实验 感受态细胞制备及转化共57页
实验大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
实验仪器、材料、试剂
1、仪器：恒温摇床，恒温水浴锅，电热
恒温培养箱，无菌工作台，微
量移液枪。
2、材料：DH5α感受态细胞、质粒pGEX-4T2
1、仪器：高压灭菌锅、恒温水浴锅、台式
离心机、无菌操作台、微量移液
器、恒温摇床；
2、材料：菌种E.coli DH5α； 3、试剂：LB液体培养基、0.1M CaCl2。
实验步骤
1、将E.coli DH5α单菌落接种于3mlLB培 养液中，37℃震荡培养过夜。 2、取30μl液体培养液加入3mlLB液体培养 基中， 37℃下震荡培养，至光密度值 OD600在0.5~0.6之间（5×107 个/ml ）。
3、取1ml E.coli液体培养液于1.5ml的离心
管中，4000rpm，4 ℃离心 3min。
实验步骤
4、快速的吸除上清，向沉淀中加入1ml冰 冷的0.1M CaCl2溶液，使沉淀充分悬浮，动 作要轻柔，置于冰上30min，4000rpm，4 ℃ 离心3min。 5、弃上清，加入lml 冻存液（含15%甘油的 0.1M CaCl2溶液）溶液，使沉淀充分悬浮， 以每管0.1ml的规格分装3管，冻存于-80 ℃ ，可保存4~6个月。
感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体
DNA分子导入受体细胞。
实验原理
用CaCl2处理大肠杆菌细胞使其处于感 受态后，通过热激处理可将质粒转化进入细 菌中。进入细菌细胞的质粒能够自主复制并 在宿主中实现其携带基因的转录、表达。
实验原理
实验原理
转化体的筛选方法： 主要用不同抗生素基因筛选。 常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉 素、氯霉素、四环素、链霉素等。
实验原理
如果将转化后的菌液涂在无选择性抗生 素的培养基平板上，会出现成千上万的细菌 菌落，将难以确认哪一个克隆含有转化的质
感受态细胞的制备及转化实验报告 [制备感受态细胞实验报告]
![感受态细胞的制备及转化实验报告 [制备感受态细胞实验报告]](https://img.taocdn.com/s3/m/713beab8c67da26925c52cc58bd63186bdeb9255.png)
效价：指能用 1ug 的标准质粒能够转化出的菌落数。
再放到恒温振荡箱 60min
具体步骤
四．试验结果
化学效价检测
化学检测结果 菌数 4*10^7
.把感受细胞从超低温冰箱中拿出(冰水先预备好再拿出感受态细胞在
电转化检测结果 菌数 10^9
第1页共1页
五．试验分析
本文格式为 Word 版，下载可任意编辑，页眉双击删除即可。
第1页共1页
表，经 42
本文格式为 Word 版，下载可任意编辑，页眉双击删除即可。
前培育
C2+处理的感受态细胞，其转化率一般能到达 5×106~2×107 转化子
将单菌落接种到 10ml 的培育液中，在恒温振荡器 37°下过夜培育
/ug 质粒 DN，可以满足一般的基因克隆试验。如在 C2+的基础上，联合其
水洗 3 加 10ml 水 离心 水倒掉
(50Ul~100Ul 若这里不能长到 10^6 则不行用)
4)XX 油 10%洗 2 次〔每次加 5ml〕中间离心两次 在第二次加 XX 油悬
电转化效价
浮后离心后加 120uLGYT 悬浮液
取 Pug19uL 加入感受态细胞再将此移到电击杯
5) 一个人预备 4 个小管子〔每个 40uL 扔到液氮速冻 放到-70℃
本文格式为 Word 版，下载可任意编辑，页眉双击删除即可。
感受态细胞的制备及转化实验报告 [制备感受态细胞 实验报告]
也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出如今对数生长期，新颖幼 嫩的细胞是制备感受态细胞和进行胜利转化的关键。
制备出的感受态细胞临时不用时，可加入占总体积 15%的无菌 XX 油
重组 DN 分子体外构建完成后，必需导入特定的宿主〔受体〕细胞，使
感受态细胞制备与转化
Ⅰ、CaCl2法制备感受态细胞（大肠杆菌）①挑取37℃培养16-20h的单菌落（直径2-3mm）于含有100mlLB或SOB的500或1000ml 的三角瓶中，剧烈振荡培养3h至OD值为0.2-0.4（据文献大肠杆菌DH5α菌株培养物OD 值为0.2-0.4时，约含109个菌/ml；②转移菌体至无菌、一次性冰冷的50ml聚丙烯离心管内。
将离心管内培养物放置于冰上10min，以使其冷却至0℃；③将离心管内培养物4℃，4000rmp，10min以收集菌体；④弃去上清培养基，并颠转离心管放于一叠吸水纸上1min，吸取多余培养基；⑤用30ml冰冷MgCl2-CaCl2溶液（80mM MgCl2和20mM CaCl2）漩涡振荡重悬菌体沉淀，置于冰上10min；⑥将离心管内培养物4℃，4000rmp，10min以收集菌体；/⑦弃去上清培养基，并颠转离心管放于一叠吸水纸上1min，吸取多余培养基；⑧用2ml冰冷0.1MCaCl2溶液（2ml冰冷0.1MCaCl2/50ml原初培养物）漩涡振荡重悬菌体沉淀；⑨放于4℃冰箱14-20h。
获得的感受态细胞即可直接用于转化或添加甘油至终浓度10%（7:3,7是菌液，3是甘油），分装离心管内（150-200μl），存于-70℃。
感受态细胞的冻存制备①每4ml重悬细胞中添加140μlDMSO，轻摇混匀，冰上放置重悬物15min；②另外每管重悬物中再添加140μlDMSO，轻摇混匀，重新放于冰浴中；③迅速将重悬物分装于冷的、无菌小管内，将小管浸入液氮中瞬时冰冻感受态细胞，将小管存于-70℃冰箱。
Ⅱ、大肠杆菌转化①CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞Luria-Bertani（LB）培养基（1L）：胰蛋白胨（10g），酵母提取物（5g），NaCl（10g）pH7.5/NaOH，dH2O至1L，灭菌LB平板：LB培养基（500ml），Agar（7g），灭菌。
冷却55-65℃倒平板。
实验一 感受态制备及转化
（二）转化及复苏：
1. 取 100 μL感受态细胞，加入重组DNA 20 μ L （50ng)； 取 100 μL感受态细胞，加入20 μL无菌水（阴性对照1）； 取 100 μL感受态细胞,加入对照DNA 20 μ L （阴性对照2） 用枪头混匀，冰上放置20min。 阴性对照的目的？ 2. 420C循环水浴热激90秒 3. 冰浴2分钟 4. 每管加800μ L LB液体培养基，370C慢摇40min（120～140rpm） 5. 40C，5000rpm离心2min，弃去600μ L，取20～50μ L菌液，加40μ L Xgal和4μ L IPTG，混匀后涂布在含Amp的培养皿中 6. 倒置培养过夜（ 370C）
实验一 大肠杆菌感受态细胞的制备 及质粒DNA的转化
一、实验目的 学习大肠杆菌感受态细胞的制备、转化及转化子鉴定的 基本原理和操作技术。 二、实验原理
感受态细胞(Competent Cells)：受体细胞经过一些特殊方
法的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，能允许 外源DNA分子进入。 转化(Transformation)：将外源DNA分子引入受体细胞,使之 获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、
6. 菌体加入预冷的0.1 mol/L的CaCl2 1.0mL，轻吹并悬浮细胞，冰上10min； 7. 离心 5000rpm ，40C，5min，去上清； 8. 用冰预冷的0.1 mol/L的CaCl2 100μ L用枪轻吹悬浮细胞，冰上操作； 9.此为感受态细胞，若储存则需加入15～30%甘油，可在-700C或-200C冻存。
四、实 验 流 程
（一）感受态细胞的制备： 1. 预培养：接一单菌落到3mL LB培养基中，370C、190rpm振荡培 养过夜； 2. 取 0.4mL预培养菌液转移到含40mL LB液体培养基的锥形瓶中，
感受态细胞的制备及大肠埃希菌转化图文
酶切处理
使用限制性内切酶对质粒进行酶切， 使其具有黏性末端，便于与外源 DNA连接。
纯化质粒
通过凝胶电泳和回收试剂盒对酶切 后的质粒进行纯化，去除杂质。
转化过程
制备感受态细胞
通过化学或电击法将大肠埃希菌的细 胞壁进行预处理，使其处于易于接受 外源DNA的状态。
加入质粒
离心和涂布培养
将转化后的细胞离心收集，涂布在含 有抗生素的选择性培养基上，筛选成 功转化的克隆。
实验原理
感受态细胞制备原理
通过物理或化学方法降低细菌的细胞 壁通透性，使其能够吸收外源DNA 。
大肠埃希菌转化原理
外源DNA与感受态细胞结合，通过细 胞壁的渗透作用进入细胞内，并在细 胞内进行复制和表达。
02
感受态细胞的制备
细菌培养
01
02
03
菌种选择
选择对数生长期的细菌作 为感受态细胞制备的起始 菌种，以保证较高的转化 效率。
CaCl2处理法
CaCl2处理
在细菌培养物中加入适量的CaCl2，使细菌细胞壁产生可逆性损伤，提高感受态细 胞的转化效率。
低渗溶液
将CaCl2处理后的细菌细胞洗涤在低渗溶液中，使细胞壁进一步损伤，提高感受 态细胞的转化效率。
03
大肠埃希菌的转化
准备质粒
提取质粒
从宿主菌中提取出质粒DNA，通 常使用质粒提取试剂盒进行操作。
高转化效率是实现高效基因工程操作的关键因素 之一，因此对转化效率的测定具有重要的实际意 义。
05
结果与讨论
实验结果
成功制备感受态细胞
通过电击法成功制备了感受态细胞，细胞形态无明显变化，生长 状态良好。
大肠埃希菌转化效率高
将外源DNA导入感受态细胞后，成功获得了高转化效率的大肠埃 希菌。
感受态细胞的制备与转化
感受态细胞的制备与转化高中生物学选择性必修三基因工程中对于细菌作为表达载体的受体细胞，只是简单地说“先用Ca2+处理使之成为感受态细胞”，但如何制备感受态细胞并使其转化未作详细说明。
常态的细胞不能摄入外部溶液中的DNA，所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。
所谓的感受态细胞，即指受体(或者宿主)最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态。
通俗的讲，就是受体细胞经过一些特殊方法(如：CaCl2，RuCl3等化学试剂法)处理后，细胞膜的通透性变大，能够容许外源DNA分子通过，这时的细胞就称为感受态细胞。
一般来说，感受态细胞的最基本要求是：1. 没有质粒(也可以有与待转质粒复制子兼容的质粒)2. 容易被转进去(一般是G-细菌，细胞壁薄)3. 营养条件一般，非苛养菌在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。
它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。
受体细胞经过一些特殊方法(如：电击法，CaCl2等化学试剂法)处理后使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。
进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
化学制备法大肠杆菌的转化常用化学法(CaCl2法)，该法最先是由Cohen于1972年发现的。
其原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。
Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到5×106~2×107转化子/ug质粒DNA，可以满足一般的基因克隆试验。
实验九大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
02
在实验过程中，发现感受态细胞的质量和转化效率受到多种因素的影响，如试 剂浓度、温度、时间等。因此，需要严格控制实验条件，确保实验结果的可靠 性和可重复性。
03
实验中还发现，不同批次的大肠杆菌菌株对感受态细胞制备和转化的影响也较 大，这可能与菌株的遗传背景和生理状态有关。因此，在实验中应尽量使用同 一种菌株，以保证结果的稳定性。
序列分析
对转化子进行序列分析，进一步验证目的基 因的准确性。
05
结果与数据分析
转化效率的计算
转化效率计算公式
转化效率 = (转化子数量 / 菌落总数) × 转化体系中 DNA的总量。
转化效率的影响因素
感受态细胞的制备方法、DNA的质量和浓度、转化条 件等。
转化效率的优化
通过调整感受态细胞制备方法和优化转化条件，可以 提高转化效率。
实验材料与试剂
实验材料：大肠杆菌菌株
大肠杆菌菌株
用于制备感受态细胞和转化实验的基本材料，应选择生长旺 盛、纯度高的菌株。
注意事项
确保菌株无污染，并按照实验室规定进行菌株保存和使用。
试剂：CaCl2、LB培养基、Amp等
CaCl2
用于制备感受态细胞的试剂，能够提高大肠 杆菌的转化效率。
LB培养基
用于培养大肠杆菌的生长，提供必要的营养 物质。
02
实验过程中，通过调整试剂浓度、温度和时间等参数，优化了感受态 细胞的制备和转化条件。
03
成功将外源DNA导入感受态细胞，并通过抗生素筛选获得了转化子。
04
实验结果表明，感受态细胞的制备和转化是实现基因克隆和表达的关 键步骤，为后续的分子生物学实验奠定了基础。
结果分析与讨论
01
实验结果与预期基本一致，成功实现了大肠杆菌感受态细胞的制备和转化。
感受态细胞制备及转化步骤
一感受态细胞的制备（材料：DH5α菌）1.下午三点左右将大肠杆菌接种于培养管中（取冻存的大肠杆菌接种于5ml LB 培养基中或用牙签挑菌培养），以220rpm在摇床上震荡过夜培养。
2.第二天取已经摇好的的菌液50或100ul接种于盛有5mlLB培养基的培养管中，每隔20分钟观察一次（大肠杆菌大约20分钟繁殖一次），2到3个小时后培养基变浑浊，将培养管置于灯光下摇动会出现大肠杆菌的絮状条带，此时培养液的OD600nm≦0.5，细胞数小于10的8次方。
3.将培养好的大肠杆菌倒到1.5ml的eppendorf管中（将菌体混匀后再倒），以10000rpm，离心1min.倒掉上清液后将培养管中的液体混匀后继续倒到eppendorf管中并于冷冻离心机中离心，直至将培养管中的菌液全部离心完毕。
4.倒净上清液后将盛有菌体的eppendorf管置于冰上，加入100ul冰的氯化钙（0.1M）溶液，并将菌体与溶液混合均匀（用手指用力弹），置于冰上静置10min （此时勿忘将氯化钙同样至于冰上保持其冰冷）。
5.将eppendorf管置于冷冻离心机中以8000rpm，离心1min。
6.弃上清后加50ul的氯化钙溶液混合均匀，若有液体溅到eppendorf管壁上可以进行短时离心，此时已制成大肠杆菌的感受态细胞。
大肠杆菌至于冰上备用，或于-80︒C保存。
二转化（transformation）1.另取1.5ml的eppendorf管置于冰上（做好相应标记），将含有感受态细胞的菌液混匀后取10ul的感受态细胞加入到eppendorf管中，随后加入1ul的质粒混匀（用手指肚轻弹），至于冰上静置30min。
2.将离心管置于42摄氏度的水浴锅中1到2min，随后迅速置于冰上，并向离心管中加入500ul LB培养基混匀后置于摇床上震荡培养1小时（37摄氏度，220rpm，使菌体恢复正常生长状态）。
3.用移液枪从离心管中取已经摇好的菌液100ul均匀的加入到相应的选择培养基上，用刮刀将菌液均匀的涂布到培养皿上过夜培养。
实验-大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
实验仪器、材料、试剂
1、仪器：恒温摇床，恒温水浴锅，电热
恒温培养箱，无菌工作台，微
量移液枪。
2、材料：DH5α感受态细胞、质粒pGEX-4T2
3、试剂：LB液体及固体培养基、氨苄青霉
素Amp（50mg/ml）。
实验步骤
1、每100ul感受态细胞加入1ul质粒DNA， 同时做一个空白对照（由第一组完成） 。
Amp的平板上，直至液体被培养基全部吸收；
6、平板倒置，37 ℃，过夜培养。
时间。
4、悬浮细胞时动作要轻柔，以免造成菌
体破裂，影响转化。
思考题
1、影响感受态细胞转化效率的因素有哪
些？
内容二：质粒DNA的转化与转化体筛选
1
实验目的 实验原理
实验仪器、材料、试剂
2
3
4
实验步骤
注意事项 思考题
5
6
实验目的
了解转化的概念及其在分子生物学研究中
的意义。
学习将外源质粒DNA转入受体菌细胞及筛 选重组子的方法。
1、仪器：高压灭菌锅、恒温水浴锅、台式
离心机、无菌操作台、微量移液
器、恒温摇床；
2、材料：菌种E.coli DH5α； 3、试剂：LB液体培养基、0.1M CaCl2。
实验步骤
1、将E.coli DH5α单菌落接种于3mlLB培 养液中，37℃震荡培养过夜。 2、取30μl液体培养液加入3mlLB液体培养 基中， 37℃下震荡培养，至光密度值 OD600在0.5~0.6之间（5×107 个/ml ）。
感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体
DNA分子导入受体细胞。
实验原理
用CaCl2处理大肠杆菌细胞使其处于感 受态后，通过热激处理可将质粒转化进入细 菌中。进入细菌细胞的质粒能够自主复制并 在宿主中实现其携带基因的转录、表达。
感受态细胞的制备、转化及重组质粒的筛选
蓝白斑筛选则能在转化子的基础上区分空载体和连
接成功的载体（连接上SOD基因的pUC18载体）。
细菌染色体
含有lacZ基因C端序列
β-半乳糖苷酶缺陷型菌株
生成 有活性的 β-半乳糖苷酶
载体
多克隆位点 LacZ’基因
β-半乳糖苷酶启动子
3. 取菌液1.5ml于EP管中，冰上放置5-10 min；4℃， 4000 rpm离心4 min，去上清，收集菌体。（从这一 步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）
4. 用500μl预冷的0.1mol／L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞， 冰浴5-10 min。
5. 4℃，4000 rpm离心4 min，弃去上清液，加入50 μl预冷的0.1mol／L CaCl2溶液，加入10 μl重组质粒 DNA溶液，轻轻混匀，小心悬浮细胞后置于冰上2530min。
激活 IPTG
非代谢性的乳糖启动子诱导剂
含有X-gal和IPTG的培养基
细菌染色体
含有lacZ基因C端序列
β-半乳糖苷酶缺陷型菌株
插入片段到多克隆位点 lacZ‘基因被破坏
载体
无法生成 有活性的 β-半乳糖苷酶
含有X-gal和IPTG的培养基
操作步骤
1. 从LB平板上挑取新活化的E.coli单菌落。接种于
4. 用500μl预冷的0.1mol／L CaCl2溶液轻轻悬浮细 胞，冰浴10 min。
5. 4℃，4000 rpm离心4 min，弃去上清液，加入 50 μl预冷的0.1mol／L CaCl2溶液，加入10 μl重组质 粒DNA溶液，轻轻混匀，小心悬浮细胞后置于冰上 25-30min。
实验三农杆菌感受态细胞制备及转化
所以涂板后无单菌落出现，出现长满板的情况为抗生素失活。
农杆菌感受态的制备
A • 挑取农杆菌单菌落于液体培养基中，28 °C，200 rpm振荡培养过夜活化
B
• 菌液按1:50的比例转接于50ml新鲜培养基中，振荡培养至OD600为0.4-0.6；
C
• 菌液转移至10 ml的离心管中，冰浴30 min
D
• 4℃，5 000 rpm离心5 min, 弃上清，收集菌体
农杆菌介导基因转化
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条 件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发 状根。 根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有 一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到 植物基因组中,并且可以通过减数分裂稳定的遗传给后代，这一特性成为农 杆菌介导法植物转基因的理论基础。人们将目的基因插入到经过改造的T-
E
• 菌体重悬于4ml冰预冷的20 mM的CaCl2中，冰浴10-20 min
F
• 4℃，5 000 rpm离心5 min，弃上清 • 菌体重悬于1ml冰预冷的20 mM的CaCl2，分装100µ l/管，24 h内使用或液氮速冻 后-70 °C保存
G
感受态制备的要点：
OD600：0.4～0.6 OD值超过0.6必须重新活化 当OD达到0.3时，每隔20min测一次OD值。 分光光度计要测试的样品不能离心，保持细菌悬浮状态，有沉淀要 摇匀。注意比色杯的正确选择及使用 光电比色法定量测试原理：朗伯比尔定律：“当一束平行单色光垂直通过某一均 玻璃比色杯只适用于可见光区,在紫外区测定时要用石英比色杯。石英玻璃在紫 匀非散射的吸光物质时, 其吸光度A与吸光物质的浓度c及吸收层厚度b成正比”。 外线到红外线的整个光谱波段都有较好的透光性能，可见光透过率在９３％以 其中“吸收层厚度”就是实践中的比色杯厚度，如果测试中使用的比色杯不是同 上，特别是在紫外光谱区，最大透过率可达８０以上，而普通的玻璃在紫外光 一套，就无法保证其厚度一致，也就人为导致测试结果出现偏差。 谱区的透过率较差。一般，测定波长在350毫微米以上时，可以用玻璃比色杯；
感受态细胞制备与转化的实验报告
感受态细胞制备与转化的实验报告感受态细胞制备与转化的实验报告一、引言随着生物科学研究的不断深入，对细胞功能和特性的研究变得越来越重要。
而传统上，研究者通常将细胞分类为基因编码的外显性细胞和感受态细胞。
感受态细胞是具有特定功能和响应能力的细胞，这使得它们在医学和生物学领域的应用潜力广阔。
本实验旨在探索感受态细胞的制备和转化方法，并评估其在功能研究中的应用潜力。
二、方法1. 感受态细胞制备a) 实验人员通过文献调研和现有技术，确定适合本次实验的感受态细胞类型和制备方法。
b) 选取合适的细胞系，如神经元细胞系或免疫细胞系，根据文献中的描述，采用合适的制备方法。
c) 在细胞培养基中加入适当的因子或化合物，以诱导细胞进入感受态。
d) 筛选并分离感受态细胞，使用细胞培养技术将其扩增至足够数量。
2. 感受态细胞转化a) 收集适当的转化因子或刺激物，根据研究目的确定转化条件。
b) 使用合适的技术和试剂将感受态细胞转化为所需的细胞类型。
c) 对转化后的细胞进行验证和鉴定，确保其已成功转化。
三、结果与讨论1. 感受态细胞制备经过感受态细胞制备的过程，实验人员成功获得了目标细胞系的感受态细胞。
通过适当的因子或化合物的处理，细胞成功转变为特定的感受态细胞，显示出对特定刺激的响应能力。
这为后续的实验和应用提供了良好的基础。
2. 感受态细胞转化通过合适的转化因子或刺激物处理，实验人员将感受态细胞转化为所需的细胞类型。
转化后的细胞具备了目标细胞的特征和功能，通过验证和鉴定，确保转化的成功率和质量。
这为进一步研究不同细胞类型的功能和应用提供了可能。
感受态细胞的制备和转化是一项重要的技术，在生物医学研究和应用中具有广泛的潜力。
通过实验人员的努力，成功制备和转化了感受态细胞，为相关领域的研究提供了强有力的支持。
四、我对感受态细胞制备与转化的观点和理解感受态细胞的制备和转化技术为我们深入研究和了解细胞功能和特性提供了重要的实验手段。
实验感受态细胞制备及转化
整理ppt
40
11. 倒置平板于37 ℃培养12－ 16个小时。
整理ppt
41
每组做质粒DNA的转化：
每50µL感受态细胞悬液中加入2µL质粒DNA,轻轻 摇匀，同时设置三组对照：(1)不加质粒，(2)不加 受体菌， (3)加已知具有转化活性的质粒DNA，具 体操作按下表进行：
编号 组 别 1 受体菌对照
整理ppt
16
Ca2+诱导DNA对大肠杆菌细胞的转化：
①在0℃的Cacl2低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀， 同时Cacl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促使细胞 外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，诱导大 肠杆菌形成感受态。
②Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗DNA酶 (DNase)的羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞 膜的外表面上。当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时， 细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随之出现许多
• pGEX系列 (GST融合表达, Pharmacia公司)
• pBAD系列 (Arabinose诱导型)
•pTYB系列 (CBD融合, 可以自我切割, BioLabs)
整理ppt
5
受体细胞应具备的条件
限制性缺陷型
外切酶和内切酶活性缺陷（recB-，recC-，hsdR-）
重组整合缺陷型
用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recA-）
• 本实验利用抗生筛选转化子。
整理ppt
23
互补法
• 许多载体都具有一段大肠杆菌β半乳糖苷酶的 启动子及其α肽链的DNA序列，此结构称为lac Z′基因。Lac Z′基因编码的α肽链是β半乳糖苷 酶的氨基端的短片段（146个氨基酸）。宿主 细菌带有β-半乳糖苷酶C 端部分序列。宿主细 菌和质粒编码的片段各自都不具有酶活性，但 它们可以通过片段互补的机制形成具有功能活
实验八 感受态细胞的制备和转化
4、转化产物的涂布
取500 μl复壮后的转化菌液涂布于筛选培养基表面，待菌液完 全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃过夜培养。 同时做一个对照: 对照组： 以同体积的无菌双蒸水代替连接产物，其它操作与上面 相同。此组正常情况下在含Amp的LB平板上应没有菌 落出现。
实验八 感受态细胞的制备和转化
一、实验目的
1、了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。 2、学习用氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。 3、学习外源DNA转化大肠杆菌受体细胞的方法。
二、实验原理
转化是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种 手段。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株(Rˉ， Mˉ)，这些变异株可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。 受体细胞经过一些化学试剂如CaCl2、 RbCl等处理后，细胞膜的通透性 会发生暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。进 入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移，使受体细
胞出现新的遗传性状。
三、实验材料
E. coli DH5α菌株： R-，M-，Amp实验七的连接产的LB固体培养基 2、0.05 mol/L CaCl2溶液
五、实验步骤
1、受体菌的培养
从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落，接种于3-5ml LB液体培 养基中，37℃下振荡培养12h左右，直至对数生长后期。将该菌悬液以 1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中，37℃振荡培养2-3h至 OD600 =0.5左右。
2、感受态细胞的制备 （ CaCl2 法）
① ② ③
吸取1.5mL培养液到一灭菌的离心管中，将离心管插入冰中放置 10min，然后于4℃下10 000 rpm离心10min。 弃去上清，用1mL预冷的0.05mol/L CaCl2 溶液轻轻悬浮细胞，将 离心管插入冰中放置30min，4℃下10 000rpm离心10min。 弃去上清，加入100 μl预冷的0.05mol/L CaCl2 溶液，轻轻悬浮细胞 ，冰中放置几分钟，即成感受态细胞。
感受态细胞制备及重组转化
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化第一节概述在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA 。
转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ)，它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法(如电击法，CaCl2，RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。
进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant，即带有异源DNA分子的受体细胞)。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年)，因此CaCl2法为使用更广泛。
为了提高转化效率，实验中要考虑以下几个重要因素：1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。
DH5α菌株的OD600为0.5时，细胞密度在5×107个/ml左右(不同的菌株情况有所不同)，这时比较合适。
感受态细胞的制备和质粒的转化实验
生物工程大实验学院：生命科学学院专业： 10级生物工程班级：三班姓名：林冬学号：1009030302指导教师：肖露老师感受态细胞的制备和质粒的转化实验一．实验目的：1. 掌握用CaCl2法制备感受态细胞的原理和方法。
2.学习和掌握质粒DNA的转化和重组质粒的筛选方法。
二．实验原理：细菌吸收外源DNA 的能力最高时的状态被称为感受态细胞。
有些种类的细菌在其生长的任一阶段都处于感受态，而另一些细菌只有处于某个生长时期时（一般为对数生长早、中期），才会处于感受态，如本实验所用的大肠杆菌。
用一定浓度的CaCl2 处理对数生长早中期的细菌可以大大提高细菌吸收周围环境中的DNA分子的能力。
对这种现象的一种解释是CaCl2能使细菌细胞壁的通透性增强，从而提高转化率。
这种转化方法称为“化学法”。
三．材料：设备与试剂四．实验方法：①取100mlDH5ɑ培养物置于冰浴中10min，同时将0.1mCacl2和灭菌的50ml离心管4℃中放置10min.②在无菌条件下将培养物移入50ml离心管中（不能超过2/3体积约30ml）平衡后对称放入离心机，在4℃，6000转/min,离心5min,停止离心后，弃上清液（在超净工作上无菌条件下操作）③加入5ml预冷的0.1molCacl2溶液，用涡旋振荡器振荡均匀使DH5ɑ细胞重新悬浮，置于冰水浴中旋转20min后，在4℃6000转/min离心5min,弃上清。
④细胞重复③一次，离心后弃上清，沉淀后用4mlCacl2悬浮，加灭菌甘油至浓度15％左右，混匀后分装于1.5mlEP管中，200ul/管，于80℃冰箱中冻存备用。
转化实验：200ul感受态→加入1ul质粒混匀→42℃水浴90s→迅速拿出置于冰浴2min→加入800ulLB培养基→37℃，220rpm振荡培养1h→取出100ul涂板。
单菌落扩大培养用接种环挑单菌落接入含150ml液体LB培养基锥形瓶中。
37℃，120rpm摇瓶培养，直至透过菌悬液看报纸上的字能够看出形状但不能辨认。