仙台病毒高滴度病毒制备方法的建立
病毒类疫苗生产与质量控制要求
病毒类疫苗生产与质量控制要求2012.7.18病毒类疫苗以病毒或病毒某种抗原成分为原料，可分为：►减毒活疫苗：麻疹、风疹、腮腺炎等病毒性疫苗工艺流程简述澄清过滤（提三级种子库澄清、过滤（提减毒活疫苗三级细胞库内容1.灭活疫苗病毒性灭活疫苗优缺点灭活疫苗的优点1、所用生产毒种不必需要减毒或弱毒株；2、必须使用灭活剂灭活病毒；因此，可以灭活可能的外源因子；病毒性灭活疫苗关键点灭活疫苗的关键点：原始种子主种子病毒种子批系统原始种子和主种子要求冻干保存于－20℃；工作种子可以液体保存于－60 ℃以下，一般不超过2病毒性灭活疫苗关键点1(病毒种子)下，般不超过年；细胞库原材料•不得使用神经系统来源的细胞；•细胞培养液：不得含有人血清；•胰蛋白酶检测：应证明无细菌、真菌、支原体或病毒污染，特别是检测胰蛋白酶来源的动物可能携带的病毒，如猪细小病毒等；•抗生素：不得使用青霉素或β-内酰胺类抗生素原代细胞地鼠肾细胞中国药典（2010年版三部）灭活疫苗的动物细胞应来自封闭式房所内饲养的动物，并须检测与使用动物相病毒性灭活疫苗关键点2-1 生产用基质细胞原代动物细胞我国目前用原代细胞生产的疫苗：病毒性灭活疫苗关键点2-2 生产用基质细胞或动物原代细胞的要求•对动物脏器组织或胚胎来源的动物应有明确健康状况和洁净级别要求；不能建立细胞库只能限于原始培养的细胞或传代少数几•不能建立细胞库，只能限于原始培养的细胞或传代少数几原代细胞：地鼠肾、沙鼠肾优点：✶来源容易，动物的繁殖快，4-5周出现性周期，怀孕期15-18天，哺乳期20天产后2436小时即可发情排卵年可产810胎生产用细胞天，产后24-36小时即可发情排卵，一年可产8-10胎。
连续传代细胞系的特殊要求•生产用细胞代次：最高代次须符合要求(或经批准)；人二倍体细胞株的特殊要求•新建的人二倍体细胞株（资料：建立细胞株所用胎儿的胎龄和性别、终止妊娠的原因、所用胎儿父母的年龄、职业及健康良好的证明，以及胎儿父系及母系三代应无明显遗传缺陷疾病历史的书面材料）•：对新建、遗传修饰的细胞株需要；对已建株如2BS、MRC5等，在建立MCB时可染色体检查：对新建遗传修饰的细胞株需要；对已建株如2BS MRC-5等在建立MCB时可二倍体细胞2BSMRC-5传代细胞Vero 1、冻存于液氮2、一式两份保存病毒性灭活疫苗关键点2-3 生产用基质细胞,传代细胞库式两份保存二倍体细胞具有正常二倍体（2n）染色体的数目，核型正常；病毒性灭活疫苗关键点2-4 传代细胞库——取自同批工作细胞库的1支或多支细胞管，经复苏、扩增后的细胞仅用于一批疫苗的生产病毒性灭活疫苗关键点2-6 传代细胞库经复苏、扩增后的细胞仅用于批疫苗的生产Vero细胞用于疫苗生产的优缺点病毒性灭活疫苗关键点2-5 传代细胞库优点：缺点缺点：Vero细胞疫苗的研究V 细胞的来源和历史生产用细胞Vero细胞的来源和历史Vero细胞的致肿瘤性Montagnon实验：用裸鼠进行肿瘤实验，106或107细胞注射裸鼠，同时用H l 细胞作对照生产用细胞同时用Hela细胞作对照Vero 细胞残余DNA 的致瘤性质量标准：80年代美国FDA → 10pg /剂生产用细胞欧盟、WHO → 100pg /剂细胞毒种处理动物，选取所用组织清洗组织，剪碎，用自然沉降法清洗毒种检定浸泡清除牛血清抗菌素接种传代细胞工作库细胞复苏病毒性灭活疫苗关键点3-1 生产工序和/或步骤洗换柱层析单柱、多柱区带离心其它方法纯化无菌试验抗原含量测定蛋白量测定牛血清白蛋白DNA病毒性灭活疫苗关键点3-2 生产工序和/或步骤福尔马林甲醛甲醛溶液（浓度定义）病毒性灭活疫苗关键点4-1 灭活剂和灭活方法病毒性灭活疫苗关键点4-2 灭活剂和灭活方法注意点：pH、温度、浓度和作用时间优点：价廉、灭活方法简单易操作缺点：残余甲醛的形式不变，使疫苗的稳定性差，注射时局部疼痛。
病毒感染细胞实验整体流程及原理
病毒感染细胞实验整体流程及原理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。
1、病毒的种类病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒1.1慢病毒1.1.1原理慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。
构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA 载体相比,一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞,并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。
1.1。
2特点1）直接包装成为假病毒颗粒,对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞（比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞）。
2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。
3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究.4) 无需任何转染试剂，操作简便。
5）可以根据客户需要制备多种标记。
1。
1。
3慢病毒包装简要流程:1) 含有目的基因的慢病毒RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。
2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等.3）培养48hrs —72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。
4）病毒的纯化和浓缩.5) 分装、—80 ℃保存。
6）滴度测定目的基因检定,并出具检测报告.1.2、腺病毒1.2。
1原理腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒,其复制不依赖于宿主细胞的分裂。
有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因,降低病毒的复制能力。
这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。
1.2.2特点1) 几乎可以感染所有类型的细胞2）可以获得复制缺陷型(E1 和E3 缺失) 的腺病毒3) 病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到1012 PFU/mL,能有效的进行增殖。
动物病毒细胞增殖的研究进展
动物病毒细胞增殖的研究进展目前，细胞培养在病毒学方面的研究最为广泛。
病毒和宿主细胞共同决定病毒适应细胞生长并增殖。
病毒首先通过特定的受体吸附于宿主细胞膜上，与受体结合后，进入宿主细胞内进行基因组的复制。
期间，病毒成功感染细胞除了需要病毒与受体结合，还依赖于膜融合、内吞、囊泡运输及核定位信号介导入核等多个过程。
细胞通过特异的病毒一受体相互作用来识别病毒，这些受体决定了细胞对病毒的敏感性。
尽管流感病毒、狂犬病毒、口蹄疫病毒等能够成功的使用细胞培养，但是很多病毒的宿主范围很窄，病毒甚至无法进行细胞培养。
本文通过以下方法：宿主细胞的选择、细胞连续传代、改变细胞培养条件、添加病毒保护剂、改变细胞结构，对动物病毒适应细胞培养增殖研究进行概述。
1 合适的宿主细胞病毒适应细胞的能力与病毒自然宿主、病毒原发器官和细胞类型有关。
例如，鸭肝炎病毒不能感染哺乳动物单层细胞；水貂流行性腹泻冠状病毒仅在貂肺细胞培养繁殖；马传染性贫血病毒常用马胚肾细胞系培养。
SARS病毒注射到鸡、火鸡、鹅、鸭和鹌鹑胚的尿囊腔中病毒不复制，不引起病变。
猪伪狂犬病毒虽然具有广泛的嗜性，能在多种细胞内繁殖，但敏感度不同，其中以兔肾细胞和猪肾细胞(原代和传代细胞系)最适于病毒的增殖，在PK15(猪源)、Vem(猴源)、BHK(鼠源)、CEF(鸡源)细胞中，该病毒在PK15上增殖速度最快。
Coria等用鸡传染性支气管炎病毒Beaudene株接种猫、狗、绵羊、鹅等14种非宿主动物肾细胞发现，培养的病毒滴度要远远低于接种鸡胚肾细胞的病毒滴度。
其中，在猫、狗、猪的肾细胞内采用直接荧光抗体方法检测不到病毒。
Lukert等通过比较在鸡胚、原代鸡胚肾细胞、肝细胞上感染鸡传染性支气管炎病毒的增殖情况发现，病毒在鸡胚上的敏感度最高，是肾细胞的12～40倍，肝细胞的500～1000倍。
鸡气管环上皮细胞对该病毒更敏感、更容易适应，鸡传染性支气管炎病毒肾变型分离株能够较容易的适应鸡胚肾细胞。
浅析仙台病毒的结构及诱导细胞融合的机制
浅析仙台病毒的结构及诱导细胞融合的机制作者：马晓慧郭燕来源：《读与写·下旬刊》2016年第01期摘要：仙台病毒是动物细胞融合重要的诱导剂，本文从仙台病毒作为细胞融合诱导剂的发现历程，仙台病毒的结构，诱导细胞融合的机制、步骤，及仙台病毒有关的研究进展等方面做了具体的阐释，以期帮助老师和同学更好的认识仙台病毒，有利于学生和老师对于《选修三》中动物细胞工程相关内容的理解。
关键词：仙台病毒；细胞融合；选修三中图分类号：G672 文献标识码：B 文章编号：1672-1578（2016）01-0232-01动物细胞融合是高中生物选修三细胞工程中的重要内容，是学生学习单克隆抗体技术及其他动物细胞工程的的基础，即细胞杂交，是二十世纪五十年代细胞学中出现的一种新技术。
细胞融合由广义而言，就是两个或两个以上细胞合并形成一个细胞的过程，从狭义来讲是在离体的条件下，用人工的方法把两个或两个以上的细胞合并。
使体细胞杂交而形成一个新的杂种细胞。
这就是我们通常所指的细胞融合。
细胞融合的方法有两种：一、自发融合，即两个细胞紧靠在一起，不经任何诱导剂处理，能相互融合。
二、诱导融合，即两个细胞虽靠在一起，但必须要经过诱导剂的处理才能融合。
60年代初，病毒融合技术逐渐兴起。
作为重要的病毒诱导剂，课本对仙台病毒的介绍比较少，本文从仙台病毒的结构，作用机理，研究方向等方面做以具体阐释，以期帮助老师和同学更好的认识仙台病毒，更好的理解细胞融合的过程。
1.仙台病毒作为细胞融合诱导剂的发现历程1958 年，日本的冈田善雄（Okada）用副粘病毒中的日本血球凝集病毒（HVJ）诱导动物细胞融合，取得良好效果。
这以后，许多学者用紫外线灭活的诱导人的KB细胞和小鼠的Ehrlich腹水癌细胞、人的Hela细胞和摇蚊的体细胞、人的体细胞与小白鼠的体细胞进行融合，都获得成功。
实验证明，HVJ病毒可以将任何两个远缘物种的体细胞诱导融合在一起。
HVJ病毒也称为副流感病毒一号。
病毒滴度测定方法
病毒滴度测定方法
病毒滴度测定是一种用于确定病毒在溶液中的浓度的方法。
它通常用于病毒学研究、疫苗生产和药物研发等领域。
正确的病毒滴度测定方法可以帮助科研人员准确地评估病毒的活性和浓度，从而为相关研究工作提供可靠的数据支持。
下面将介绍几种常用的病毒滴度测定方法。
一、细胞培养法。
细胞培养法是一种常用的病毒滴度测定方法。
首先，将待测病毒样品与细胞培养基混合，然后在培养皿中接种一定数量的细胞，并将混合液加入培养皿中。
接下来，将培养皿放入恒温培养箱中，培养一定时间后观察细胞的感染情况，根据感染细胞的数量可以计算出病毒的滴度。
二、血凝法。
血凝法是另一种常用的病毒滴度测定方法。
这种方法利用病毒对红细胞的凝集作用来确定病毒的滴度。
首先，将一定浓度的病毒样品与红细胞混合，然后在琼脂培养皿中进行凝集反应。
根据凝集的程度和范围可以计算出病毒的滴度。
三、动物接种法。
动物接种法是一种直接将病毒样品接种到动物体内，通过观察动物的感染情况来确定病毒滴度的方法。
这种方法通常用于病毒毒力的测定。
通过确定50%动物传染单位（TCID50）或50%致死剂量（LD50）来表示病毒的滴度。
总结。
以上介绍了几种常用的病毒滴度测定方法，每种方法都有其特点和适用范围。
在进行病毒滴度测定时，需要根据实际情况选择合适的方法，并严格按照操作规程进行操作，以确保测定结果的准确性和可靠性。
希望本文对您有所帮助。
仙台病毒增殖及滴度测定(sendai virus)
一、SeV 鸡胚增殖1、从北京梅里亚维通购买零日龄SPF鸡蛋20枚。
2、放置37℃培养箱培养10天，每天鸡蛋旋转3次，并确保气孔朝上。
其中培养箱中要放置水，保持培养箱的湿度。
3、培养10天后，用照蛋器观察鸡胚发育情况，血管明显，表明鸡胚发育正常，用铅笔在鸡蛋上标注气孔。
4、发育完好的10日龄的鸡胚用于SeV 增殖，将鸡胚先用紫药水在气孔处擦拭，然后再用酒精棉擦拭第二遍。
5、用打蛋器在气孔上方打一个小洞，然后用1ml 的注射器，吸取约200ul SeV ，倾斜45度注射进鸡胚的尿囊液，然后用石蜡将注射空封闭。
6、将鸡胚放置37℃培养箱培养3天，进行SeV病毒的增殖。
7、将鸡胚放置4℃过夜，使血管收缩，以利于尿囊液的收取。
8、将鸡胚的气孔轻轻破碎，然后用细胞管，轻轻吸取上层的尿囊液，一般约10ml 左右。
9、将收集的尿囊液2000rpm 离心10min,弃沉淀。
10、吸取约50ul 用于血凝测试，剩余的放置-80℃冰箱冻存。
血凝试验测定方法：准备工作：需要准备阿氏液、生理盐水(0.9g NaCl+100ml蒸馏水) 灭菌30min、10ml的注射器、50ml的离心管、血凝板1、取50ml的离心管，加入约20ml的阿氏液，在10ml的注射器中的加入2ml的阿氏液，然后经鸡翅静脉取血，取血约2ml左右。
2、将鸡血加入到50ml的离心管中，反复混匀，防止鸡血凝结。
3、1500rpm 离心10min，小心去除上清液以及中间层在白细胞薄膜，将下层红细胞加入一定量的生理盐水，轻柔混匀(不要过于剧烈，以防红细胞破裂)，1500rpm 离心10min。
这样反复用生理盐水洗三遍。
4、回收洗好的红细胞，然后按照10%的稀释度加入生理盐水，配制成10%的红细胞悬液，4℃备用。
使用的时候，再稀释十倍，配制成1%的工作浓度。
5、用移液器向血凝板每孔中加入生理盐水50ul，然后用移液器取待测H1N1病毒50ul，加入第1孔，反复吹打6次后，吸出50ul加入第2孔，反复吹打，吸出50ul加入第3孔，如此联系稀释至第11孔后，吸出50ul弃去。
生物制药工艺学试题及答案
生物制药工艺学名词解释第一章：1. 药品：一定剂型和规格的药物并赋予一定的形式（如包装），而且经过有关部门的批准，有明确的作用用途。
药物：能影响机体生理、生化和病理过程，用以预防、诊断、治疗疾病和计划生育的化学物质。
2. 生物药物Biopharmaceuticals：以生物体、生物组织或其成份为原料综合应用生物学、物理化学与现代药学的原理与方法加工制成的药物。
3. 生物活性Biological activity,Bioactivity：对活组织如疫苗有影响的特性。
4. 酶工程enzyme engineering：酶学与工程学互相渗透结合，发展形成的生物技术，它是从应用目的出发，研究酶和应用酶的特异催化功能，并通过工程化过程将相应原料转化成所需产物的技术。
5. 固定化酶immobilized enzyme：是指借助于物理和化学的方法把酶束缚在一定空间内并具有催化活性的酶制剂。
6. 组合生物合成combinatorial biosynthesis（组合生物学combinatorial biology）：应用基因重组技术重新组合微生物药物的基因簇，产生一些非天然的化合物。
7. 药物基因组学：一门研究个人的基因遗传如何影响身体对药物反应的科学。
8. 凝聚作用coagulation：指在电解质作用下，胶粒粒子的扩散双电子层排斥电位降低，破坏了胶体系统的分散状态，使胶体粒子发生聚集的过程。
9. 萃取extraction：将物质从基质中分离出来的过程。
一般指有机溶剂将物质从水相转移到有机相的过程。
10. 反萃取stripping/back extraction：将萃取液与反萃取剂相接触，使某种被萃入有机相的溶质转入水相的过程。
11. 萃取因素/萃取比：萃取溶质进入萃取相的总量与该溶质在萃余相中总量之比。
12. 分离因素separation factor：在同一萃取体系内两种溶质在同样条件下分配系数的比值。
13. 双相萃取技术two-aqueous phase extraction：利用不同的高分子溶液相互混合可产两相或多相系统，静置平衡后，分成互不相溶的两个水相，利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异来进行萃取的方法。
氟达拉滨气道滴入对小鼠病毒性肺炎疗效观察
东 南大 学 学
ｕ ｔ ｈ ｅａｓｔ Ｕｎ ｉ ｖ Ｊ Ｓ ｏ
嚣 （ Ｍ ‘ ｅ ｄ 医 Ｓ ｃ 学 ｉ Ｅ 版 ｄ ｉ ； ） ２ … 。 。 ７ ， Ｊ ｕ ｌ ； ２ ６ （ ４ ） … ： ２ ８ ３ ‘ — ２ ８ ７
肺部 病毒性疾 病 种类 众 多 ， 由于其 发 病 机制 还 不
先灵葆雅公司产 品； 兔抗 鼠 Ｓ Ｔ Ａ Ｔ １ 多克 隆抗 体和辣根过 氧化物酶 （ Ｈ Ｒ Ｐ ） 标记 的羊抗 兔 Ｉ ｇ Ｇ均购 自Ｓ ａ ｎ ｔ ａ Ｃ ｒ ｕ ｚ ； Ｔ ｒ －
ｉ ｚ ｏ ｌ 购 自美 国 Ｉ ｎ ｖ ｉ ｔ ｒ ｏ ｇ ｅ ｎ公 司： 逆转 录酶 Ｍ— Ｍ Ｌ Ｖ和 Ｔ ａ ｑ
有限公司合成 ； 显微镜 和图像分析 软件为 Ｚ ｅ ｉ ｓ ｓ Ａ ｘ ｉ ｏ Ｃ ａ ｍ
Ｍ Ｒ ｃ ｏ ｌ ｏ ｒ ； 垂直 电泳及蛋 白半干转印设备和凝胶扫描仪均 为Ｂ ｉ ｏ — Ｒ ａ ｄ ； Ｂ ｎｄ ａ Ｌ ｅ ａ ｄ ｅ ｒ 凝胶条带分析软件 。
１ ． ２ 方 法
１ ． ． ２ 仙 台病毒 滴 度测 定 和 仙 台病毒 肺 炎模 型的 建
立 取新 鲜鸡全 血 ， 分 离红 细 胞 。在血 凝 板 中每 孔 加 入０ ． ５ ｍ ｌ ０ ． ５ ％ 的鸡红细 胞 Ｐ Ｂ Ｓ悬液 ， 共 ８孔 。每孔 再 加入 ０ ． ５ ｍ ｌ 仙 台病 毒鸡 胚 尿囊 液 ， 浓度从 １ ／ １ ０到 １ ／ １ ２ ８ ０成倍 递 减 ， 另 设 一 孔 为 阴性 对 照 。室 温 静 置 ３ ０～ ６ ０ ｍｉ ｎ后 观察血 凝结 果 ， 红 细胞 呈 伞状 在 血凝 板
・ ２ ８ ３ ・
氟 达 拉 滨 气 道 滴 入 对 小 鼠 病 毒 性 肺 炎 疗 效 观 察
杂交瘤技术应用、优缺点、常见问题解析
杂交瘤技术应用、优缺点、常见问题解析杂交瘤技术又称细胞融合技术，是将两个或多个细胞融合成一个。
融合后形成的杂交瘤细胞承袭了两亲本细胞的特征。
自发的细胞融合很少发生，当加入一种融合剂，如：聚乙二醇（常用）、仙台病毒或溶血卵磷脂后，两种细胞就可发生融合。
首先是质膜互相融合，形成具有两个或多个核的异核体，细胞进一步分裂时，核互相融合，形成了杂交细胞。
杂交瘤技术优缺点：优点：与传统的免疫动物方法制备抗体相比，利用杂交瘤技术可以制备出高纯度的单抗，并且可以进行单克隆抗体的大量生产。
缺点：a.操作步骤繁琐。
b.利用杂交瘤技术生产出的单克隆抗体多为鼠源性，而鼠源性抗体在应用中有诸多问题，例如被人类免疫系统所识别，产生人抗鼠抗体(HAMA）反应、在人体循环系统中很快被清除等。
杂交瘤技术应用：①诊断应用：单克隆抗体在疾病诊断中发挥了重要作用，其优点在于诊断准确且无交叉反应，例如在乙型肝炎及潜伏的乙型肝炎病毒的诊断中，单克隆抗体能显著减少假阴性的漏诊。
②治疗载体：单克隆抗体也可作为治疗疾病的载体。
通过与抗肿瘤药物结合，单克隆抗体能在体内选择性集中攻击肿瘤细胞，具有靶向性，从而减少对正常组织的损伤并减轻抗癌药物的副作用。
因此，载药单克隆抗体被誉为“生物导弹”。
③异种蛋白质问题：目前大多数单克隆抗体为鼠-鼠型，对于人体来说属于异种蛋白质，容易引起排异反应，限制了其在治疗中的应用。
④人-人型单克隆抗体的研究：为了解决排异问题，研究者正在努力研发人-人型单克隆抗体，以利于其在治疗中的广泛应用。
杂交瘤技术常见问题解析：①电融合和PEG融合的区别？PEG化学融合是利用聚乙二醇分子能够改变细胞膜结构的特性来实现细胞融合的过程。
聚乙二醇可以使两个细胞接触点质膜的脂质分子发生疏散和重组，两个细胞接触部位的质膜由于相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而发生细胞融合。
电融合则是先通过高频交流电压，使细胞成串珠状排列，实现点接触；然后施加方波脉冲，击穿两个细胞接触部位的质膜，质膜脂质分子发生重组，同时由于细胞表面张力作用，完成细胞融合。
2024年江苏省实验动物从业人员上岗(动物实验类)考试题库上(选择题汇总)
D、犬答案：B187.犬的性周期为天。
OAv120Bv160Cv180D t190答案：C188皮肤病学研究中是常选用动物。
0A、青蛙B、狗C、小型猪D4兔答案：C189 .缺乏下列哪些微量元素,会表现有异嗜,食欲不振,生产力和繁殖力降低;骨解病变.如佝偻病.骨端'关节变大.骨骼变形,脊柱和胸骨弯曲.骨软症.骨骼变得多孔而脆弱.易骨折等?0A、铁、铜B,钠、氯C、钙、磷D4碘答案：C190 .善待动物不仅仅是考虑动物的福利,也是因受虐待的动物-O A4会反抗而伤害人B、会反抗而伤害动物自己C4会反抗而捣毁仪器设备D、精神的变化会影响实验结果答案：D191 .兔、猫静脉注射一次给药最大容量β0A、 20m1.B、 10m1.C、5m1.D11m1.答案:B192 .能够替代自然乳的全价配合饲料是00A、配合饲料B4浓缩饲料C4添加剂预混料D4代乳饲料答案：D193 .在制造和鉴定脊髓灰质炎疫苗时使用β0B4犬G舜猴D'脂肪答案：A201 .SD大鼠属于。
0A、普通动物Bv近交系动物C4封闭群动物D4杂交群答案：C202 .热消毒药水清洗是良好的消毒方法。
0A、370"CBx80'CC v50,CDi70,C答案：B203 .可用 _____ 瞽代兔对猪擒苗,羊厌气三联苗的检脸。
0A、小型猪B t犬D、小鼠答案：C204 .经过治疗或免疫的动物,外袤虽然健康,但,成为潜在的传染源。
0A4对疾病的抵抗力差D、动物性氨基酸答案：B208 .在人的皮肤烧伤实验中是首选的动物。
0A、小型猪B4犬Cv免D t猫答案：A209 .实睑动物微生物和寄生虫的检测取样数量:每个小鼠、大鼠,地鼠、豚鼠和免生产繁殖单元以及每个犬、猴生产繁殖群体,根据动物多少.取样数量也不同.群体大小100~500时,取样数量为.0A、>5只8、>10只G>20R答案：B210对传染性疾病的和控制是保证实验动物质量和动物实验结果准确必要的条件.0Av预防Bx消毒C、治疗D4灭菌214理化因素对细菌的化学成分和影响极大,因此可以用它来达到杀菌或抑菌的目的.OA4新陈代谢B、比重C4渗透压Dx形态和大小答案：A215 .是继人之后第二个开始并完成基因组测序工程的哺乳类动物。
仙台病毒240反应体系
仙台病毒240反应体系
仙台病毒(Sendai Virus)。
仙台病毒最早在日本仙台一实验室分离出来，为单股负链RNA 病毒，直径100～200nm，具有相对坚固的核衣壳，外面包有布满长8～15nm，宽2～4nm纤突的含脂囊膜。
一、基本原理
灭活的仙台病毒无感染力，但有抗原性。
基本原理在于仙台病毒含有细胞表面受体的结合位点，可以促使不同细胞凝聚，最终使细胞膜相互融合。
二、仙台病毒诱导细胞融合的四个阶段
1．两种细胞在一起培养，加入病毒，在4℃条件下病毒附着在细胞膜上。
并使两细胞相互凝聚。
2．在37℃中，病毒与细胞膜发生反应，细胞膜受到破环，此时需要Ca2+和Mg2+，最适pH为8.0一8.2。
3．细胞膜连接部穿通，周边连接部修复，此时需Ca2+和ATP。
4．融合成巨大细胞，仍需ATP 。
三、病毒促使细胞融合的主要步骤
1．两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近。
2．通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间互相渗透，胞质互相渗透。
3．两个原生质体的细胞核互相融合，两个细胞融为一体。
4．进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色体的杂种细胞。
仙台病毒除了可广泛用于基因治疗用载体，还可用于构建活载体疫苗。
仙台病毒载体在疫苗上的应用主要是基于其能够激发较强的细胞免疫，可用于传统方法无法实现的疫苗。
仙台病毒核酸快速检测方法的建立和应用
仙台病毒核酸快速检测方法的建立和应用熊炜;林颖峥;魏晓锋;郭雨燕;张强;刘俊平;李健;胡建华;黄忠荣【摘要】仙台病毒（Sendai virus，SeV）是一种常见的可引起啮齿类动物呼吸道疾病的病原，感染迅速，并且隐性感染率高，一旦感染较难从鼠群中清除，从而影响动物健康。
为满足对入境噬齿类实验动物和野生动物仙台病毒快速检测的需要，本研究针对SeV编码基质蛋白和融合糖蛋白基因的保守序列设计引物和荧光探针，建立了仙台病毒RT-PCR和Real-time RT-PCR检测方法。
将建立的方法应用于仙台病毒感染鼠不同临床样品和组织培养物的检测，证实两种核酸检测方法具有良好的特异性、灵敏性和稳定性，适合应用于出入境口岸实验和野生噬齿类动物仙台病毒疫情的快速检测。
%Sendai virus (SeV) is one of common pathogens causing respiratory disease among rodent animals, which is characterized by rapid infection and high recessive infection rates. Therefore, SeV infection is difficult to eliminate from affected animals and might interfere with animal experiments. In order to meet requirements for rapid quarantine for rodent animals, RT-PCR and Real-time RT-PCR methods were developed using TaqMan probe to detect SeV. Both methods were applied to test clinical samples collected from SeV infected mice and cell cultures. The results showed that RT-PCR and Real-time RT-PCR methods were specific, sensitive and reproducible thus both methods were suitable for diagnosis of SeV infection in rodent animals.【期刊名称】《中国动物传染病学报》【年(卷),期】2014(000)004【总页数】6页(P23-28)【关键词】仙台病毒;RT-PCR;Real-time RT-PCR;TaqMan探针【作者】熊炜;林颖峥;魏晓锋;郭雨燕;张强;刘俊平;李健;胡建华;黄忠荣【作者单位】上海出入境检验检疫局，上海200135;上海出入境检验检疫局，上海200135;上海实验动物研究中心，上海201203;上海出入境检验检疫局，上海200135;上海出入境检验检疫局，上海200135;上海出入境检验检疫局，上海200135;上海出入境检验检疫局，上海200135;上海实验动物研究中心，上海201203;上海出入境检验检疫局，上海200135【正文语种】中文【中图分类】S852.659.5仙台病毒（Sendai virus，SeV）属副粘病毒科、副粘病毒属，是一种具有细胞融合活性的病毒，它可引起啮齿类动物呼吸道疾病。
大鼠仙台病毒ELISA、间接免疫荧光和免疫印迹三种检测方法比较
大鼠仙台病毒ELISA、间接免疫荧光和免疫印迹三种检测方法比较向志光;佟巍;李雨函;刘先菊;张丽芳;王艳蓉;魏强【摘要】Objective to compare the three methods of ELISA ,IFA and WB in the detection of Sendai virus in rat sera. Methods the SeV antigen proteins separated by SDS-PAGE were used in the WB method;20 sera from germ free rats,227 sera from SPF rats and 63 sera from clean rats were analyzed by ELISA ,IFA,those candidate positive samples were tested by WB. Results The 20 germ free rats were determined SeV negative by all of the 3 methods;all of the SPF rats were determined SeV negative by IFA,but 1. 32% of these SPF rats were determined SeV positive by ELISA,and 2/ 3 of these ELISA determined positive sera were confirmed by WB;The SeV positiverate in clean rats were 18. 12% by ELISA,11. 34% by IFA,and 15. 87% by WB. Conclusion the detection sensitivity gradient of the 3 methods from highto low is ELISA ,WB ,and IFA. And WB should be an alternative SeV detection method for those indeterminate samples by IFA and ELISA.%目的比较ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)、IFA(immuno- fluorescence assay)和WB(Western blot)三种方法在大鼠仙台病毒血清学检测中的差异.方法仙台病毒蛋白抗原经凝胶电泳分离转移后用于血清学检测的WB方法;使用IFA、ELISA方法对20份无菌大鼠、227份SPF大鼠以及63份清洁级大鼠送检血清样品进行检测,阳性及可疑样品用WB方法进行了验证.结果 20份无菌大鼠血清样品被3种方法检测为仙台病毒抗体阴性;SPF级大鼠样品被IFA方法判定为阴性,1.32%(3/227)被ELISA方法判定为阳性,其中有2/3被 WB确认为阳性;ELISA、IFA和WB在清洁级大鼠样品中检出仙台病毒的阳性率分别为为18.12%、11.34%和15.87%.结论三种检测方法灵敏度从高到低依次为ELISA、WB和IFA.WB方法可作为IFA和ELISA难以确定结果的替代方法.【期刊名称】《中国比较医学杂志》【年(卷),期】2013(023)001【总页数】4页(P23-26)【关键词】仙台病毒;ELISA;IFA,Western blot【作者】向志光;佟巍;李雨函;刘先菊;张丽芳;王艳蓉;魏强【作者单位】中国医学科学院医学实验动物研究所,卫生部实验动物检测中心,北京,100021;中国医学科学院医学实验动物研究所,卫生部实验动物检测中心,北京,100021;中国医学科学院医学实验动物研究所,卫生部实验动物检测中心,北京,100021;中国医学科学院医学实验动物研究所,卫生部实验动物检测中心,北京,100021;中国医学科学院医学实验动物研究所,卫生部实验动物检测中心,北京,100021;中国医学科学院医学实验动物研究所,卫生部实验动物检测中心,北京,100021;中国医学科学院医学实验动物研究所,卫生部实验动物检测中心,北京,100021【正文语种】中文【中图分类】R332我国实验动物国家标准要求对清洁级以上的啮齿类实验动物进行仙台病毒检测［1］，规定的检测方法包括酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫荧光试验(IFA)等［2］。
实验六 细胞融合(PEG)
三、动植物细胞的融合过程
植物细胞融合过程
人造小鼠培育过程示意图
四、细胞融合的意义
理论上说任何细胞，都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。 理论上说任何细胞，都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这 对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。 对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。 融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制， 融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间 的遗传物质交换提供了有效途径。 的遗传物质交换提供了有效途径。 体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分 体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统， 裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体 亦可发生重组， 裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组，从而产生新 亦可发生重组 的核外遗传系统。 的核外遗传系统。 淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备。 淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备。
实验六 细胞融合
一、细胞融合的定义
细胞融合（ 细胞融合（cell fusion)，又称体细胞杂交（somatic
hybridiazation），是指两个或更多个相同或不同细胞通过膜 融合形成单个细胞的过程。
二、细胞融合研究进展
Muller于1838年观察到脊椎动的肿瘤细胞能在体内自发地融合产生多核的肿瘤细胞。 Virchow于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。 Luginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中也有多核的血细胞存在。 Lange于1875年第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生融合的过程。 Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在无脊椎动中发现了细胞合并现象。 1958年日本学者冈田（Okada）发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。 1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学融合法 年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（ 年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇 ）化学融合法。 1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定 单克隆抗体的杂交瘤细胞。 20世纪80年代出现了电融合技术。
aav制备流程
aav制备流程AAV制备流程AAV（Adeno-Associated Virus），中文名为腺相关病毒，是一种常用的基因传递工具，广泛应用于基因治疗和基因表达研究领域。
下面将介绍一种常用的AAV制备流程。
一、构建质粒AAV制备的第一步是构建质粒，质粒是AAV病毒颗粒的基础。
质粒通常包括：载体质粒、帮助质粒和包装质粒。
载体质粒是用于携带目标基因的质粒，帮助质粒用于提供AAV病毒所需的辅助基因，包装质粒则包含有AAV病毒的复制和包装所需的基因。
二、细胞培养和扩增接下来需要选择一种适合AAV病毒生产的细胞系进行培养和扩增。
目前常用的细胞系有HEK293、HEK293T等。
细胞培养通常在无菌条件下进行，培养基中添加适当的抗生素以防止细菌污染。
培养细胞至合适的数量后，可以进入下一步操作。
三、转染和感染将构建好的质粒转染至细胞中，通常可以选择钙磷共沉淀法、聚乙烯醇（PEI）法等方法进行转染。
转染后，细胞需要一定时间以便质粒能够进入细胞并表达目标基因。
转染完成后，可以通过荧光染料或其他方法观察细胞是否成功感染。
四、病毒提取和纯化感染完成后，需要将病毒从细胞中提取出来。
首先，用适当的缓冲液洗涤细胞，然后用细胞裂解液破坏细胞膜，释放出内部的病毒颗粒。
接下来，通过离心等方法分离病毒颗粒和细胞碎片。
为了得到纯净的AAV病毒颗粒，还需要通过超速离心和梯度离心等步骤进行纯化。
五、病毒滴度测定病毒滴度测定是评估AAV病毒制备质量的重要指标。
常用的测定方法包括：限制稀释法、荧光定量PCR法、ELISA法等。
通过测定病毒滴度，可以了解病毒颗粒的浓度和纯度是否符合要求。
六、病毒质粒存储AAV制备完成后，通常将制备好的AAV病毒质粒存储在低温下，以便长期保存。
常用的存储方法包括：-80℃低温冷冻保存、液氮冷冻保存等。
AAV制备流程包括构建质粒、细胞培养和扩增、转染和感染、病毒提取和纯化、病毒滴度测定以及病毒质粒存储等步骤。
每个步骤都需要严格控制条件和操作要求，以确保制备出高质量的AAV病毒颗粒。
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Ｌ ｉｇ ｚ ｅ Ｌ ａ － ａ ， Ｉ ｅ Ｉ ｎ －ｈ ， Ｉ Ｊ Ｘｉｏ ｍｉｎ Ｌ Ｙｕ
（ ｅ ａｔ ｎ ｏ Ｍ ｃｏｉｌ ｙ Ｔａｊ ｄｃｌ ｎｖｒｔ，ｉｎｉ ３ ０ ７ ， ｈｎ ） Ｄ ｐ ｒ ｔ ｆ ｉｒｂｏ ｇ ，ｉ ｉ Ｍｅ ｉ ｉｅｓｙ Ｔａｊ ０ ０ ０ Ｃ ｉａ ｍｅ ｏ ｎｎ ａＵ ｉ ｎ
［ 摘要 ］目的 ： 建立使用传代细胞稳定大量地制 备高滴度的仙 台病毒 （ｅ 的方法 ， ＳＶ） 取代成本高 、 周期长 、 操作 繁琐 、 易 污染的鸡胚制备仙 台病 毒的方法 ， 用于实验研究。方 法： 首先 观测不 同细胞感染仙 台病毒后发生病变 的时 间、 程度 以
及产毒量 ， 确定仙 台病毒敏感细胞株并确定病毒产量高峰期 ， 连续在细胞 中传 ３ 代测量上述指标。 其次观测染毒时病
第 １卷 １ ５ 期 ２０ 年 ３ ０９ 月
天 津 医 科 大 学 学 报
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Ｖｏ ．１ ．Ｎｏ １ ５ ．１
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２ ３越 李 （ 天津 医科大学微生物学教研室， 天津 ３０ ７ ） ００ ０
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［ 中图分类号］ ３ ３ Ｒ ７ ［ 文献标识码 ］ Ａ ［ 文章编号 ］０ ６ ８ ４ （０ ９ ０ — ０ ３ ０ １０ — １７ ２０ ） １ ０ ２ — ４
Ａ ｅ ａ ａ ｉ ｅ ｍ ｅ ｈｏ ｏ ｒ ｄｕ ｉ ｇ ｉｅ ｅ ｐｒ ｐ ｒ ｔｖ ｔ ｄ ｆ ｒ ｐ ｏ ｃ ｎｇｈｉ ｈ ｔｔ ｒ Ｓ ｎｄａ ｉ ｕ ｉ ｒｓ ｖ
毒吸附时间不 同对病毒滴度 的影 响。综合分析后建立制备高滴度仙台病毒的方法。结果 ： 鼠脑胶质瘤细胞 Ｃ 大 ６株对
仙台病毒高度 敏感 ， 细胞出现病变所需时间短且明显 ， 病毒产 量最高 。仙 台病毒滴度 与染 毒时的吸附时间呈正相关 ， 病毒最佳 吸附时间为 ９ ｎ ０ｍｉ。接 种病毒后 ７ ２ ｈ收获 的病毒滴度最高 ， 平均为 １ Ｃ Ｄ ， １ Ｉ ∞ 并且病毒可 以在 细胞 内连 续 Ｔ 稳定传代 。 结论 ： 确认大 鼠脑胶质瘤细胞 ｃ ６株为仙 台病毒 的敏感细胞 。 且病 变快 、 明显 ， 毒产量高 。 病 为在体外深入研 究仙 台病毒和大量繁殖高滴度仙 台病毒提供了实验方法。 ［ 关键词】 台病毒 ； 仙 病毒 扩增 ； 鼠脑胶质瘤细胞 ｃ 大 ６株 ； Ｃ ＭＤ Ｋ细胞 ； Ｅ Ｏ细胞 ＶＲ