） b．动物中心胚胎复苏 提前1周邮件预约申请，写明复苏品系。 通过申请后1周左右安排复苏实验，输卵管移植生仔。（孕期19.5天，小鼠出生后10-12天剪尾，通知取回鼠尾检测，一周内反馈检测结果。） 费用：移植用受体单侧移植100元/只，双侧移植180元/只，试剂和人工费100元。 注意事项： 1.运输过程中：请使用专业运输工具（航空罐）进行运输，运输过程中请避免磕碰，注意液氮 充足。 2.由于各家单位使用冷冻精子的方法和试剂并不相同，请一定提供冷冻和复苏的protocol作 为参考，且不保证100%复苏成功。截止2015年9月，我们复苏胚胎平均成功率是60%。