一种安全制备活化琼脂糖树脂的方法
制作琼脂糖凝胶的步骤
制作琼脂糖凝胶的步骤
嘿，朋友们！今天咱来唠唠制作琼脂糖凝胶的那些事儿。
你可别小瞧这琼脂糖凝胶，它就像是一个神奇的舞台，能让各种分子在上面尽情表演呢！
首先，咱得准备好材料呀，琼脂糖那肯定是主角啦，还有电泳缓冲液，就像给演员准备的合适氛围一样。
然后呢，把琼脂糖称好重量，放进锥形瓶里。
这就好比给演员搭好了舞台架子。
接着加上适量的电泳缓冲液，就像是给舞台布置好了灯光和音效。
接下来，把锥形瓶放在微波炉里加热，让琼脂糖彻底融化。
这时候啊，就好像舞台上的灯光开始闪烁，气氛热烈起来啦。
等琼脂糖完全融化成透明的液体，哇哦，那可真是神奇的一刻。
趁热赶紧把这液体倒进模具里，这就像是让演员赶紧上台表演啦。
倒的时候可得小心点，别弄得到处都是。
倒好后，把模具放在水平的地方，让它慢慢冷却凝固。
这等待的过程就像是幕布缓缓拉起，精彩即将呈现。
等它凝固好了，一块完美的琼脂糖凝胶就诞生啦！就像舞台搭建成功，演员们可以开始尽情展现自己啦！
你想想，在这个凝胶上，各种分子会按照它们的特性跑来跑去，多
有意思呀！
哎呀，制作琼脂糖凝胶是不是挺简单的，但每一步可都不能马虎哟！要是哪个环节出了差错，那可就像舞台上出了状况，表演可就不完美啦。
所以啊，大家在制作的时候一定要细心细心再细心，就像呵护珍贵
的宝贝一样。
这样制作出来的琼脂糖凝胶才能发挥它最大的作用呀！
怎么样，听我这么一说，是不是觉得制作琼脂糖凝胶也没那么难啦？赶紧去试试吧！。
琼脂糖凝胶制备材料
琼脂糖凝胶制备材料琼脂糖凝胶是一种常用的实验室材料，它具有良好的凝胶性能和稳定性，在许多领域都有广泛的应用。
本文将介绍琼脂糖凝胶制备材料的方法和应用。
一、琼脂糖凝胶的制备方法琼脂糖凝胶的制备方法主要分为两步：制备琼脂糖溶液和凝胶化。
1. 制备琼脂糖溶液制备琼脂糖溶液的材料包括琼脂糖粉和适量的溶剂，如蒸馏水或缓冲液。
将适量的琼脂糖粉加入溶剂中，搅拌均匀，然后加热至溶解。
注意控制溶解温度，避免过高的温度破坏琼脂糖的凝胶性能。
2. 凝胶化在制备好的琼脂糖溶液中加入所需的样品或试剂，搅拌均匀后，将溶液倒入培养皿或其他容器中，静置冷却即可凝胶化。
凝胶化的时间和温度可以根据需要进行调节。
二、琼脂糖凝胶的应用琼脂糖凝胶在生物学、生物化学和分子生物学等领域有广泛的应用。
1. 蛋白质电泳琼脂糖凝胶电泳是一种常用的分离和纯化蛋白质的方法。
通过改变琼脂糖凝胶的浓度和孔径，可以实现对不同大小和电荷的蛋白质的分离。
2. DNA凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳也可用于分离和纯化DNA。
根据DNA片段的大小，可以选择不同浓度和孔径的琼脂糖凝胶，实现对DNA片段的分离和纯化。
3. 细胞培养琼脂糖凝胶可以作为细胞培养基的固化剂，用于固定和支持细胞的生长。
通过调节琼脂糖凝胶的浓度和硬度，可以模拟不同的组织环境，研究细胞的形态和功能。
4. 药物释放系统将药物包裹在琼脂糖凝胶中，可以制备出缓释药物的系统。
琼脂糖凝胶具有良好的保水性和稳定性，可以控制药物的释放速率，提高药物的疗效。
5. 组织工程琼脂糖凝胶可以作为组织工程材料，用于构建人工组织和器官。
通过调节琼脂糖凝胶的孔径和结构，可以提供细胞生长的支架，并模拟组织的生理环境。
琼脂糖凝胶是一种重要的实验室材料，具有多种应用。
通过制备琼脂糖溶液和凝胶化，可以方便地使用琼脂糖凝胶进行蛋白质电泳、DNA凝胶电泳、细胞培养、药物释放系统和组织工程等实验。
这些应用为科学研究和医学发展提供了有力的支持。
赛默飞世尔科技免疫沉淀技术指南和实验方案说明书
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IP、Co-IP 和 Pull-Down 实验的通用介绍
A. 免疫沉淀 (IP)
最早的免疫沉淀方法，是将放射性前体 ( 如氨基酸 ) 加入细胞培养基中，使得细胞在生长的过程中，总蛋白可以直接 被标记。裂解细胞后，利用固定在微珠支持物上的特异抗体，从蛋白混合物中纯化获得抗原。纯化所得抗原用 SDSPAGE 分离后，再通过放射自显影，将凝胶上的放射性信号显示到胶片上。
这种放射性免疫检测方法仍在使用，但有关放射性材料使用的安全性、监管和成本问题促进了非同位素方法的开 发。不同于预先标记抗原，现在更常见的方法是从裂解物中纯化抗原，采用 SDS-PAGE 分离，然后转印至膜上进行 Western Blotting 检测。灵敏的化学发光底物的问世，意味着该方法可以轻松达到与放射性技术相当的灵敏度，在抗 体亲和力一致的条件下，提供了更高的特异性。
琼脂糖凝胶制备方法
琼脂糖凝胶制备方法嘿，朋友们！今天咱就来唠唠琼脂糖凝胶制备这档子事儿。
你可别小瞧这琼脂糖凝胶，它在好多实验里那可是大功臣呢！就好像是一个魔法盒子，能把各种分子按照我们的意愿分离开来。
首先呢，得准备好材料。
琼脂糖，这可是主角儿，就像做饭得有米一样。
还有电泳缓冲液，这就好比是给主角搭戏的配角，少了它可不行。
然后就是动手操作啦！先把琼脂糖称好重量，小心翼翼地放到锥形瓶里。
哎呀，这时候可不能马虎，多一点少一点都会影响效果的。
接着，加入适量的电泳缓冲液，就像给主角泡个舒服的澡。
之后呢，把锥形瓶放到微波炉里加热。
嘿，这就像是给它们来个高温桑拿，让琼脂糖彻底融化。
加热的时候可得盯着点，别加热过头了，不然可就糟糕啦！等琼脂糖完全融化后，稍微晾凉一会儿，可别烫着自己的手呀。
接着，就是把融化的琼脂糖溶液倒进模具里啦。
这就像是给蛋糕倒面糊一样，得均匀倒进去，不能一边厚一边薄的。
倒完后，让它自然冷却凝固，这时候就耐心等等吧，就像等花儿开放一样。
等凝胶凝固好了，就可以把它从模具里取出来啦。
哇，这时候看着自己亲手做的琼脂糖凝胶，是不是很有成就感呢？在这个过程中，每一步都很关键呀！就像盖房子，一块砖没砌好可能房子就不牢固。
咱做琼脂糖凝胶也是一样，每一个细节都得注意到。
要是有一步出了差错，那可能整个实验就没法顺利进行啦。
你说这琼脂糖凝胶制备是不是很有意思？虽然过程不复杂，但是需要我们的细心和耐心呀。
想想看，通过我们的努力，做出了一块完美的琼脂糖凝胶，能为实验提供有力的支持，这感觉多棒呀！所以呀，大家别害怕尝试，大胆地去做，就一定能成功的。
就像那句话说的，世上无难事，只怕有心人嘛！加油哦，朋友们！让我们一起在琼脂糖凝胶制备的道路上越走越远，为科学实验贡献我们的力量！。
琼脂糖微球的制备及活化条件研究
摘要一般说来，琼脂糖磁性微球活化度越高，能连接的亲和配位体就越多，用其吸附纯化蛋白质及固定化酶效率就越高。
本实验研究了用环氧氯丙烷活化琼脂糖磁性微球的最优条件。
实验先用反相悬浮包埋法制备出琼脂糖磁性微球，微球因内部含有磁性四氧化三铁的超细粉末而具有磁响应性。
以微球表面的环氧基密度作为活化度的度量，考察了NaOH浓度、环氧氯丙烷体积分数、NaBH4的浓度、活化温度和活化时间等因素对琼脂糖磁性微球活化反应活化度的影响，得到了最佳活化条件为：NaOH溶液浓度为0.9mol/L，环氧氯丙烷体积分数为40%，NaBH4的浓度为0.5g/L，活化温度为40℃，活化时间为4h。
用环氧氯丙烷活化的载体稳定性好，且可提供相当于3个碳原子间距的空间臂。
本文还研究过相似活化步骤和条件下，改用1,4-丁二醇二缩水甘油醚做活化剂，但未能成功活化琼脂糖磁性微球，该研究尚待进一步开展。
关键词：琼脂糖磁性微球活化AbstractGenerally speaking, the higher the activation degree of agarose magnetic microspheres is, the more affinity ligands can be grafted. So that the adsorptive capacity of microspheres for protein purification and the efficiency of immobilized enzyme can be higher. This paper investigated optimal conditions for the activation of agarose magnetic microspheres, using epichlorohydrin as activating agent. Firstly, agarose magnetic microspheres were prepared by reverse suspended embedding method. The microspheres possessed magnetic responsibility because of the interior Fe3O4ultrafine powder. The effects of sodium hydroxide concentration，epichlorohydrin volume fraction，NaBH4 concentration，activation temperature and activation time on activation degree were investigated，according to the density of surface epoxy group .The optimal conditions are obtained as followed：sodium hydroxide concentration，epichlorohydrin volume fraction，NaBH4 concentration ，activation temperature and activation time is 0.9 mol/L, 40%, 0.5 g/L, 40 ℃, 4 h, respectively. The carrier activated by epichlorohydrin can be of good stability and has 3 carbon atom space arm. This paper also studied the activation of agarose magnetic microspheres using 1, 4-butyl glycol two glycidyl ether as activating agent. The experiments in which agarose magnetic microspheres were failed to be activated were operated under similar methods and conditions. The relevant researches are yet to be further developed.Keywords：Agarose; magnetic microspheres; activation目录摘要 (I)ABSTRACT ........................................................................................................... I I 目录. (IV)第一章文献综述 (1)1.1固定化酶技术的研究意义 (1)1.2固定化酶载体基质材料 (2)1.2.1固定化酶载体基质材料性质要求 (2)1.2.2固定化酶载体材料研究进展 (2)1.3固定化酶载体的表面修饰 (3)1.3.1固定化酶载体表面修饰原则 (3)1.3.2固定化酶载体表面修饰环氧基 (4)1.4固定化酶载体的间隔臂 (6)1.5固定化酶载体的配位体 (6)1.6展望 (7)1.7本论文研究内容及意义 (7)第二章琼脂糖微球的制备 (9)2.1实验试剂及仪器 (9)2.1.1实验试剂 (9)2.1.2实验仪器 (9)2.2实验方法及步骤 (10)2.3实验结果及讨论 (10)第三章琼脂糖磁性微球活化条件研究 (12)3.1微球活化方法论证 (12)3.2环氧基分析方法论证 (12)3.3实验试剂及仪器 (13)3.3.1实验试剂 (13)3.3.2实验仪器 (14)3.4实验方法及步骤 (14)3.4.1琼脂糖磁性微球的活化 (14)3.4.2琼脂糖磁性微球环氧基修饰密度的分析 (15)3.5实验结果及分析 (15)3.5.1活化后琼脂糖磁性微球的性质 (15)3.5.2琼脂糖磁性微球活化条件探究结果分析 (16)3.5.2.1氢氧化钠溶液浓度的影响 (16)3.5.2.2环氧氯丙烷体积分数的影响 (17)3.5.2.3硼氢化钠的浓度的影响 (18)3.5.2.4活化温度的影响 (18)3.5.2.5活化时间的影响 (19)第五章全文总结及展望 (21)5.1全文总结 (21)5.2展望 (21)参考文献 (23)致谢...................................................................................... 错误！未定义书签。
离子液体法提取琼脂糖的原理和简要步骤
离子液体法提取琼脂糖的原理和简要步骤1、常规合成法：离子液体常规合成法主要包括一步法和两步法。
（1）一步法：采用叔胺与卤代烃或酯类物质发生加成反应，或利用叔胺的碱性与酸性发生中和反应而一步生成目标离子液体的方法。
可合成胍类离子液体和多种醇胺羧酸盐功能化离子液体。
（2）两步法：两步法的第一步是通过叔胺与卤代烃反应制备出季铵的卤化物；第二步再将卤素离子置换为目标离子液体的阴离子。
可用于制备数十种咪唑类离了液体、氮基酸类离子液体、膦类离子液体等。
一步法和两步法是比较普遍的方法，因此具有普适性，但离子液体合成通常需要在加热的条件下完成，而常规的加热搅拌需要较长的时间（几个或几十个小时），因而导致合成离子液体的效率和产率均偏低。
2、外场强化法：外场强化法主要为微波法和超声波法。
（1）微波法：是通过极性分子在快速变化的电磁场中不断改变方向而引起分子的摩擦发热，属于体相加热。
微波法加热升温速度较快，可极大地提高反应速率（有些反应只需几分钟），甚至提高产率和纯度。
在微波作用下采用“一锅法”可合成了一系列咪唑类离子液体。
该方法反应时间短、产率高。
（2）超声波法：超声波借助于超声空化作用能够在液体内部形成局部的高温高压微环境，并且超声波的振动搅拌作用可以极大地提高反应速率，尤其是非均相化学反应。
采用超声波作为能量源，可在在密闭体系非溶剂条件下合成了溴化1，3-二烷基咪唑离子液体，合成吡啶类离子液体。
该法具有产物收率高、反应速率快、节约能耗的特点，同时，又能减少有机溶剂的使用．降低成本，减少污染。
但超声波法工业化应用将面临大功率密度的超声波设备的工业化难题。
3、微反应器法：微反应器法一般是指在一个内部尺寸为几微米到几百微米的小型微反应器内进行的反应。
微反应器不但具有所需空间小、质量和能量消耗少以及反应时间短的优点，而且能够显著提高产物的产率与选择性以及传质传热效率。
微反应器法所达到的效果比传统的间歇反应器法高20倍。
巯基蛋白偶联琼脂糖凝胶预活化树脂
巯基蛋白偶联琼脂糖凝胶预活化树脂
摘要：
1.巯基蛋白偶联琼脂糖凝胶预活化树脂的概述
2.巯基蛋白偶联琼脂糖凝胶预活化树脂的制作方法
3.巯基蛋白偶联琼脂糖凝胶预活化树脂的应用领域
4.巯基蛋白偶联琼脂糖凝胶预活化树脂的优势与不足
正文：
巯基蛋白偶联琼脂糖凝胶预活化树脂是一种生物技术领域中常用的实验材料。
巯基蛋白是一种多功能的蛋白质，能够与多种分子结合，因此在生物实验中具有广泛的应用。
琼脂糖凝胶是一种常用的固相支持物，具有良好的吸附性能和分离效果。
预活化树脂则是一种经过特殊处理的吸附树脂，能够提高吸附效率和选择性。
制作巯基蛋白偶联琼脂糖凝胶预活化树脂的方法通常分为以下几个步骤：首先，将巯基蛋白与琼脂糖凝胶进行共价偶联，形成巯基蛋白- 琼脂糖凝胶偶联物。
然后，将偶联物与预活化树脂进行混合，通过物理吸附或化学交联的方式将巯基蛋白- 琼脂糖凝胶偶联物固定在预活化树脂上。
最后，通过洗涤、离心等操作步骤，得到巯基蛋白偶联琼脂糖凝胶预活化树脂。
巯基蛋白偶联琼脂糖凝胶预活化树脂广泛应用于生物分离、纯化和检测等领域。
例如，在蛋白质分离和纯化过程中，可以使用巯基蛋白偶联琼脂糖凝胶预活化树脂对目标蛋白质进行特异性吸附和分离。
在抗体检测中，巯基蛋白偶联琼脂糖凝胶预活化树脂可以作为固相支持物，与酶标抗体结合，实现对目标抗原的快速、准确检测。
巯基蛋白偶联琼脂糖凝胶预活化树脂具有许多优势，如高特异性、高吸附效率、良好的稳定性和可重复使用性等。
然而，它也存在一些不足之处，例如制备过程相对复杂、易受实验条件影响等。
巯基蛋白偶联琼脂糖凝胶预活化树脂
巯基蛋白偶联琼脂糖凝胶预活化树脂1. 简介巯基蛋白偶联琼脂糖凝胶预活化树脂是一种常用于蛋白质纯化和分离的材料。
本文将详细介绍巯基蛋白偶联琼脂糖凝胶预活化树脂的原理、制备方法、应用领域以及优缺点。
2. 原理巯基蛋白偶联琼脂糖凝胶预活化树脂的原理是利用巯基与金属离子的亲合性，将巯基蛋白固定在琼脂糖凝胶上。
巯基蛋白是一种含有巯基官能团的蛋白质，在碱性条件下可以与金属离子形成稳定的配位键。
通过这种方式，可以将目标蛋白质选择性地吸附到预活化树脂上，实现其纯化和分离。
3. 制备方法3.1 材料准备制备巯基蛋白偶联琼脂糖凝胶预活化树脂所需的材料包括巯基蛋白、琼脂糖凝胶、金属离子等。
3.2 巯基蛋白的偶联将巯基蛋白与琼脂糖凝胶混合，在碱性条件下进行偶联反应。
通过巯基与金属离子的配位作用，巯基蛋白可以牢固地固定在琼脂糖凝胶上。
3.3 预活化将偶联后的琼脂糖凝胶进行预活化处理。
预活化的目的是使树脂具有更好的吸附性能，提高纯化效果。
4. 应用领域巯基蛋白偶联琼脂糖凝胶预活化树脂在蛋白质纯化和分离领域具有广泛的应用。
以下是一些常见的应用领域：4.1 蛋白质纯化巯基蛋白偶联琼脂糖凝胶预活化树脂可以用于蛋白质的纯化。
通过调节条件，可以选择性地吸附目标蛋白质，去除杂质，实现蛋白质的纯化。
4.2 蛋白质分离巯基蛋白偶联琼脂糖凝胶预活化树脂可以用于蛋白质的分离。
根据不同的吸附性能，可以将混合蛋白质样品中的目标蛋白质选择性地吸附到树脂上，实现蛋白质的分离。
4.3 抗体富集巯基蛋白偶联琼脂糖凝胶预活化树脂可以用于抗体的富集。
通过与巯基蛋白的特异性结合，可以将抗体选择性地吸附到预活化树脂上，实现抗体的富集。
5. 优缺点巯基蛋白偶联琼脂糖凝胶预活化树脂具有以下优点和缺点：5.1 优点•选择性好：通过调节条件，可以实现对目标蛋白质的选择性吸附，去除杂质。
•稳定性高：巯基与金属离子形成的配位键稳定，可以在不同条件下使用。
•操作简便：制备方法相对简单，易于操作。
mirna琼脂糖凝胶电泳注意事项
mirna琼脂糖凝胶电泳注意事项琼脂糖凝胶电泳是一种常用的核酸分离和分析技术，它在遗传学、分子生物学等领域有着广泛的应用。
以下是在进行琼脂糖凝胶电泳实验时需要注意的事项：1.实验前的准备：确保实验室设备和试剂都是干净的，以避免可能的污染对实验结果的干扰。
同时，也要确保琼脂糖凝胶片的质量良好，以提高实验的可靠性。
2.样品的处理：样品的处理方法应根据实验需求进行选择。
一般情况下，需要对样品进行DNA或RNA的提取、纯化、酶切等处理。
在处理过程中，要避免对样品造成损伤，以保证实验结果的准确性和可靠性。
3.凝胶的制备：制备琼脂糖凝胶时，首先要选择合适的琼脂糖浓度和凝胶浓度，以提供足够大的分离范围和分辨率。
其次，要控制凝胶电泳缓冲液的配制和pH值，以确保凝胶中DNA或RNA分子的稳定迁移。
最后，要注意排气，以避免凝胶中的气泡对实验结果的干扰。
4.样品加载和电泳：在样品加载时，要确保加载量适中，以避免样品过多或过少对分离结果的影响。
同时，要注意样品的加载顺序，以避免相近分子之间的重叠。
在进行电泳时，应根据实验需求选择合适的电压和电流，以达到较好的分离效果，并避免实验过程中的电压或温度波动，以保持实验的一致性。
5.后续处理和分析：电泳结束后，可以通过染色、波长扫描、荧光成像等方法对凝胶上的DNA或RNA进行可视化。
对于需要进一步分析的样品，可以将凝胶中的目标带切下进行后续的提取和纯化。
在进行染色和成像等后续处理时，要严格遵守实验操作规程，并注意实验室安全。
6.数据记录和结果分析：在实验过程中，要详细记录实验条件、样品信息、实验结果等重要数据。
对于电泳结果的分析，可以借助专业的图像处理软件进行带的定量和分析，得出准确的实验结果。
总之，琼脂糖凝胶电泳是一项复杂的实验技术，需要严格控制各个环节的实验条件和操作方法，以确保实验结果的准确性和可靠性。
在进行实验前，要充分了解相关知识和操作流程，并遵循实验室的安全规定，以确保实验的顺利进行。
琼脂糖安全操作及保养规程
琼脂糖安全操作及保养规程前言琼脂糖是一种被广泛用于实验室的凝胶剂，尤其在生物医学领域中。
不正确的使用和保养琼脂糖可能会对实验室人员的健康和实验结果的准确性造成影响。
为了确保实验室工作的顺利进行，本文档提供了关于琼脂糖的安全操作和保养规程。
安全操作规程琼脂糖的储存琼脂糖应存放于干燥、阴凉、避光处，避免曝露于直接日光下。
在使用前，应检查琼脂糖是否已过期，是否出现了污染或变异。
琼脂糖的制备在琼脂糖的制备过程中，应注意以下几点：•琼脂糖的制备应在洁净的实验室环境下进行，以避免污染。
•必须使用量哺乳动物细胞培养的无血清基础培养液或含血清量不超过5的基础培养液。
•制备琼脂糖时应注意温度、PH值和加热时间。
•不要使用过期、受污染的琼脂糖，以免影响实验结果。
•制备后，应尽快使用，避免长时间保存。
琼脂糖的使用在实验过程中，应注意以下几点：•使用琼脂糖前，必须确保所有的物品（培养皿，移液器，离心管等）都已清洗干净，避免污染。
•使用琼脂糖时应先升温至液态状态，等液态琼脂糖冷却至适宜的使用温度后再使用。
•使用琼脂糖时，应避免出现气泡、过早凝固、颜色不均等问题。
使用时必须用纯净水检查琼脂糖是否存在这些问题。
•使用过的琼脂糖必须处理妥当，严禁随意排放到下水道或污染环境。
保养规程为了确保琼脂糖的品质和效果，应注意以下几点：安全存储琼脂糖应存放于干燥、阴凉、避光处，避免曝露于直接日光下。
应定期检查琼脂糖的保存条件是否符合规范。
正确处理使用琼脂糖后，应立即将使用剩余的琼脂糖密封好，并在规定的时间内使用剩余的琼脂糖。
定期清洁定期清洁琼脂糖容器和器具，特别是在使用后应立即清洁。
报告问题如果发现琼脂糖存在质量问题或不符合规格，请及时向相关部门报告，以免造成严重后果。
总结琼脂糖是生物医学领域中重要的凝胶剂，不正确的使用和保养将会影响实验结果的准确性，甚至造成严重后果。
因此，在使用琼脂糖进行实验过程中，必须按照合适的规范进行操作并注意琼脂糖的保养。
琼脂糖凝胶的制备琼脂糖凝胶液的制备
将冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶液，小心地倒 在有机玻璃内槽上，控制灌胶速度和量，使胶 液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表面形 成均匀的胶层。 室温下静置30min左右，待凝固完全后，轻轻拔 出梳子，在胶板上即形成相互隔开的上样孔。 制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有0.51×TAE（Tris-乙酸） 或TBE（Tris-硼酸）工作 液的电泳槽中使用。
Super-coiled form
学生实验结果
1
2
3
M
1. 未酶切质粒；2. EcoRI 单酶切；3. EcoR1+XhoI双酶切 M. 1kb DNA Marker.
5、电泳（带上手套操作） • 加完样后的凝胶板即可通电进行电泳；
• 建议在80～100ห้องสมุดไป่ตู้的电压下电泳；
• 当溴酚兰移动到距离胶板下沿约1cm处停 止电泳； • 将凝胶放入溴化乙啶（EB〕工作液 （0.5g/ml左右）中染色约20min。
为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率， 电场强度不应高于5V/cm（两电极间的距 离）。电泳温度视需要而定，对大分子的 分离，以低温较好，也可在室温下进行。 在琼脂糖凝胶浓度低于0.5%时，由于胶太 稀，最好在4℃进行电泳以增加凝胶硬度。
琼脂糖凝胶电泳检测DNA
1、仪器设备 电泳仪，电泳槽，紫外透射仪， 凝胶成像仪，一次性塑料手套等
2、琼脂糖凝胶的制备
琼脂糖凝胶液的制备：称取0.8g琼脂糖， 置于三角瓶中，加入100ml TBE或TAE 工作液，瓶口倒扣一个小烧杯，将该三 角瓶置于微波炉加直至琼脂溶解。
3、胶板的制备
取有机玻璃内槽，洗净、晾干；将有机 玻璃内槽置于一水平位置模具上，放好 梳子。
6、观察与拍照
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经验交流一种安全制备活化琼脂糖树脂的方法3伍学勤1) 吴 岑2) 凌晓红1) 陈建文1) 赫荣乔2)33(1)中关村医院内分泌科,北京100080;2)中国科学院生物物理研究所,中国科学院视觉信息加工重点实验室,北京100101)摘要 溴化氰是常用载体(树脂)活化剂,但其毒性很强,具有挥发性,活化后树脂带较强的电荷而导致非特异性吸附.羰基二咪唑(1,1′2carboxyl2diimidazole,CDI)近年来被用于树脂的活化,具有毒性低、相对安全、方便、活化效率高、活化后树脂所带电荷相对较少等优点.由于国内同行很少采用CDI活化树脂制备亲和层析柱或固定化酶,在此介绍该方法的一些关键步骤供同行参考.关键词 亲和层析,固定化酶,羰基二咪唑,溴化氰,32磷酸甘油醛脱氢酶,蚯蚓蛋白酶学科分类号 Q814 亲和层析和固定化酶方法是分子生物学及生物工程中的常用技术,载体活化与偶联是其中的关键环节.自Axen等(1967年)[1]使用溴化氰作为亲和层析载体活化剂(matrix activated2agent)以来,溴化氰便成为应用最广泛的载体活化剂.溴化氰活化载体与配基(ligand)或酶的氨基结合,形成稳定的共价偶联[2].但是,溴化氰是剧毒试剂,并具有挥发性,在使用时,需要十分仔细.从试剂的称量到偶联后树脂的洗涤都不能出现差错.另外,溴化氰活化载体后形成的氰氧基容易水解,而影响偶联效率;活化后的树脂带有较强的电荷,导致非特异性吸附等[3].最早使用羰基二咪唑(1,1′2 carboxyl2diimidazole,CDI)作为活化剂的是Mallia 等[4],但由于在活化过程中将CDI溶于丙酮,该有机溶剂的挥发性很强,使其活化效率受到一定程度的影响.目前,CDI作为一种相对安全的载体活化剂已经被同行认可[5,6];其活化与偶联效率较高、操作简便、偶联反应容易控制.在此,我们介绍CDI活化琼脂凝胶(Sepharose2CL6B)的方法及其影响偶联效率的关键点.1 材料与方法111 材料 羰基二咪唑、溴化氰、山梨醇、Tris、curcumin、间氨基苯硼酸(APB)以及天门冬酰胺购于Sigma公司;Sepharose2CL6B购于Pharmacia 公司;糖基化亲和层析微柱购于Seiagaku公司(Tokyo);无水二氧六环(一级)购于北京化工厂;其他试剂为国产分析纯.112 溴化氰活化及配基偶联 根据Axen等[1,2]以及Wilchek等[7]建立的方法进行操作.113 羰基二咪唑活化及糖基化蛋白亲和配基的偶联11311 配制二氧六环梯度(dioxane)溶液:二氧六环∶水(体积比)=1∶4(A),1∶1(B)以及4∶1 (C).11312 活化:取湿重510g的Sepharose2CL6B,用100ml无离子水洗涤.在布氏漏斗中将树脂逐渐由水相通过二氧六环梯度溶液(A、B、C,各20ml)转移到无水二氧六环中(不可在溶液置换时,将树脂抽干,否则将影响活化效果).将树脂悬浮在8ml无水二氧六环中,加入012g CDI, 25℃震摇15min.11313 洗涤:用10ml无水二氧六环反复抽滤洗涤三次,按活化的相反顺序,将活化后的树脂分别用C、B、A溶液(各20ml)置换到012molΠL NaHCO3201015molΠL NaCl(pH1010)水相中(如果暂时不偶联,则可将其抽干,4℃保存)备用. 11314 配基偶联:按100ml活化树脂加入110g间氨基苯硼酸的比例偶联(4℃,摇床30～40rΠmin, 12h;不用磁力搅拌).偶联缓冲液为:012molΠL NaHCO3201015molΠL NaCl(pH10).偶联后按下列 3北京市海淀区科委基金项目(A06219992026). 33通讯联系人. T el:010*********,E2mail:herq@ 收稿日期:2001208224,接受日期:2001210218液体(各用五倍体积)顺序通过抽滤进行洗涤:无离子水、1molΠL NaCl、无离子水、011molΠL HCl、无离子水、最后再置换到上述缓冲液中(树脂∶缓冲液=1∶2,体积比).11315 偶联后处理:五倍体积无离子水反复洗涤2～4次,置于01001molΠL HCl中4℃保存备用. 11316 偶联效率的测定:用011%姜黄试剂测定含硼量,分析APB偶联到树脂上的效率,具体操作见参考文献[8].114 糖基化血红蛋白的亲和层析 取011ml新鲜静脉血(ED TA或heparin抗凝),1%Triton X2100溶解红细胞,在0125ml APB2Sepharose CL26B亲和层析柱中进行分离分析.糖基化血红蛋白的分离、分析以及溶液配制见参考文献[9].115 糖基化32磷酸甘油醛脱氢酶的分离 兔肌32磷酸甘油醛脱氢酶(G APDH)的分离纯化以及糖基化G APDH的亲和层析分离、分析以及活力测定见参考文献[9,10].116 蚯蚓蛋白水解酶的固定化 根据Zhou等[11]使用的方法分离纯化蚯蚓蛋白水解酶(EFE2Ⅲ21),固定化酶的操作过程见参考文献[6].2 结果与讨论 CDI为白色粉末状试剂,由于直接接触会刺激皮肤,可将其制备为012gΠml储液(-20℃).由于树脂的活化,在无水二氧六环中进行,CDI被水解破坏较少.由表1可见,用姜黄法[8]测定间氨基苯硼酸的偶联率,CDI的活化效率明显相对较高,仅仅用0105gΠml(树脂)即可达到10%溴化氰活化的效果.对照实验表明,如果减少溴化氰的量,将达不到相应的偶联效率.溴化氰活化效率较低的原因,可能是由于其活化在水溶液中进行,部分溴化氰被水解所致(表1).T able1 Comparison of CDI with CNB r in activation of Sepharose2C L6BActivated agent CDI Cyanate bromoamide[1,2] Using per100ml resin[8]5g10gToxicity and volatility Less than CNBr;do not touchand inhale when exposedHazard!Never touch and inhaleas carefully using in fume hoodStock solution20%in dioxane20%in DMSOActivating solvent absolute dioxane waterAmount of washing waterafter activated(in thevolume of resin)～10～50 Unspecific absorption(%)1)4～812～18 1)Percentage of gHb to total Hb with APB2column. 另外,CDI活化操作过程相对安全,可以在实验台上进行(如果暂时没有通风厨);而溴化氰的活化则绝对不能在通风厨外的实验台上进行,而且即便在通风厨内进行,也要十分小心,并且需要进行一系列防护措施,以防意外事件的发生[12,13]. 与Bio2Rad生产的糖基化血红蛋白离子交换柱的结果相比较,CDI活化的Sepharose2CL6B亲和层析柱的分析gHb效果与其基本相同.但是溴化氰活化的亲和层析柱,分析的数值误差相对偏高.其原因是由于溴化氰的活化将使树脂所带的电荷增加,导致分析中的非特异性吸附增加(表2). 采用APB2Sepharose CL26B,我们从经硫酸铵沉淀法纯化的兔肌G APDH中分离出了糖基化g G APDH[11,14],CDI与溴化氰活化制备的亲和层析结果表明,溴化氰活化的亲和层析柱的非特异性吸附较对照高出约18%左右.另外,EFE2Ⅲ21的固定化实验表明,溴化氰活化固定的蛋白酶活力较CDI低了10%左右.造成这一结果的原因可能是溴化氰活化引入的强离子基团影响了EFE2Ⅲ21的空间结构所致.以上结果表明,CDI活化琼脂糖不但具有安全操作简单的优点,同时活化与偶联效率也较高,因此,在制备亲和层析柱或固定化酶时, CDI应该考虑作为活化树脂的选择试剂.T able2 C omp arison of C DI w ith CNB r in activ ation of S eph arose2C L6B to analysis of glycated hemoglobin and glycated G APDH Methods Control1)CDI CNBr APB(g)per100ml resin,for column of gHb3-13 gHb criteria from100normal casesΠ%514±017513±018510±118Rabbit muscle glycated G APDHΠ%-8～1212～16 Total activity of G APDH in bloodΠ(U・ml-1)～4930～4930～4930Relative activity of gG APDH in bloodΠ%54±91255±81465±1415 Activity of native EFEΠU2)-4545Activity of immobilized EFEΠU-2920 1)Micro2column came from Seiagaku Corporation.2)One unit either EFE2Ⅲ21or G APDH is defined as the specific activity required to convert 1μmol substrate per minute with1mg enzyme. 尽管CDI用于活化琼脂糖凝胶具有一系列的优点,但是在操作中亦应该注意以下事项以获得活化的高成功率:a1在称量CDI时不要深呼吸,不要直接接触试剂;b1在活化时注意二氧六环是否是无水,如果含有水份,CDI将被水解,导致活化效率降低;c1在洗涤和溶液置换过程中树脂不能被抽干;d1CDI一定要保存在低温干燥环境中,防止其水解;e1树脂活化后,从无水二氧六环中置换到水溶液中时,不要过于忙乱,尽管在置换过程部分活化后的咪唑基团会被水解下来,但是水解的速度远比游离CDI慢;f1务必将游离的CDI洗干净;g1虽然偶联可以在室温下进行,但是最好在低温下操作(可以适当延长时间);h1偶联后的树脂一定要把残留的配基清洗干净并置于4℃,不可将其放在0℃以下保存. 另外,环氧类试剂(epoxy2activated2agarose, EAA)也是较为安全的活化剂.但是,该活化剂同样导致树脂获得较强电荷基团,非特异性吸附十分明显,空间位阻也较为明显,偶联率较低[4].同时,由于环氧剂的氧化性很强,在固定化酶的制备中,还原氨基酸的侧链基团将受到破坏,因此在使用该活化剂时应该考虑这一因素.由于还原性氨基酸被活化剂反应而被破坏,其应用范围将受到一定的限制.近年来,某些新的固定化酶技术也开展起来,如磁性固定化[15]、膜固定化[16]等,但是这些技术有待于进一步完善和发展.参 考 文 献1 Axen R,Proth J,Ernbaxk S.Chemical coupling of peptides and proteins to polysaccharides by means of cyanogen hilides.Nature, 1967,214(5059):1302～13042 Proth J,Axen R,Ernback S.Chemical coupling of proteins to agarose.Nature,1967,215(5180):1491～14923 Bethell G S,Ayers J S,Hancock W S,et al.Structure heterogeneity of human hemoglobin a due to nonenzymatic glycosylation.J Biol Chem,1979,254(10):3892～38984 Mallia A K,Hernanson G T,Krohn R I,et al.Preparation and use of a boronic acid affinity support for separation and quantitation of glysocylated hemoglobins.Anal Lett,1981,14(B8):649～6615 Kuhn N.Activation of molecular oxygen by hemin complexes.Prikl Biokhim Mikrobiol,1982,18(4):489～986 Qian F,Wu C,Li L,et al.Some features of intestinal absorption of intact fibrinolytic enzymeⅢ21from L umbricus rubell us.Biochim Biophys Acta,2001,1526(2):286～2927 Wilchek M,Miron T,K ohn J.Affinity chromatography.Meths Enzym,1984,104(c):3～558 Mair J W J r,Day H G.Curcumin method for spectrophotometric determination of boron extracted from radiofrequency ashed animal tissues using22ethyl21,32hexanediol.Anal Chem,1972,44(12):2015～20179 He R Q,Zheng X,Liu W,et al.Isolation of glycated and non2 glycated D2glyceraldehyde232phosphate dehydrogenase and detection of glycation.Acta Biophys Sin,1996,12(1):15～2010He R Q,Y ang M D,Zheng X,et al.Isolation and some properties of glycated D2glyceraldehyde232phosphate dehydrogenase from rabbit muscle.Biochem J,1995,309(Pt1):133～13911Zhou J,Wu C,He R Q.Characterization of activity and conformation of earthworm fibrinolytic enzymeⅢ21.J Biochem Mol Biol Biophys,1998,2(5):195～19912宋 扬.改良与修饰壳聚糖固定化抑肽酶研究.生物化学与生物物理进展,2000,27(1):82～85Song Y.Prog Biochem Biophys,2000,27(1):82～8513辛嘉英.Candida 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poison with a volatilization feature,which should be carefully used.Here,1,1′2carboxyl2diimidazole is used as an activator to Sepharose CL26B,in order to immobilize earthworm fibrinlytic enzymeⅢ21(EFE2Ⅲ21),m2 aminophenylboronic acid and to detect glycated D2glyceraldehyde232phosphate dehydrogenase(G APDH),with a low poison,a high coupling rate and a convenient process.K ey w ords affinity chromatography,immobilization,carboxyl2diimidazole,CNBr,D2glyceraldehyde232 phosphate dehydrogenase,earthworm fibrinlytic enzyme 3This work was supported by Haidian Sci2Tech Committee Foundation(A06219992026). 33Corresponding author.Tel:86210264889876,E2mail:herq@ Received:August24,2001 Accepted:October18,2001中国科学院生物物理研究所期刊编辑部招聘启事 招聘岗位:《生物物理学报》编辑招聘人数:1人应聘条件:生物物理或相关专业大学本科以上学历,对生物物理及相关学科领域有较为全面的了解.有科研工作经验,中级以上专业技术职称(高级职称者优先考虑).有较强的中英文读写能力.年龄50岁以下(其他条件较好者,年龄可适当放宽).待遇:参照我所同级人员待遇(年薪3～6万元).有意者请与中国科学院生物物理研究所期刊编辑部联系.电话:010*********;E2mail:prog@联系人:王海群中国科学院生物物理研究所期刊编辑部。