昆明鼠胚胎干细胞系建立中原代克隆生长及其传代方法的研究
昆明小鼠胚胎干细胞建系的初步研究
ｏ１。 ｇ ｉ ｉ 。 。
２ｅ．ｏ ０ｃ １月 Ｄ年２ ０． ＠ ８
文章 编 号 ：１ ｏ ３ ６ （ ０ ８ ０ —０ ２ —０ ０ ８— ４ ４ ２ ０ ） ４ ３ ９ ６
昆 明 小 鼠胚 胎 干 细胞 建 系 的初 步研 究
中 图 分 类 号 ：Ｑ２ ４ Ｑ ５ ． ３ ５ ； ９９８７ 文 献 标 识 码 ：Ａ
Ｐｒｍ ａ ｙ ｓ ｕ ｙ ｏ ｓ ａ ｌｓ ｉ ｒ ｔ ｄ ｎ ｅ ｔ ｂ ｉｈｍ ｅ ｔ ｏ ｍ ｂ ｙ ｎｉ ｔ ｍ ｅ ｌ ｎ ｆｅ ｒ ｏ ｃ ｓ ｅ ｃ ｌｓ ｆｏ ｕ ｍ ｉ ｏ ｓ ｒ ｍ Ｋ ｎ ｎｇ ｍ ｕ ｅ
小 鼠 胚胎 干 细 胞 （ ｕｅＥ ｒｏ ｉ Ｓｅ ｅｓ Ｍｏ ｓ ｍｂｙ ｎｃ ｔｍ Ｃ ｌ ，ｍＥ Ｃ 分 离 和 传 代 的 影 响 因 素 ，设 计 两 个 实 验 ： （ ） 不 ｌ Ｓ） １
同孕 期 （ ． ３ ５ｄ或 ４ ５ｄ 的囊 胚 对 胚 胎 干 细 胞 分 离 效 率 的 影 响 ； （ ） 第 ５代 后 ，不 同传 代 方 法 （ 械 法 或 ． ） ２ 机 酶 消 化 法 ）对 ｍＥ Ｃ 传 代 的 影 响 。结 果 显 示 ：在 ３ ５ｄ孕 期 时 ，胚 胎 为 扩 展 囊 胚 ，在 ４ ５ｄ时 为 孵 化 囊 胚 ， Ｓ ． ．
Ｅｘ ｅ ｉ ｎ ＷＯ ｆ ｃ ｓ ｄ ｏ ｈ ｆｅ ｔ ｆ ａ ｓ ｇ ｎ ｅｈ ｄ （ ｃ ａ ｉａ ｒｅ ｚ ｍａｉ ｔ ｏ ） ｏ ｈ ｐ ｒｍｅ ｔｔ ｏ ｕ ｅ ｎ ｔ ｅｅ ｆｃ ｓ ａ ｉｇ ｍ ｔ ｏ ｓ ｍｅ ｈ ｎｃ ｌ ｎ ｙ ｔｃｍｅ ｈ ｄ ｏ ｐ ｏ ｎｔｅ
戢开丽 ，仇 恒滨，严为巧 ，庄新杰 ，段亚苹 ，张明，卢盛晟 ，卢克焕
干细胞的建系
干细胞的建系干细胞(stem cells, SC）是一类具有多向分化潜能和自我复制能力的原始的未分化细胞，是形成哺乳类动物的各组织器官的原始细胞。
可分为胚胎干细胞（embryonic stem cell, ES细胞）和成体干细胞（somatic stem cell)。
干细胞系的建立，对讨论基因在分化发育过程中的表达与调控，建立转基因动物、基因敲除动物和基因打靶动物，以及制备人类疾病动物模型等讨论具有重大意义。
目前，小鼠胚胎干细胞体外培养技术最为成熟。
一、干细胞分别材料的猎取与处理按照干细胞所处的发育阶段可分为胚胎干细胞和成体干细胞两大类。
①胚胎干细胞(ES细胞）是一种高度未分化细胞。
它具有发育的全能性，能分化出成体的全部组织和器官。
可由哺乳动物的囊胚内细胞群或者床后胚胎组织生殖嵴的原始生殖细胞（primordial germ cells, PGCs）中分别获得。
②成体干细胞是指存在于组织的特定区域内的未分化细胞，数量极少，在数年内都保持不分裂的状态，惟独当组织受到损伤时才被激活，开头分裂。
成体干细胞主要存在于脑、骨髓、外周血液、血管、骨骼肌、皮肤和肝脏，成体干细胞在培养时光上有限制，并且只能分化为限定类型的几种细胞。
成体干细胞表面有许多特别标志，利用这些标志，采纳荧光细胞分别器从细胞悬液中的分别纯化出成体干细胞。
二、干细胞的分化抑制培养胚胎干细胞是从动物胚胎内细胞团或原始生殖细胞分别的具有全能性的细胞，在遗传学、发育生物学和细胞工程领域具有广大的应用前景。
抑制胚胎干细胞分化和促进胚胎干细胞增殖是克隆胚胎干细胞的关键，添加白血病抑制因子（LIF）能有效提高胚胎干细胞克隆率、抑制干细胞的分化。
三、干细胞的生物学性状与鉴定干细胞具有自我更新复制的能力，能够产生高度分化的功能细胞。
胚胎干细胞的发育等级较高，是全能干细胞，而成体干细胞的发育等级较低，是多能干细胞或单能干细胞。
干细胞的发育受多种内在机制和微环境因素的影响。
高二生物期末测试题
期末测试题生物试卷一、选择题1. 关于动物细胞膜的叙述,错误．．的是A。
细胞膜含有糖脂和糖蛋白 B. 细胞融合与细胞膜的流动性有关C。
ATP为CO2分子通过细胞膜提供能量 D. 细胞膜上的大多数蛋白质是可以运动的2．下列有关生物学实验的叙述中,正确的是A．叶绿体中不同色素在层析液中溶解度不同，可利用纸层析法进行分离B．采用样方法和标志重捕法可分别调查植物的种群密度和动物的丰富度C．利用显微镜观察核酸在细胞中的分布及植物细胞有丝分裂，细胞需保持活体状态D．蔗糖溶液浓度由0。
3g/mL换成3。
0g/mL，植物细胞质壁分离与复原的效果会更明显3．下图为人体某细胞所经历的生长发育各个阶段示意图，图中①～⑦为不同的细胞,a～c表示细胞所进行的生理过程.据图分析,下列叙述正确的是A．与①相比，②③④的分裂增殖能力加强，分化能力减弱B．⑤⑥⑦的核基因相同，细胞内的蛋白质种类和数量也相同C．②③④的形成过程中发生了基因分离和自由组合D．进入c过程的细胞,酶活性降低，代谢减慢继而出现凋亡小体4. 下列发生了细胞分化且能体现体细胞全能性的生物学过程是A．玉米种子萌发长成新植株 B．小鼠骨髓造血干细胞形成各种血细胞C．小麦花粉经离体培养发育成单倍体植株 D．胡萝卜根韧皮部细胞经组织培养发育成新植株5．关于人体细胞结构和功能的叙述，正确的是A．在细胞核内RNA能够传递和表达遗传信息B．核糖体是蛋白质合成和加工的主要场所C．线粒体内膜蛋白质和脂质的比值大于外膜D．高尔基体与有丝分裂过程中纺锤体形成有关6。
生物兴趣小组在室温下进行了酵母菌无氧呼吸的探究实验(如图）下列分析错误的是A．滴管中冒出的气泡是反应产生CO2的结果B．试管中加水的主要目的是制造无氧环境C．若试管中的水换成冷水，气泡速率下降水D．被分解的葡萄糖中的能量一部分转移至ATP,其余的存留在酒精中7．生物的变异与生物的进化，两者关系为A．变异方向与进化方向相同B．变异是不定向的，进化是定向的C．进化促进了变异的出现D．进化速度决定了变异速度8．下列关于氨基酸和蛋白质的叙述，错误的是A．甲硫氨酸的R基是—CH2—CH2—S—CH3，则它的分子式是C5H11O2NSB．酪氨酸几乎不溶于水，而精氨酸易溶于水，这种差异是由R基的不同引起的C．n个氨基酸共有m个氨基,则这些氨基酸脱水缩合成的一个多肽中的氨基数必为m－nD．甜味肽的分子式为C13H16O5N2，则甜味肽一定是一种二肽9．生物实验中常常需要设置对照，以下对照设置正确的是A．研究光照强度对植物光合作用的影响，分别在黑暗和光照条件下进行B．探究温度对酶活性的影响，只需设置0℃和100℃即可C．探究Ca2+的吸收是否为主动运输,使细胞外Ca2+浓度大于或小于细胞内液D．研究细胞核的功能，把蝾螈的受精卵横缢成有核和无核二部分10．以下二倍体生物的细胞中含有两个染色体组的是①有丝分裂中期细胞②有丝分裂后期细胞③减数第一次分裂中期细胞④减数第二次分裂中期细胞⑤减数第一次分裂后期细胞⑥减数第二次分裂后期细胞A．①②③ B．①③⑤ C．①③⑤⑥ D．①④⑤⑥11．在某一种群中随机的抽出100个个体，测得某种性状的基因型为DD、Dd、dd的个体所占比例为10%、85％、5%，但是由于某种环境的变化,基因型为dd的个体被逐渐淘汰。
小鼠转基因实验报告(3篇)
第1篇一、实验背景随着生物技术的飞速发展，转基因技术在医学、农业等领域发挥着越来越重要的作用。
小鼠作为生物医学研究中常用的实验动物，其基因编辑技术的应用为疾病模型构建、药物筛选和基因功能研究提供了有力工具。
本实验旨在通过基因编辑技术构建转基因小鼠模型，研究特定基因在小鼠体内的表达和功能。
二、实验材料1. 实验动物：C57BL/6小鼠，雄性，8周龄。
2. 基因构建材料：目的基因（GFP基因）、启动子（CMV启动子）、荧光素酶报告基因（Luc基因）、pEGFP-C1质粒载体、pGL3-Basic质粒载体。
3. 实验试剂：限制性内切酶、DNA连接酶、T4 DNA连接酶、DNA聚合酶、PCR引物、Trizol试剂、RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒、细胞培养试剂等。
4. 仪器设备：PCR仪、凝胶成像系统、实时荧光定量PCR仪、细胞培养箱、显微镜等。
三、实验方法1. 目的基因构建：将GFP基因和Luc基因分别插入到pEGFP-C1和pGL3-Basic质粒载体中，构建重组质粒。
2. 重组质粒转染：将构建好的重组质粒通过脂质体转染法转染C57BL/6小鼠胚胎干细胞（ES细胞）。
3. 转基因小鼠胚胎细胞筛选：通过GFP荧光筛选，得到阳性细胞克隆。
4. 胚胎细胞传代培养：将阳性细胞克隆进行传代培养，筛选出稳定表达的细胞系。
5. 胚胎细胞冻存：将稳定表达的细胞系进行冻存，以备后续实验使用。
6. 胚胎移植：将冻存后的胚胎细胞进行移植，获得转基因小鼠。
7. 转基因小鼠表型鉴定：通过GFP荧光显微镜观察转基因小鼠体内GFP表达情况，并通过实时荧光定量PCR检测GFP基因在转基因小鼠体内的表达水平。
四、实验结果1. 重组质粒构建：成功构建了含有GFP基因和Luc基因的重组质粒。
2. 转基因小鼠胚胎细胞筛选：通过GFP荧光筛选，得到阳性细胞克隆。
3. 胚胎细胞传代培养：成功传代培养出稳定表达的细胞系。
4. 胚胎移植：成功获得转基因小鼠。
胚胎干细胞的制备及研究进展
胚胎干细胞的制备及研究进展摘要：胚胎干细胞(ES细胞)是从动物早期胚胎的内细胞团或原始生殖细胞分离出来的具有发育全能性的一种未分化的无限增殖细胞系。
ES细胞在动物克隆、转基因动物生产、细胞工程、组织工程、临床克隆治疗和发育生物学等方面的研究应用中起着重要的作用。
引言近年来，随着科学技术的不断发展，世界各国对胚胎干细胞的研究不断深入，取得了许多突破性的进展[1]。
科学证明小鼠ES细胞可以分化为心肌细胞、造血细胞、卵黄囊细胞、骨髓细胞、平滑肌细胞、脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、内皮细胞、黑色素细胞、神经细胞、神经胶质细胞、淋巴细胞、胰岛细胞、滋养层细胞等。
人类ES细胞也可以分化为滋养层细胞、神经细胞、神经胶质细胞、造血细胞、心肌细胞等。
ES细胞不仅可以作为体外研究细胞分化和发育调控机制的模型，而且还可以作为一种载体，将通过同源重组产生的基因组的定点突变导入个体[2]。
这意味着ES细胞将在动物克隆、转基因动物生产、细胞工程、组织工程、临床克隆治疗和发育生物学等方面发挥重要作用，为人类攻克癌症等疑难杂症开辟新的道路。
1胚胎干细胞胚胎干细胞是由哺乳动物附植前早期胚胎的内细胞团细胞或附植后胚胎的原始生殖细胞(Primordial germ cells，PGCs)通过体外分离培养而建立的克隆细胞系。
它具有与早期胚胎细胞相似的形态，即胞体小、核大、胞浆少且具有正常的二倍体核型。
ES细胞最突出的特点是只生长不分化，且保持早期胚胎发育的全能性，在饲养层上或含有白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)的培养基中，可稳定传代，长期培养。
体外诱导分化可形成3个胚层的分化细胞。
另外，ES细胞还具有种系传递功能和具有培养细胞所有的特征[3]。
胚胎干细胞不但可用于研究哺乳动物胚胎早期发育和细胞谱系分化，还可对它的基因组进行操作，通过基因打靶、突变和转基因等技术，建立各种实验模型，研究发育、肿瘤、免疫以及人类遗传病等有关问题，大大推动和发展了哺乳动物生物学的研究。
小鼠骨髓间充质细胞原代培养及传代
小鼠骨髓间充质细胞原代培养及传代之flamerking图文版[精华]很多战友发email或PM向我询问小鼠MSC的培养方法，我零零散散地一个个回复过几次，由于我平时时间不是很多，所以回答地时候有些内容写的不是很详细。
今天又有一个战友PM我，询问我培养方法。
看来做小鼠MSC的战友越来越多。
一遍遍地重复写很费时间（想粘贴复制又找不到上次写的在哪～惨！），所以我想还是发贴公布一下。
其实我小鼠MSC在我的课题中不是主角，只是起一个control的作用，因此我在这方面的经验可能没有一些专门做小鼠MSC的战友丰富，不过我还是很愿意把我的经验写出来供大家参考，希望能够起到“抛砖引玉”的作用。
欢迎各位同道对我的方案进行批评和指正，与大家一起分享你们的经验和智慧。
提纲一，简版主要步骤及操作要点。
二，完整版1. 试剂及材料准备2. 动物手术及取材3. 原代细胞培养4. 细胞传代5. 讨论时间关系，今天先给个简版。
我先顶一下,由于我还是新手,故不能说是经验介绍,只好讲让你们指出缺点,谢谢斑竹1. 试剂及材料准备MEM,10%FCS,手术器械,培养瓶,200目滤网,5ml注射器2. 动物手术及取材CR小鼠1只,酒精浸泡5分钟,取股,胫,肱骨,用基培冲出骨髓,滤过,1000转离心,完培重悬,接种于25厘米培养瓶3. 原代细胞培养:,3天后首次换液,自己发现一周贴壁细胞就铺满达90%,自行传代4. 细胞传代:消化下来很少,能下来的增长很慢5. 讨论:没经验欢迎斑竹的继续讲解,希望有经验的老师们能不啬指教羽之无限版主,能有空再讲讲吗这几天,我的原代就是不长,42天了,25平方厘米的培养瓶还未铺慢,不能传代真是天天盼着你啊呵呵，不好意思，最近我的sony笔记本又坏了，上次坏了几次维修部修不好，给我换了台新的，结果以用了没2个月又不能启动了，真是麻烦，我的资料都在里面，最近实验又忙，没空去维修部……不过明天我就去了。
……呵呵，跑题了。
胚胎干细胞的研究进展和应用前景
胚胎干细胞研究现状及应用前景摘要：作为一类既有自我更新能力，并具有多向分化潜能的细胞，胚胎干细胞具有非常重要的理论研究意义和临床应用前景[1]。
胚胎干细胞已被广泛用于生命科学的许多领域, 它潜在的医学应用也成为世界范围内的研究热点。
本文主要概述了目前胚胎干细胞在基础研究及临床上应用的研究进展并展望了今后研究的方向。
关键词：胚胎干细胞生物特性克隆应用干细胞是一类具有自我更新和无限分化潜能的细胞，它包括胚胎干细胞和成体干细胞，特别是胚胎干细胞是当前国内外医学和生物学领域研究的重点。
胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells，ES Cells)是由早期胚胎内细胞团(Inner cell mass，ICM)(桑葚胚，囊胚)或原始生殖细胞(Primordial germ cells，PGCs)经体外分化抑制培养筛选出的一种多潜能细胞。
胚胎干细胞可以在体外稳定的自我更新，可以在长时间继代培养后仍维持正常的二倍体染色体结构；具有与早期胚胎细胞相似的形态特征和很强的分化能力，在一定的条件培养下，它可以无限增殖并分化成为全身200 多种细胞类型，例如：人类ES 细胞可以分化为肌细胞、神经细胞[2]、内皮细胞、造血干细胞、骨髓细胞等，并可进一步形成机体所有组织、器官参与个体的发育过程，可称为是打开人类胚胎发育大门的一把“万能钥匙”。
1.胚胎干细胞的生物学特性1.1 胚胎干细胞的形态生化特性胚胎干细胞都具有相似的形态特点，与早期胚胎细胞相似，细胞较小，核质比高，细胞核明显，有一个或多个核仁，染色质较分散，细胞质内除游离核糖体外，其他细胞器很少；体外培养细胞呈多层集落状生长，紧密堆积在一起，无明显细胞界限。
细胞的染色体均为稳定的二倍体核型。
胚胎干细胞表达早期胚胎细胞的表面抗原，转录因子Oct- 4 为目前广泛用于鉴定胚胎干细胞是否处于未分化状态的一个重要的标记分子。
研究发现，它最早表达于胚胎8细胞时期，一直到细胞发育至桑椹胚时期，在每个卵裂球中都可检测到大量的Oct- 4 的表达产物，这之后Oct- 4 的表达局限于内细胞团细胞。
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤以下是小鼠胚胎干细胞的培养实验步骤：1.准备培养基和细胞培养器材：-将培养基预热至37摄氏度。
-准备含有培养基的无菌试管、离心管和细胞培养板。
-洗手并戴上合适的培养操作手套。
2.预处理培养皿：-用无菌PBS（磷酸盐缓冲液）将细胞培养板彻底洗涤，去除残留的培养基和细胞残留物。
-用0.1%胰蛋白酶溶液或0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液将细胞培养板上的细胞进行脱落。
-将细胞均匀地分布在预处理的培养皿中，使其形成单层细胞。
3.检查细胞数目和品质：-用显微镜检查细胞的形态和活力。
-用细胞计数计算细胞的数目。
-计算细胞的分裂倍增时间。
4.细胞传代：-按照需要的细胞密度将细胞从一个培养皿转移到另一个培养皿。
-用0.05%胰蛋白酶-EDTA将细胞从培养皿上脱落。
-投入适当比例的培养基到新的培养皿中，使其形成单层细胞。
5.制备小鼠胚胎纤维母细胞：-从小鼠胚胎体内收集纤维母细胞。
- 将纤维母细胞转移到含有DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）和10%胎牛血清的细胞培养皿中。
-培养纤维母细胞在37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中直至细胞接触起离皿表面。
6.制备和维持小鼠胚胎干细胞：-转接分裂期的小鼠胚胎干细胞到新的培养皿中。
-用无菌吸管或离心管的尖端轻轻挑取细胞克隆。
-将细胞克隆转移到含有mESC培养基（如DMEM、15%胎牛血清、2mML-谷氨酰胺和1×LIF（小鼠白细胞介素-6）的细胞培养板中。
-在体外细胞培养中维持小鼠胚胎干细胞的自我更新和增殖。
7.细胞培养的常规维护：-定期更换新鲜的培养基。
-检查细胞的形态和活力。
-定期传代细胞，以保持其细胞数目和活力。
-控制培养基和细胞的污染。
以上是小鼠胚胎干细胞培养的一般步骤，实验过程可能因研究目的和实验室的要求而有所不同。
为了保证实验的准确性和可重复性，建议在实验过程中随时记录和保留实验数据，并使用正确的实验操作和生物安全规范。
胚胎干细胞的研究及其应用
动物繁殖技术学课程论文胚胎干细胞的研究及其应用姓名学号系名专业班级指导老师2017年1月1日胚胎干细胞的研究及其应用摘要：胚胎干细胞 (ES 细胞)是一类从早期胚胎内细胞团或原始生殖细胞分离和克隆出的、具有发育全能性和多能性的细胞。
ES 细胞在动物克隆、转基因动物生产、细胞工程、组织工程、临床克隆治疗和发育生物学、遗传学以及制作动物疾病模型等的研究应用中起着重要的作用。
本文介绍了胚胎干细胞的生物学特性, 国内外研究进展和研究动态, 阐明了建立 ES 细胞系的技术要点以及 ES 细胞的应用及发展前景。
关键词：:动物;胚胎干细胞;发育；研究进展目录1.ES 细胞的研究概况 (3)2.ES 细胞的形态学及其基本特征 (4)2.1 ES细胞的形态学特征 (4)2.2 ES 细胞的基本特征 (4)3. ES 细胞系的建立概况及建系的技术要点 (5)3.1 ES 细胞系的建立概况 (5)3.2 ES 细胞建系的技术要点 (5)4.ES细胞的应用与前景 (5)4.1 ES细胞与动物克隆 (5)4.2基因载体 (5)4.3加快组织工程发展 (6)4.4其他 (6)5.存在的问题 (7)6.参考文献 (8)胚胎干细胞 (Embryonic stem cells, Es细胞)是一种从早期胚胎内细胞团(Inner cellmass, ICM)或原始生殖细胞 (primor-dial germ cells, PGCs)经体外分化、抑制培养、分离和克隆得到的具有发育全能性的细胞。
目前, ES 细胞已经引起广大学者的注意和兴趣, 对 ES细胞的研究也取得了很大进展。
该细胞除细胞和细胞集落有一定形态和生长行为外 ,经细胞表面抗原检测、体内体外分化实验为阳性 ,核型正常并可产生嵌合动物个体。
目前 ,除小鼠 ES细胞分离克隆成功称ES细胞系以外 ,其它动物 ES细胞研究虽然获得很大进展 ,但只称作类 ES细胞系或 ES样细胞。
主要原因是未能证明 ,经嵌合体实验发生生殖腺嵌合的嵌合体。
小鼠骨髓间充质细胞原代培养及传代
小鼠骨髓间充质细胞原代培养及传代之flamerking图文版[精华]很多战友发email或PM向我询问小鼠MSC的培养方法，我零零散散地一个个回复过几次，由于我平时时间不是很多，所以回答地时候有些内容写的不是很详细。
今天又有一个战友PM我，询问我培养方法。
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一遍遍地重复写很费时间（想粘贴复制又找不到上次写的在哪～惨！），所以我想还是发贴公布一下。
其实我小鼠MSC在我的课题中不是主角，只是起一个control的作用，因此我在这方面的经验可能没有一些专门做小鼠MSC的战友丰富，不过我还是很愿意把我的经验写出来供大家参考，希望能够起到“抛砖引玉”的作用。
欢迎各位同道对我的方案进行批评和指正，与大家一起分享你们的经验和智慧。
提纲一，简版主要步骤及操作要点。
二，完整版1. 试剂及材料准备2. 动物手术及取材3. 原代细胞培养4. 细胞传代5. 讨论时间关系，今天先给个简版。
我先顶一下,由于我还是新手,故不能说是经验介绍,只好讲让你们指出缺点,谢谢斑竹1. 试剂及材料准备MEM,10%FCS,手术器械,培养瓶,200目滤网,5ml注射器2. 动物手术及取材CR小鼠1只,酒精浸泡5分钟,取股,胫,肱骨,用基培冲出骨髓,滤过,1000转离心,完培重悬,接种于25厘米培养瓶3. 原代细胞培养:,3天后首次换液,自己发现一周贴壁细胞就铺满达90%,自行传代4. 细胞传代:消化下来很少,能下来的增长很慢5. 讨论:没经验欢迎斑竹的继续讲解,希望有经验的老师们能不啬指教羽之无限版主,能有空再讲讲吗这几天,我的原代就是不长,42天了,25平方厘米的培养瓶还未铺慢,不能传代真是天天盼着你啊呵呵，不好意思，最近我的sony笔记本又坏了，上次坏了几次维修部修不好，给我换了台新的，结果以用了没2个月又不能启动了，真是麻烦，我的资料都在里面，最近实验又忙，没空去维修部……不过明天我就去了。
……呵呵，跑题了。
材料实验动物选用昆明种月龄小鼠体...
中文摘要作为一种常用的一线抗癫痫药，临床应用十分广泛。
但人们在长期的实验观察和临床观察中发现，长期服用苯妥英钠不仅对患者各组织、系统存在毒副作用，而且还会对学习、记忆等高级认知功能造成不同程度的损害，给患者本人及家庭、社会带来了沉重负担。
由于苯妥英钠损害学习、记忆的机制尚未完全清楚，因此尚缺乏有效的治疗药物。
聪颖颗粒是肖代齐教授集数十年治疗学习、记忆功能减退的经验总结而成的一中药复方。
具有补髓、化瘀、涤痰开窍、益智之功效。
动物实验研究表明，该方具有保护脑组织和增强记忆力、提高耐缺氧能力、提高机体免疫功能等童幽作用。
临床观察证明，本方可明显改善学习、记忆障碍患者的症状。
本课题利用现代医学理论和研究方法，主要从脑内单胺类神经递质、血清叶酸探讨其与苯妥英钠导致的学习、记忆障碍的关系，研究聪颖颗粒对苯妥英钠致学习，记忆障碍小鼠的作用机理，为临床用药提供一定的理论依据。
协法：以苯妥英钠２５ｍｇ／Ｉ＜ｇ·日灌服，建立学习、记忆障碍小鼠模型，随塑：些！垦堂堕—堡兰里望竺兰生！————一机分为模型组、脑复康组、聪颖颗粒低剂量组、聪颖颗粒高剂量组，同时建立正常对照组，以脑内去甲肾上腺素（ＮＥ）、多巴胺（ＤＡ）、５－羟色胺（５－ＨＴ）的含量及血清叶酸含量为指标，以跳台法为辅进行研究。
结果：聪颖颗粒能显著改善学习、记忆障碍小鼠的学习、记忆能力（Ｐ＜Ｏ．０１），且随剂量增加而作用更加显著。
聪颖颗粒能显著改善学习、记忆障碍小鼠脑内ＮＥ、ＤＡ、５一ＨＴ含量（Ｐ＜Ｏ．０１）。
聪颖颗粒能显著改善学习、记忆障碍小鼠血清叶酸含量（Ｐ＜Ｏ．０１），且随剂量增加而作用更加显著．结论：聪颖颗粒能显著改善苯妥英钠导致的学习、记忆障碍小鼠的学习、记忆能力，提高模型小鼠脑内单胺类神经递质的含量，增加血清叶酸的习、记忆障碍有一定疗效，含量。
提示值得进一步主是词：苯妥英钠单胺类神经递质叶酸鲰颖颗粒型：生：！！堕堂堕堡！：型！些堕苎—————一ＡＢＳＴＲＡＣＴＯｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｐｈｅｎｙｔｏｉｎｓｏｄｉｕｍｉｓｏｎｅｏｆｔｈｅｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｌｙａｎｔｉｅｐｉｌｅｐｔｉｃｔｈｅｌｏｎｇ—ｔｌｍｅｄｒｕｇｓ，ａｎｄｉｓｅｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙｕｓｅｄｉｎｃｌｉｎｉｃａｌｓ．Ｂｕｔｄｕｒｉｎｇｃｌｉｎｉｃａｌｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ。
小鼠胚胎干细胞
固定，Giemsa染色。通过形态和染色鉴定 ES细胞克隆。分化细胞的克隆着色浅淡。 计数克隆总数和ES细胞克隆占克隆总数的 比例。
2.3 提高效率的改良技术
初次接种时，将培养基中的FBS增加至
25%。 选用低糖DMEM，并在培养基中添加核 苷。 分离延迟发育的胚胎，即经卵巢切除和 使用孕酮而不能植入的胚胎 接种前使用免疫溶解法去掉囊胚外面的 滋养层细胞。
1.3 内细胞团的分离和培养
免疫外科学方法 显微外科学方法 组织培养法
免疫外科法
利用囊胚腔对抗体的不通透性，特异地杀死囊胚 外层的滋养层细胞，而仅仅保留内细胞团。 原理是将胚泡去除透明带，与抗小鼠血清共同孵 育一段时间，再添加新鲜豚鼠血清（补体），在 补体的作用下，外层滋养层细胞被溶解破坏，用 眼科手术刀挑去死的滋养层细胞即可。
没有明显的胞间界限，边缘可见少量扁平上皮细胞或成纤维
样细胞（常见于初期代次和无饲养层培养的 ESCs）。
在饲养层细胞上的 小鼠ES细胞克隆
在明胶包被的培养 皿中的小鼠ES细胞 克隆
3.2 病原体检查
待检测细胞至少需要在无抗生素的条件下培 养3代。筛查细胞上清和细胞悬液中所有种 类的小鼠病原体。
分散过程要注意使用温和的手段，将外
生物分散成含有5-10个的小细胞团。
1.4 首个ES细胞样克隆的扩增
经过首次分散后，通常生长缓慢，需要耐
心等待小克隆的出现，一旦确定细胞生长， 就要再次每天观察培养物。 可能三种生长情况：
非ES样/细胞类型的克隆生长；
主要为ES样克隆的生长；
ES样克隆和混合细胞类型克隆的生长。
STO细胞在10cm培养皿中铺满后，用 DMEM/10%NCS+10μg/ml丝裂霉素C孵育 2-3小时。
国家自然科学奖提名书
国家自然科学奖提名书( 年度)一、项目基本情况国家科学技术奖励工作办公室制二、提名意见（适用于提名机构和部门）三、项目简介干细胞和基因编辑是本世纪最重要的成果，使生命科学的理论和技术发生重大的改变，促进了对复杂疾病新的治疗方法，以及生物医药产业发展的根本性变革。
然而基于啮齿类为模型的药物研发体系最终实现临床转化的效率极低。
灵长类动物与人类在基因组、脑结构与功能、生殖生理等方面具有高度的相似性，被认为是人类疾病研究、相关技术产品开发，特别是干细胞和基因编辑安全性和有效性评价最理想的实验动物。
利用灵长类动物模型开展人类疾病的发病机理研究、探索有效的预防及治疗办法，是基础研究成果实现临床转化的重要桥梁。
项目长期坚持灵长类生殖生物学研究，在相关科技专项支持下，围绕早期胚胎发育调控、干细胞多能性和人类疾病灵长类动物模型建立等基础和应用的科学问题，历时年，发现如下：）系统地研究了灵长类动物生殖生理和早期胚胎发育相关科学问题，克服了猴辅助生殖技术的关键障碍，建立了高效灵长类动物的辅助生殖体系和阐明早期胚胎发育的调控机制，克服了灵长类体细胞核移植的瓶颈，首次实现猴体细胞克隆胚胎发育至囊胚，纠正了美国科学家以前认为灵长类克隆胚胎发育无法超过细胞的错误结论；）最早在我国开展灵长类干细胞的研究，率先建立了灵长类胚胎干细胞分离、培养和分化体系，建立了猴胚胎干细胞系的资源库，在全世界首次获得嵌合体猴，证明了猴干细胞的多能性即嵌合能力，为系统研究灵长类胚胎干细胞多能性及组织器官再生提供了坚实基础。
）在灵长类实验动物上开拓了基因工程技术以及应用，成功产生了我国首例、全球第三例转基因猕猴；在国际上首次创制了基因编辑灵长类动物疾病模型，并开展了相关致病机理的研究。
项目研究成果在、、、、、等领域内的顶级期刊发表论文多篇，总影响因子，引用次数。
其中篇代表性研究论文的累计影响因子，被包括、、等他引次，并多次被、等杂志正面评述。
先后获得云南省科技成果奖（自然科学类）二等奖项，中国细胞生物学会终身成就奖项，云南省科学技术奖（自然科学类）一等奖项。
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤
细胞的原代培养点击次数：540 作者：佚名发表于：2009-03-06 16:26转载请注明来自丁香园一、原代细胞培养原理原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。
借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制以及细胞的衰老、死亡等生命现象。
• 幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养• 掌握无菌操作技术• 了解小鼠解剖操作技术• 了解原代细胞培养的一般方法与步骤•了解培养细胞的消化分散• 了解倒置显微镜的使用二、实验材料• 实验动物：孕鼠或新生小鼠• 液体：细胞生长液（内含20%小牛血清）0.25%胰蛋白酶平衡盐溶液70%乙醇•器材：灭菌镊子、剪刀若干把灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯若干个吸管若干支酒精灯原代细胞培养方法三、胰酶消化法（1）胰酶消化法操作步骤——取材a. 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。
b. 把整个孕鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。
c. 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。
d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。
e. 剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。
f. 漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。
继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。
（2）胰酶消化法操作步骤——切割a. 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡盐溶液漂洗。
b. 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。
c. 静置，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。
（3）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
b. 加入3-5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。
《小鼠胚外内胚层(XEN)细胞系的建立及其生物学特性分析》范文
《小鼠胚外内胚层（XEN）细胞系的建立及其生物学特性分析》篇一一、引言小鼠胚外内胚层（XEN）细胞系作为胚胎发育过程中的重要组成部分，在再生医学、药物研发等领域具有广泛的应用前景。
本文旨在介绍XEN细胞系的建立过程，并对其生物学特性进行详细分析，以期为相关研究提供参考。
二、XEN细胞系的建立1. 材料与方法（1）材料准备：选取健康的小鼠胚胎，准备所需的培养基、血清、胰酶等实验材料。
（2）方法：将小鼠胚胎进行适当处理，获取胚外内胚层组织，将其置于含有生长因子和特定培养基的培养皿中，进行细胞培养和扩增。
2. 细胞系的建立过程（1）原代细胞的获取：从小鼠胚胎中分离出胚外内胚层组织，经过胰酶消化后，获得原代细胞。
（2）细胞培养与传代：将原代细胞接种于培养皿中，加入生长因子和特定培养基，进行细胞培养和扩增。
当细胞达到一定密度时，进行传代。
（3）细胞系的建立：经过多次传代后，获得稳定的XEN细胞系。
三、XEN细胞系的生物学特性分析1. 形态学特征XEN细胞系在显微镜下呈现典型的上皮样或成纤维样形态，具有多层次、多核的形态特点。
随着传代次数的增加，细胞形态逐渐稳定。
2. 生长特性XEN细胞系在适宜的培养条件下，表现出良好的生长增殖能力。
通过测定细胞的生长曲线，发现XEN细胞系具有较快的生长速度和较强的扩增能力。
3. 分子生物学特性通过对XEN细胞系进行基因表达谱分析、蛋白质组学分析等分子生物学实验，发现XEN细胞系具有与胚胎发育相关的基因和蛋白质表达特点。
此外，XEN细胞系还具有多能性和分化潜能，可分化为多种组织细胞类型。
4. 生物学功能分析XEN细胞系在药物研发、再生医学等领域具有潜在的应用价值。
通过实验发现，XEN细胞系对某些药物具有敏感性，可用于药物筛选和药效评价。
此外，XEN细胞系还可用于研究胚胎发育和疾病发生的机制。
四、结论本文成功建立了小鼠胚外内胚层（XEN）细胞系，并对其生物学特性进行了详细分析。
昆明小鼠原位胃癌移植模型的建立实验具体步骤及说明
昆明小鼠原位胃癌移植模型的建立实验具体步骤及说明采用两种不同的肿瘤细胞株分别在昆明小鼠胃部原位建立胃癌模型。
造模后对原位移植瘤的生长速度进行观察，并对胃癌组织中v EG F 的表达及M v D 进行检测，结果显示模型的成瘤率均为100%。
昆明鼠胃部原位移植瘤的生长速度快，缩短了胃癌模型建立周期，为筛选抗胃癌药物提供了有效简单的模型。
一、昆明小鼠皮下移植瘤传代S180 细胞注人小鼠腹腔内，进行体外培养，5 -7 d 可见小鼠腹部肿胀，有腹水，收集腹水，细胞计数，调整细胞密度在2 x 106- 2x 107注射到昆明小鼠的腋部皮下形成实体瘤。
待肿瘤生长至直径1.5 -2.0 cm 之间，处死小鼠，按上述方法反复传3 代后作为原位移植用瘤源。
二、原位移植模型的建立1. 取一中传3 代后生长4 周左右处于对数生长期的昆明小鼠，常规消毒，从腋部皮下剥取肿瘤组织。
2. 剔除纤维包膜、血管，切开去除中间坏死的组织，选取生长良好、呈淡红色、鱼肉状的瘤组织，剪成约1-2 mm ，小块备用。
3. 昆明小鼠术前禁食12 h，以0.5% 戊巴比妥钠腹腔内注射(50 mg/kg)麻醉，固定小鼠，常规消毒皮肤，用手术剪刀在小鼠沿左侧腹部正中旁线切开，切口约1.5 cm ，小心暴露腹膜、胃壁，用一次性注射针头轻微损伤胃大弯中部浆膜层，以出血为度，用无齿镊将破损处向内推压，使局部胃壁形成凹完，植入1 块1-2 mm3瘤组织块，并在瘤表面滴1 滴OB生物胶，使其覆盖瘤组织表面，然后分层关腹。
4. 人胃癌组织块昆明小鼠原位种植后，逐日观察裸鼠全身状况，运动情况，腹部体征。
若实验过程中出现动物死亡，记录时间，并全面探查腹腔，观察胃肿瘤原位生长情况。
三、处死动物及移植瘤的观察定时观察所有裸鼠全身状况、运动情况、腹部体征、移植后脱颈处死解剖，取原位瘤。
所取标本经10%甲醛固定、石蜡包埋、切片、HE染色，做组织病理学检查。
四、免疫组化染色1. 采用EnVision免疫组织化学技术检测VEGF蛋白表达。
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中国计划 生育 学杂志 ２ ０ １ ３ 年３ 月 第２ １ 卷第３ 期
Ｃ ｈ ｉ
ｎ Ｊ Ｆ Ⅲ Ｐ ｌ ａ ｎ ｎ ，Ｖ ｏ １ ． ２ １ ， Ｎｏ ．３， Ｍａ ｒ ｃ ｈ ２ ０ １ ３
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技 术 与方 法 ・
昆 明 鼠胚 胎 干 细 胞 系 建 立 中原 克 隆 生 长 及 其 传 代 方 法 的 研 究
李 娟 王磊光 魏 斌 董 云玲 盖 凌 王洪岩 吴爱华 邱 毅
山东省计划生育科学技 术研 究所 ， 山东 省优 生重点实验室 （ 济南 ， ２ ５ ０ ０ ０ ２ ）
摘
要 目的： 探讨昆明 鼠胚胎 内细胞 团分 离方法 、 原 代干 细胞克 隆分 离时机及 干 细胞传代 方法 对干细 胞建 系效率
干细胞建 系。 关键词 昆明鼠 胚胎干细胞 内细胞 团 传代 细胞系
ｄ ｏ ｉ ： １ ０ ． ３ ９ ６ ９ ／ ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ０ ０ ４—８ １ ８ ９ ． ２ ０ １ ３ ． ０ ３
Ｓ ｔ ｕｄ ｙ ｏ ｎ ｔ ｈ ｅ ｐ ｒ ｉ ｍａ ｒ ｙ ｃ ｌ ｏ ｎ ｉ ｅ ｓ ｃ ｕ ｌ ｕｒ ｔ ｅ ａ ｎ ｄ ｐ ａ ｓ ｓ ａ ｇ ｅ ｏ ｆ ｅ ｍｂ ｒ ｙ ｏ ｎ ｉ ｃ ｓ ｔ ｅ ｒ ｍ ｃ ｅ Ｈ ｓ ｆ ｒ ｏ ｍ Ｋｕ ｎ ｍｉ ｎ ｇ ｍｏ ｕ ｓ ｅ
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的影响 。方法 ： 取昆 明鼠 ３ ． ５ ｄ囊胚 建胚胎干细胞 系 ， 比较全胚培养法 与免疫外科 法两种 内细胞 团分离方法对 胚胎干
细胞建系效率 的影 响 ， 观察原代克 隆的分离 时机 ， 机械法传 代和酶消 化传代对 胚胎干 细胞建 系效率 的影 响 。结果 ： 全 胚培养法 ３ ０ 个 囊胚建系 ３ 个， 免疫外 科法 ３ ２ 个囊胚建 系 ４ 个， 两组 均可 以有效地 形成胚 胎干细胞 系 ； 昆 明鼠原代 干 细胞克隆分离最佳 时机是增殖 ４～ ６ ｄ ； ５ 代以前 的干细胞 以机 械传 代方 法较好 ， ５代后用 酶消化 法传代效 果较好 。结 论： 全胚培养法和免疫外科法均 能有效 建立昆 明鼠胚胎 干细 胞系 ， 采用 机械 化与酶 消化法 相结合 传代更 适合 昆 明鼠
Ｐ ｌ ａ ｎ ｎ ｉ ｎ ｇ， ， ｎ ２ ５ ０ ０ ０ ２
Ａ ｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ Ｏ ￣ｅ ｃ ｉ ｔ ｖ ｅ ： Ｔ ｒ ｙ ｔ ｏ ｉ ｎ ｖ ｅ ｓ ｔ ｉ ｇ ａ ｔ ｅ ｔ ｈ ｅ ｓ ｅ ｐ ａ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ ｉ ｎ ｎ ｅ ｒ ｅ ｍ ｂ ｙｏ ｒ ｎ ｉ ｃ ｃ ｅ ｌ ｌ ｍ ａ ｓ ｓ ｏ ｆ Ｋ ｕ ｎ ｍｉ ｎ ｇ ｍｏ ｕ ｓ ｅ ， ｓ ｅ ｐ ａ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ