石蜡切片免疫荧光染色方法之令狐文艳创作
石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法
石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法
一、石蜡切片免疫组化技术
石蜡切片免疫组化方法是一种流行的染色技术，它利用抗原特异性抗
体结合抗原将一种特定蛋白质标记出来，然后对组织交叉剥离切片进行染色，得到对特定抗原的特异性染色，进而可以测定组织中其中一蛋白质的
分布情况及其表达水平。
石蜡切片免疫组化方法主要分为热稳定抗原抗体
保护法、热稳定化学法和抗原保护法三种。
1.热稳定抗原抗体保护法
热稳定抗原抗体保护法又称抗原连接法，它是最常用的一种免疫组化
技术，依赖高温对抗原的特殊保护作用。
其原理是经过化学固定的组织切片，在石蜡上产生隆起；然后用高温阳性抗体（双抗体）将抗原完全覆盖，并产生痕迹，这样便可清楚地观察抗原的分布情况；此外，在有抗原保护
的条件下，抗原保护的组织切片可以用客体抗体染色。
2.热稳定化学法
热稳定化学法是一种特殊的抗原保护法，也是最常用的石蜡免疫染色
技术。
免疫荧光三重标记具体方法及步骤
免疫荧光三重标记具体方法及步骤即利用抗原抗体特异性结合原理，在同一张切片上3个抗原进行同时标记，从而实现定位，定性，半定量的分析1、石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-蒸馏水洗。
2、抗原修复：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液(PH8.0)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。
中火8min停火8min转中低火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。
自然冷却后将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
(修复液和修复条件根据组织来确定)3、画圈：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈(防止抗体流走)4、血清封闭:在圈内滴加BSA孵育30min。
(一抗若是山羊来源，则加兔血清)5、加第一种一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。
(湿盒内加少量水防止抗体蒸发)6、加对应的HRP标记的二抗：玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织，室温孵育50min。
次，每次5min。
切片稍甩干后在圈内滴加CY3荧光增强剂，避光室温孵育10min. 孵育完后，玻片置于TBST中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min8、微波处理：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液(PH8.0)的修复盒中于微波炉内加热处理，中火8min停火8min转中低火7min，去掉已经结合到组织上的一抗二抗，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。
9、加第二种一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。
(湿盒内加少量水防止抗体蒸发)10、加对应的HRP标记的二抗：玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
石蜡切片(paraffin sections)免疫组化染色步骤
石蜡切片(paraffin sections)免疫组化染色步骤1、载玻片的处理：抗原修复过程中,由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。
这里选用ZLI-9001 APES、ZLI- 9003 HistogripTM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等几种试剂，对已清洗的载玻片进行处理。
具体方法如下：（1）APES：现用现配。
将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES 中，停留20~30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。
用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。
（2）HistogripTM：将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogr ip液中，停留1~2分钟,然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60oC 烤箱烘烤一小时，装盒备用。
（3）Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60℃烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。
装盒备用。
试验中使用的器具均为非玻璃制品。
2、常用酶消化：（1）胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%~0.1%，消化时间为37℃、10~4 0分钟，主要用于细胞内抗原的显示。
（2）胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30~180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin（层粘蛋白），Collagen IV（IV型胶原）等。
（3）皂素（Saponin）：一般使用浓度为2~10 g/ml的saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。
3、抗原热修复：可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。
抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）效果最好。
枸橼酸盐缓冲液（粉剂）配制，取该粉剂一包溶于1000ml的蒸馏水中，混匀，其 pH值在6.0±0.1，如因蒸馏水本身造成的pH值偏差，请自行调整。
石蜡切片免疫荧光染色方法
对于石蜡切片：之欧侯瑞魂创作1、2、烤片：60℃60分钟3、脱蜡：二甲苯中Ⅰ脱蜡15分钟→二甲苯Ⅱ脱蜡15分钟→无水乙醇Ⅰ5分钟→无水乙醇Ⅱ5分钟→90%乙醇Ⅰ5分钟→90%乙醇Ⅱ5分钟→70％乙醇5分钟→蒸馏水5分钟→蒸馏水5分钟。
3、抗原修复：高压修复，事先烧开锅中的水，修复盒中加入0.01mol/l柠檬酸钠，pH6.0(柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g加入1000ml蒸馏水中)，上汽后加热10分钟，关火。
修复盒取出，放入装有自来水的瓷缸中缓慢冷却至室温。
2. 去除内源性酶：玻片取出放入湿盒，加3%H2O22(2ml H2O22加入18ml蒸馏水中，现配现用，避光)，室温孵育10分钟，PBS洗3次，每次5分钟。
（也可不必去除内源性酶）。
3. 封闭(Blocking) 加10%正常驴血清（原液100ul+900ulPBS,1ml够用30张片子），室温孵育封闭30分钟。
如果布景较高，可以4℃封闭过夜。
不必洗，用滤纸吸干周边水分。
从封闭开始所有的步调，一定要注意样品的保湿，防止样品的干燥，否则极易发生较高的布景。
4. 一抗孵育(Primary antibody incubation) 参考一抗的说明书，依照适当比例用免疫染色一抗稀释液（10%山羊血清PBS或1%BSA-PBS）稀释一抗。
立即加入稀释好的一抗， 4℃过夜，第二天取出复温45分钟。
PBS洗3次，每次5分钟。
5. 二抗孵育(Secondaryantibody inucubation) 依照适当比例用免疫荧光染色二抗稀释液稀释荧光标识表记标帜的二抗，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。
PBS洗涤3次。
每次5分钟。
如果结果布景较高，可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
6. 蛋白检测(Detection of proteins) 对于免疫荧光染色，此时已经可以直接到荧光显微镜下观察。
7. 复染用DAPI对细胞核进行染色，室温10分钟，PBS冲洗5分钟×3次，封片（封片剂或分析纯的甘油与0.5molpH9.5碳酸缓冲液1：1混合）显微镜观察，染色后为蓝色荧光。
细胞染色方法大全之令狐文艳创作
Hoechst染色:hoechst可以穿过活细胞膜与细胞核结合(主要为凋亡活细胞)在紫外光下将核染为蓝色. Hoechst染细胞核会影响共聚焦显微镜对该样本其他荧光的观察效果.hoechst有hoechest33342和hoechst33258两种hoechsts33258，hoechst33342二者区别不大，但是hoechst33342对细胞的毒性作用更小一些，所以一般来说hoechsts33258用于细胞固定后再染色，而hoechst33342则可以对活细胞直接进行染色！令狐文艳染色步骤PI(Propidium Iodide碘化丙啶)染色:是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测. 碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料(红色），它不能透过完整的细胞膜，但凋亡中晚期的细胞和坏死细胞由于细胞膜通透性的增加，PI 能够透过细胞膜而使细胞核染红.用PI 单一染色观测培养细胞，只能表示细胞的坏死情况，而不是凋亡（当然晚期凋亡PI亦可着色）。
但是如果您只是想知道细胞的死亡情况，而不是仔细区分坏死或凋亡，那么PI单一染色也可以。
但是如果您一定要认定细胞的凋亡，那么PI单一染色显然不够！annexin-v染色细胞凋亡早期,细胞膜标志发生改变.其中,磷脂酰丝氨酸(Annexin-V,PS)外翻 ,Annexin-V 在Ca+存在的条件下与其高亲和力特异性结合.这样,Annexin-v 染色阳性,表示细胞处于早期凋亡状态.Annexin-V结合不同的荧光抗体,就可以利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。
Annexin V用FITC标记发绿色荧光；如果用PE标记就发红色荧光。
JC-1染色 JC-1是一种阳离子染料，可以在线粒体内聚集，低浓度时主要以单体(monomer)存在，发射光以绿光(～525nm)为主；而在高浓度时则可以形成多聚体(aggregation)，发射光以红光(-590nm)为主。
石蜡切片免疫荧光染色方法
石蜡切片免疫荧光染色方法1.组织固定将待染的组织标本取出，用生理盐水或磷酸盐缓冲液进行冲洗，以去除血液和其他污染物。
然后用组织固定剂（如4%的多聚甲醛）进行固定，时间一般为12-24小时。
固定后，将组织转移到30%蔗糖缓冲液中，保持在4°C下过夜。
2.组织包埋将固定后的组织进行脱水和透明化处理。
首先用70%乙醇进行脱水，然后使用95%和100%的乙醇进行脱水，每个浓度的乙醇浸泡时间为30分钟。
接下来，用细胞脱水剂（如xylene）进行透明化处理，每次浸泡30分钟。
最后，将组织置于石蜡中，使其逐渐浸透，浸泡时间一般为12-24小时。
3.组织切片将石蜡浸透的组织取出，固定在切片架上。
使用旋转切片机将组织切成5-10微米厚的切片。
切好的切片用除去石蜡的溶剂（如xylene）处理，然后通过悬浮在磷酸盐缓冲液中移至玻璃切片上。
4.抗原修复在切片上涂抹抗原修复液，将其加热至适当温度进行修复，以恢复组织中的抗原活性。
不同的修复条件适用于不同的抗原修复液，一般修复温度为95°C，时间为20-30分钟。
修复后，将切片用磷酸盐缓冲液冲洗数次。
5.抗体染色在切片上涂抹首要抗体（抗体与所要检测的抗原有特异性结合）。
将切片置于湿润箱中，室温孵育1小时，或在4°C下孵育过夜。
然后，用PBS缓冲液冲洗切片，以去除未结合的抗体。
接下来，涂抹荧光标记的二抗（与首要抗体结合的二抗），并孵育30分钟。
6.荧光显微镜观察将切片加装到玻璃片上，并用适当的荧光封装剂封盖。
使用荧光显微镜观察切片，观察和记录荧光信号和组织结构。
注意事项：1.在操作过程中，要严格避免组织检测和悬浮液受到光照。
2.切片机和刀片必须保持清洁和尖锐，以确保切片的质量。
3.在染色过程中，要注意温度和时间的控制，以保证染色效果。
4.切片和显微镜观察时，要确保显微镜的光源和滤光片与所使用的荧光标记相匹配。
5.进行染色之前，要检查抗体的适用性和浓度，以确保染色结果的准确性和可靠性。
免疫荧光染色步骤
免疫组织化学染色步骤1．将石蜡切片二甲苯脱蜡（二甲苯Ⅰ20min→二甲苯Ⅱ10min）、入水（100%酒精Ⅰ5min→100%酒精Ⅱ3min→95%酒精2min→80%酒精1min→70%酒精1min），蒸馏水冲洗后，0.01M PBS冲洗，5min×3次；2．枸橼酸盐缓冲液微波抗原修复，加热使水温达92-96℃，维持10-15min，自然冷却至室温，0.01M PBS冲洗，5min×3次；3．3%H2O2溶液，37℃，20 min，以消除内源性过氧化物酶的活性，0.01M PBS 冲洗，5min×3次；4．正常羊血清封闭，37℃，30 min；5．倾去多余血清，滴加一抗，37℃2小时或者4℃过夜，0.01M PBS冲洗，5min×3次；6．滴加二抗工作液，37℃，30 min，0.01M PBS冲洗，5min×3次；7．滴加三抗工作液，37℃，30 min，0.01M PBS冲洗，5min×3次；8．DAB避光显色，显微镜下控制显色时间；9．0.01M PBS终止显色；10．梯度酒精脱水（70%酒精1min→80%酒精1min→95%酒精Ⅰ1min→95%酒精Ⅱ1min→无水酒精Ⅰ10min→无水酒精Ⅱ10min），二甲苯透明（二甲苯Ⅰ15min →二甲苯Ⅱ10min；11．中性树胶封片。
免疫荧光染色步骤(1)将组织切片脱蜡入水；(2)抗原微波修复，温度92℃-96℃，10-15min，自然冷却至室温；(3)正常羊血清封闭，37℃，60 min；(4)倾去多余血清，滴加一抗，37℃2小时或者4℃过夜，PBS冲洗，5min×3次；(5)滴加荧光素标记的二抗，避光，37℃，60 min，0.01M PBS冲洗，5min×3次；(6)防淬灭封片剂封片，4℃，避光保存。
(7)荧光显微镜观察拍照。
细胞免疫组化染色（培养板中染色）1．培养的细胞，弃去培养基，冷的PBS洗两次，首先用4%多聚甲醛（4孔板200μl）固定10min，PBS洗2次，每次5－10分钟。
石蜡切片免疫组化实验方法
石蜡切片免疫组化实验方法预处理：1.收集组织样品：选择实验需要的组织样品，如病变组织或动物组织，固定在4%的中性缓冲福尔马林溶液中，通常时间为24小时。
2.脱水：将固定的组织样品进行脱水处理，使用升级的乙醇浓度，如70%乙醇、85%乙醇和95%乙醇各浸泡5-10分钟，然后在无水乙醇中浸泡2-3次，每次浸泡时间为10分钟。
3.渗透剂处理：将组织样品置于染料渗透剂（如苯酚甲醛、苯酚）中进行渗透处理。
渗透剂的选择根据实验需要的类型来确定。
4.包埋：将已经渗透处理的组织样品放入合适大小的模具中，加入石蜡进行包埋，通常使用两次石蜡浸渍15-20分钟，然后定位标本，放入包埋模具中。
切片：1.切片机调节：根据具体的切片机和刀片的不同，调节适当的角度和切片速度。
2. 切片：将包埋好的组织块放入切片机的切片盘中，以适当的角度切出厚度约为4-6um的石蜡切片，切片时需要保持刀片的清洁，避免刮伤组织。
3.切片回收：使用刀片回收装置将切下的切片轻轻回收至水中，再将切片转移到预处理盒中。
染色：1. 去蜡：将石蜡切片放入脱蜡溶液（如xylene）中进行脱蜡处理，每个浸泡站点持续3-5分钟。
2.脱水：将石蜡切片从脱蜡溶液中取出，放入浓度递减的乙醇溶液中，分别浸泡5分钟，如95%乙醇、70%乙醇和纯水。
3.抗原修复：为恢复组织切片的抗原表位，可以选择酶消化、高压加热或微波处理等方法来进行抗原修复，常用的抗原修复方法包括热处理和酶切法。
4.屏障消除：为了阻止非特异性结合，需要进行屏障消除，使用5%非脂干奶粉或血清进行预阻断，通常需要在37°C孵育1小时。
5.一抗处理：将相应的一抗加入切片上，覆盖玻璃片，通常需要在4°C下孵育过夜。
6.洗涤：用洗涤缓冲液对切片进行洗涤，通常重复3次，每次5分钟。
7.二抗处理：将荧光标记的二抗加入切片上，覆盖玻璃片，通常需要在室温下孵育1小时。
8.洗涤：用洗涤缓冲液对切片进行洗涤，通常重复3次，每次5分钟。
石蜡切片免疫组化染色步骤
加入洗脱液一定量后，荧光抗体即向下移行，逐渐与存留于上端的游 离荧光素之间拉开明显的界线，随着大量洗脱液的不断加入，二者分 离距离越来越大，荧光抗体最先流出，分前、中、后三部分收集，测 F/P 比值，合格者合并，浓缩，分装。洗脱液用 20%磺基水杨酸测定 蛋白（发生沉淀反应） ，继续洗脱，游离荧光素则相继被洗脱下来， 至洗脱液中无蛋白和荧光素后，此层析柱即可再用。 若用以除去荧光抗体中的游离荧光素和硫酸铵等盐类， 可先在过 柱前透析一夜， 否则， NH4+太浓， 在蛋白未完全洗脱时即出现 NH4+， 因而影响提纯与回收蛋白，一般待洗脱液出现蛋白时，即进行收集， 之后出现 SO4++ （用 1%BaCl2 检查发生白色沉淀） 。 最后是 NH4+， （用 纳氏试剂检查呈黄棕色沉淀） ，待洗脱液无 SO4++及 NH4+后可再用。 如仅用小量荧光抗体， 可用 1×20cm 的柱层析柱， 取 2g Sephadex G-50 装柱，即可过滤 2～3.5ml 荧光抗体。 （四）DEAE 纤维素柱层析法 标记过多或过少荧光素的抗体分子可用 DEAE-纤维素柱层析法除 去。方法如下： DEAE-纤维素柱的装柱，洗脱、再生方法等与提纯 IgG 方法相同。 装柱所需 DEAE-纤维素量以干重每克交换 20～50mg 标记蛋白量为宜。 常用梯度洗脱法如下： （1）层析柱用 0.01mol/L、pH7.2PB 平衡，标记物上柱后，先用 0.01mol/L、pH7.2PB 洗脱，洗出无色或淡绿色液体，洗脱液量（根据 床体积大小每梯度乘 3） ，然后依下列各种离子强度洗脱液，分别洗
石蜡切片免疫荧光技巧
石蜡切片免疫荧光技巧
石蜡切片免疫荧光技术是一种常用的免疫组织化学方法，用于检测或定位特定抗原在组织样本中的分布情况。
以下是石蜡切片免疫荧光技术的步骤：
1. 组织固定和包埋：将组织样本固定在含有4%的缓冲甲醛中，以保持其形态和结构。
之后，将组织样本包埋在去离子石蜡中，以增加其硬度和切片的稳定性。
2. 去除蜡并切片：用刀片将固定和包埋的组织样本切割成薄片，通常为4-10微米厚。
3. 抗原解蜡：将蜡切片浸泡在去蜡溶液中，以去除蜡，并将其进行再水化，以恢复组织的水合状态。
4. 抗原检测：用适当的抗体与特定的抗原结合。
首先，用一种可以结合到抗原的初级抗体处理组织切片。
然后，使用荧光标记的二级抗体结合到初级抗体上，从而使标记可见。
5. 荧光显微镜观察：使用荧光显微镜观察组织切片，并通过选择合适的滤光片来检测和分析特定抗原的荧光信号。
不同的荧光染料可用于标记不同的抗原，以实现多重标记和多抗体检测。
石蜡切片免疫荧光技术具有高度的灵敏性和特异性，可用于检测和研究生物标志物在各种疾病和组织中的分布和表达水平。
石蜡切片免疫荧光实验步骤
石蜡切片免疫荧光实验步骤1、脱蜡至水：将组织切片室温放置10min后，依次将石蜡切片放入二甲苯3min→无水乙醇5min—85%酒精5min—75%酒精5min—ddH2O洗5min。
2、抗原修复：组织切片置于盛满柠檬酸抗原修复液（50X稀释至1X使用)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复（中火8min—停火8min—中低火7min）。
此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。
自然冷却后将玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min（具体修复液和修复条件根据组织来确定）。
3、画阻水圈：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈，防止液体流失。
4、BSA封闭：在圈内滴加3%-5%浓度BSA孵育30min（或二抗同源血清封闭）。
5、一抗孵育：轻轻甩干封闭液，在切片上滴加按一定比例配好的一抗（溶于血清：PBS=1:19的抗体稀释液体系中），切片平放于湿盒（内加少量水防止抗体蒸发），4°C过夜。
6、二抗孵育：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
切片稍甩干后在圈内滴加相应的荧光二抗，覆盖组织，避光RT孵育50min。
7、DAPI染核：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光RT孵育3-5min。
8、树脂封片：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
切片稍甩干后用树脂封片剂封片（其间可滴加少量抗荧光淬灭剂）。
9、镜检拍照：切片于荧光显微镜/confocal/活细胞工作站中观察并采集图像（DAPI紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm，发蓝光；FITC激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm，发绿光；CY3激发波长510-560，发射波长590nm，发橙光；CY5发红光）。
10、结果判读：DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，阳性表达为相应荧光素标记的红光或者绿光，图片处理需使用Image J 软件。
石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法之令狐文艳创作
石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法令狐文艳1、组织的采集、固定和保存：采取组织后，方法一：4%多聚甲醛（4%PFA）4 C 固定1小时（根据组织大小和致密程度调整固定时间）或过夜方法二：采用bouin’s固定RT 2h（6-8d tesis）or RT 过夜（成年 tesis）PBS缓冲液洗三次，每次5min，4C保存于70%乙醇中。
2、组织的包埋、切片、展片及保存：：固定后的样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，52-54C 石蜡包埋，常规切片，切片厚 4 -10m，贴于处理过的干净载玻片上，37C烤片过夜，之后收集于载片盒中，RT 密封保存。
石蜡包埋：保存于4 C 70%乙醇中的组织样品80%乙醇 15 min95%乙醇 15 min100%乙醇 15min 21/2乙醇1/2二甲苯 15 min二甲苯透明 5-10 min1/2二甲苯1/2石蜡 30 min石蜡（1） 1.5hr石蜡（2） 1.5-2.5hr石蜡（3）包埋RT保存3、石蜡组织切片的免疫组化方法：密封保存于RT的组织切片二甲苯(1) 20 min二甲苯(2) 20 min100%乙醇20min95%乙醇10 min80%乙醇10 min通风橱晾干，阻水笔在组织周围画圈切片在PBS中浸泡 5 min*20.4%Tritonx RT 10 min切片在PBS中浸泡 5 min*33%H2O2 RT 10min切片在PBS中浸泡 5 min*30.25%胰酶RT 10min切片在PBS中浸泡 5 min*3Blockingbuffer(3%BSA+5%NGS+0.2%Tritonx-100 in PBS) RT 60min倾去blocking buffer，勿洗一抗4 C overnightin blocking buffer取出切片复温1h，切片在PBS 中浸泡 5 min*3二抗in blocking buffer GAR1：200 （GAM1：100），RT 1h切片在PBS中浸泡 5 min*3DAB显色5-10min（50微升A+50微升B+900微升PBS+5微升3%H2O2）如果是增强型DAB只要1min即可。
石蜡切片免疫荧光实验步骤
石蜡切片免疫荧光实验步骤
一、样品处理
1、选择适当体积的样品石蜡切片，防止干燥，封好盖子到-80℃，直
到使用时将其取出变性到室温，以备后续操作。
2、室温下取出石蜡切片，施加蛋白酶将切片上原有的细胞、细胞膜
分解，具体操作步骤为：将取出的石蜡切片放入0.1%胰蛋白酶(Protease，Roche)或0.5% Triton X-100溶液中，置于37℃水浴摇床，25min后将石
蜡切片放入3mm×2mm的转移槽内，加入200ul去离子水，搅拌进行超声
处理，30s后用1000ul去离子水冲洗，放入4℃冰箱保存，以备后续操作。
二、组织切片染色
1、在刻线玻片上放入石蜡切片，用吸水棉柱将石蜡切片固定。
2、用0.1%胰蛋白酶(Protease, Roche)或0.3% Triton X-100溶液
浸泡石蜡切片，置于37℃水浴摇床，15min后去除液体，另用500μl去
离子水洗涤，将含有抗体的抗体溶液稀释至0.3μg/ml，加入石蜡切片上，放入35℃恒温箱，反应1h。
3、取出石蜡切片，加入1000μl去离子水洗涤，放入4℃冰箱保存，以备后续操作。
三、免疫荧光检测
1、把石蜡切片放入适量的去离子水中浸泡，去除多余的抗体。
2、将放入去离子水中浸泡的石蜡切片放入多孔玻片，在摇床上稀释FITC标记的抗体，加入石蜡切片上，置于37℃水浴摇床上，1h后去除液体。
最新石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法整理
石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法1、组织的采集、固定和保存：采取组织后，方法一：4%多聚甲醛（4%PFA）4C 固定1小时（根据组织大小和致密程度调整固定时间）或过夜方法二：采用bouin’s固定RT 2h（6-8d tesis）or RT 过夜（成年tesis）PBS缓冲液洗三次，每次5min，4C保存于70%乙醇中。
2、组织的包埋、切片、展片及保存：：固定后的样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，52-54C石蜡包埋，常规切片，切片厚4 -10m，贴于处理过的干净载玻片上，37C烤片过夜，之后收集于载片盒中，RT密封保存。
石蜡包埋：保存于4C 70%乙醇中的组织样品80%乙醇15 min95%乙醇15 min100%乙醇15min 21/2乙醇1/2二甲苯15 min二甲苯透明5-10 min1/2二甲苯1/2石蜡30 min石蜡（1） 1.5hr石蜡（2） 1.5-2.5hr石蜡（3）包埋RT保存3、石蜡组织切片的免疫组化方法：密封保存于RT的组织切片二甲苯(1) 20 min二甲苯(2) 20 min100%乙醇20min95%乙醇10 min80%乙醇10 min通风橱晾干，阻水笔在组织周围画圈切片在PBS中浸泡 5 min*20.4%Tritonx RT 10 min切片在PBS中浸泡 5 min*33%H2O2 RT 10min切片在PBS中浸泡 5 min*30.25%胰酶RT 10min切片在PBS中浸泡 5 min*3Blocking buffer(3%BSA+5%NGS+0.2%Tritonx-100 in PBS) RT 60min倾去blocking buffer，勿洗一抗4C overnight in blocking buffer取出切片复温1h，切片在PBS中浸泡 5 min*3二抗in blocking buffer GAR1：200 （GAM1：100），RT 1h切片在PBS中浸泡 5 min*3DAB显色5-10min（50微升A+50微升B+900微升PBS+5微升3%H2O2）如果是增强型DAB只要1min即可。
石蜡切片及免疫荧光
一、石蜡切片1. 固定：将新鲜组织切成小块，固定于4%多聚甲醛过夜。
凝固组织中的物质成分，尽可能保持其活体时的结构。
同时能使组织硬化，有利于切片的进行。
2.脱水：为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行经70%、85%、95%直至纯酒精（无水乙醇），每次时间为1小时。
固定后的组织材料需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响后期的染色效果。
3.透明：常用的透明剂有二甲苯，二甲苯是石蜡的溶剂。
纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的溶剂，替换出组织内的酒精。
材料块在透明剂浸渍过程称透明。
4.浸蜡：先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1小时。
先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍1小时左右。
5.包埋：以少许热蜡液将其底部迅速贴附于包埋盒内上，然后置于速冻台，让石蜡固定。
6.切片：切片刀的锐利与否、蜡块硬度是否适当都直接影响切片质量，可将蜡块至于冷水中改变蜡块硬度。
通常切片厚度为3-5um，用毛笔轻托轻放在37度水浴中展片。
7.贴片与烤片：一般使用恒温水浴锅，温度控制在37-40℃左右，有利于石蜡切片的展开，贴好的切片置于60℃恒温箱内干燥2小时，蛋白质凝固后即可染色。
8.切片脱蜡及水化：干燥后的切片置于二甲苯中进行脱蜡，然后依次使用从高浓度到低浓度递减的顺序进行经纯酒精、95%、85%、70%进行水化。
9.染色：经典的苏木精和伊红：细胞核被苏木精染成紫蓝色，多数细胞质及非细胞成分被伊红染成粉红色。
实验操作简单。
免疫组化：指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应。
二、冰冻切片1.取材：应尽可能快地采取新鲜的材料，防止组织发生死后变化。
2.速冻：1）将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm）。
2）如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内。
3）当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。
切片免疫荧光操作流程
切片免疫荧光操作流程
朋友！今天来跟您唠唠切片免疫荧光这档子事儿。
咱先说说准备工作哈，这可太重要啦！您得把那些个实验器具都准备齐全咯，像啥切片刀啊、荧光抗体啊，一个都不能少。
我跟您说，我刚开始弄的时候，就因为少准备了个东西，那叫一个抓瞎！唉！
然后呢，就是切片制作啦。
这可得小心着点儿，就跟绣花似的，得细致！我记得有一回，我手一抖，那切片就毁啦！不过别担心，多练几次就好。
接下来是染色步骤，这可有点讲究。
您得把抗体加得恰到好处，多了少了都不行。
我当初就老是掌握不好这个量，折腾了好久才摸清门道。
嗯...
还有啊，孵育的时候得控制好温度和时间。
我记得好像有一次，我把时间给弄长了，结果那效果，惨不忍睹哇！
对啦，操作过程中您可得注意安全，别像我之前似的，不小心把试剂弄洒了，那味道，啧啧啧！
我这又扯远啦！说回正题，免疫荧光染色完了之后，观察结果也很重要。
您得瞪大眼睛，仔细瞅瞅，别放过任何一个小细节。
我跟您说，这切片免疫荧光啊，刚开始学的时候真是让人头疼，我那会天天琢磨，觉都睡不好。
不过现在，嘿我也算轻车熟路啦！
这当中还有好多小窍门呢，比如在染色的时候加点这个，效果能更好。
但我也不敢保证每次都灵，毕竟实验这东西，有时候就是让人捉摸不透。
要是您在操作过程中遇到啥问题，别着急，慢慢来，我当年不也是这么过来的嘛！
好啦，我能想到的暂时就这么多，剩下的就靠您自己摸索啦！加油哦！。
如何用石蜡切片做出高质量组化和荧光图之经验
[原创] 如何用石蜡切片做出高质量免疫组化和免疫荧光图之经验组织病理染色是我们做研究经常需要用到的实验技术，是基本的实验室技术之一。
很多人都认为病理染色相对Western blot（之前我也专门写了一篇经验贴）来说更容易出结果，这一点我不否认，但要想做出一张漂亮的图还是有点难度的，尤其是免疫荧光。
本人在这方面算得上是有点经验，做出来的图片受到导师和同学们的一致认可。
今天我就跟大家分享一下我艰辛摸索出来的经验。
我将从取材部分开始讲，到显微镜拍片结束。
由于我是基本只做中枢神经系统的研究，所以下面以鼠脑为例。
一、取材1、物品试剂准备：生理盐水或PBS（每只小鼠80ml），4%多聚甲或者10%中性福尔马林（每只小鼠100ml），麻药，250ml玻璃烧杯两个，泡沫箱两个，泡沫箱盖子一个，1ml注射器一个，20ml注射器两个，7号头皮针一个，大头针四个，止血弯钳（12.5cm）两把，组织剪一把（25cm），眼科剪一把，眼科弯镊一把，10mlEP管若干（一个鼠脑一管，提前装好固定液）。
2、取材步骤心脏灌注首先是麻醉小鼠。
等待麻醉诱导时把两个烧杯分别装上生理盐水和多聚甲，然后将烧杯半埋在冰中预冷。
麻醉后用大头针将小鼠固定于泡沫箱盖子上（用组织剪戳个洞，用以引流灌注出来的废液至泡沫箱中），暴露小鼠胸腔和心脏（用止血钳固定，用组织剪剪皮和开胸），注意别剪破肝脏和肺脏了，暴露后持止血弯钳稍微用力夹住一点心尖部（不要锁死钳子,留出进针的缝隙），微微用力向上提，仔细看心尖两侧颜色深浅，较浅那边是左心室部分，然后用头皮针（剪断针尖斜面，以防戳穿心底，提前接上装满生理盐水的注射器并赶走导管中的气泡）从心尖沿着左心室的长轴进针，全神贯注体会手感，当刚好有突破感时再进一点点，这时锁死止血钳。
然后用眼科镊夹起右心耳，并以眼科剪剪破之，见暗红的血涌出，接着手推注射器活塞，大概半分钟推完20ml生理盐水，连推4管，这期间观察肝脏颜色、肺脏大小及口鼻有无渗液。
免疫荧光染色步骤
免疫组织化学染色步骤1．将石蜡切片二甲苯脱蜡（二甲苯Ⅰ20min→二甲苯Ⅱ10min）、入水（100%酒精Ⅰ5min→100%酒精Ⅱ3min→95%酒精2min→80%酒精1min→70%酒精1min），蒸馏水冲洗后，0.01M PBS冲洗，5min×3次；2．枸橼酸盐缓冲液微波抗原修复，加热使水温达92-96℃，维持10-15min，自然冷却至室温，0.01M PBS冲洗，5min×3次；3．3%H2O2溶液，37℃，20 min，以消除内源性过氧化物酶的活性，0.01M PBS 冲洗，5min×3次；4．正常羊血清封闭，37℃，30 min；5．倾去多余血清，滴加一抗，37℃2小时或者4℃过夜，0.01M PBS冲洗，5min×3次；6．滴加二抗工作液，37℃，30 min，0.01M PBS冲洗，5min×3次；7．滴加三抗工作液，37℃，30 min，0.01M PBS冲洗，5min×3次；8．DAB避光显色，显微镜下控制显色时间；9．0.01M PBS终止显色；10．梯度酒精脱水（70%酒精1min→80%酒精1min→95%酒精Ⅰ1min→95%酒精Ⅱ1min→无水酒精Ⅰ10min→无水酒精Ⅱ10min），二甲苯透明（二甲苯Ⅰ15min →二甲苯Ⅱ10min；11．中性树胶封片。
免疫荧光染色步骤(1)将组织切片脱蜡入水；(2)抗原微波修复，温度92℃-96℃，10-15min，自然冷却至室温；(3)正常羊血清封闭，37℃，60 min；(4)倾去多余血清，滴加一抗，37℃2小时或者4℃过夜，PBS冲洗，5min×3次；(5)滴加荧光素标记的二抗，避光，37℃，60 min，0.01M PBS冲洗，5min×3次；(6)防淬灭封片剂封片，4℃，避光保存。
(7)荧光显微镜观察拍照。
细胞免疫组化染色（培养板中染色）1．培养的细胞，弃去培养基，冷的PBS洗两次，首先用4%多聚甲醛（4孔板200μl）固定10min，PBS洗2次，每次5－10分钟。
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对于石蜡切片：
1、
令狐文艳
2、烤片：60℃60分钟
3、脱蜡：二甲苯中Ⅰ脱蜡15分钟→二甲苯Ⅱ脱蜡15分
钟→无水乙醇Ⅰ5分钟
→无水乙醇Ⅱ5分钟→90%乙醇Ⅰ5分钟→90%乙醇Ⅱ5分钟→70％乙醇5分钟
→蒸馏水5分钟→蒸馏水5分钟。
3、抗原修复：高压修复，事先烧开锅中的水，修复盒中加入0.01mol/l柠檬酸钠，pH6.0(柠檬酸三钠 3g,柠檬酸0.4g加入1000ml蒸馏水中)，上汽后加热10分钟，关火。
修复盒取出，放入装有自来水的瓷缸中缓慢冷却至室温。
2. 去除内源性酶：玻片取出放入湿盒，加3%H2O22(2ml
H2O22加入18ml蒸馏水中，现配现用，避光)，室温孵育10分钟，PBS洗3次，每次5分钟。
（也可不用去除内源性酶）。
3. 封闭(Blocking) 加10%正常驴血清（原液100ul+900ulPBS,1ml够用30张片子），室温孵育封闭30分钟。
如果背景较高，可以4℃封闭过夜。
不用洗，用滤纸吸干周边水分。
从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。
4. 一抗孵育(Primary antibody
incubation) 参考一抗的说明书，按照适当比例用免疫染色一抗稀释液（10%山羊血清PBS或1%BSA-PBS）稀释一抗。
立即加入稀释好的一抗， 4℃过夜，第二天取出复温45分钟。
PBS洗3次，每次5分钟。
5. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation) 按照适当比例用免疫荧光染色二抗稀释液稀释荧光标记的二抗，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。
PBS洗涤3次。
每次5分钟。
如果结果背景较高，可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
6. 蛋白检测(Detection of proteins) 对于免疫荧光染色，此时已经可以直接到荧光显微镜下观察。
7. 复染
用DAPI对细胞核进行染色，室温10分钟，PBS冲洗5分钟×3次，封片（封片剂或分析纯的甘油与0.5molpH9.5碳酸缓冲液1：1混合）显微镜观察，染色后为蓝色荧光。
多重荧光染色：可使用红色荧光、绿色荧光和蓝色荧光进行三重荧光染色。
例如用免疫荧光染色试剂盒-抗小鼠Cy3(P0193)进行红色荧光染色，随后可以用免疫荧光染色试剂盒-抗兔FITC(P0186)进行绿色荧光染色，在完成上述两种染色后可以使用Hoechst染色试剂盒(C0003)对细胞核进行染色，染色后为蓝色荧光。
0.5molpH9.5碳酸缓冲液配方：
NaHCO3 3.7g
Na2CO3 0.6g
双蒸水溶解至100ml，调节pH至9.5。