经典：蛋白质相互作用技术研究的几种技术
蛋白质相互作用技术
PNAS， 2009
2Leabharlann 体内共表达体内共表达-共纯化
将要鉴定的两个基因分别克隆到两个含有不同标签 的载体中，然后在大肠杆菌中共表达，如果两个蛋 白相互作用可以采用类似GST-PULL-DOWN的方法鉴定 他们之间的相互作用。
体外共表达鉴定蛋白质相互作用 3 体外共表达鉴定蛋白质相互作用
注意：绝大部分工作应在4C进行；对照？ 注意：绝大部分工作应在4C进行；对照？ 4C进行
PNAS， 2009
5 串联亲和纯化鉴定蛋白质相 互作用和蛋白质复合体
Tandem affinity purification------------TAP
将靶蛋白与蛋白质标签融合并在天然宿主细胞 中表达，制备提取物， 中表达，制备提取物，然后采用标准的两步法 重获靶蛋白及与其相互作用的蛋白质组份。 重获靶蛋白及与其相互作用的蛋白质组份。
Coupled transcription/translation reaction
偶联的转录和翻译过程
Continuous exchange cell-free (CECF) principle
持续交换和非细胞体系的原理
偶联的转录和翻译过程
T7T7-RNA polymerase
gene
gene
E.coli lysate
Inhibitory by-products by-
microtiterplate 96x RTS 100
PCR tubes 4x12 RTS 100
RTS 500 devices 8x
microcentrifuge tubes
4 免疫共沉淀鉴定蛋白质相互作用
当细胞在非变性条件下 裂解时， 裂解时，完整细胞内许 多蛋白质之间的结合保 持下来， 持下来，因而可以据此 检测生理条件下相关蛋 白质间的相互作用。如 白质间的相互作用。 果蛋白质X用其抗体免 果蛋白质 用其抗体免 疫沉淀，在细胞内与X 疫沉淀，在细胞内与 稳定结合的蛋白质Y也 稳定结合的蛋白质 也 可能沉淀下来。 可能沉淀下来。蛋白质 Y的沉淀是基于与 的物 的沉淀是基于与X的物 的沉淀是基于与 理相互作用， 理相互作用，被称为免 疫共沉淀。 疫共沉淀。
研究蛋白互作的七种方法总结
研究蛋白互作的七种方法总结蛋白互作方法总结蛋白质间的相互作用构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分，蛋白-蛋白互作网络与转录调控网络对调控细胞及其信号有重要意义。
本文总结了七种蛋白质相互作用的方法。
01免疫共沉淀技术免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
其基本原理是：细胞裂解液中加入抗体，与抗原形成特异免疫复合物，经过洗脱，收集免疫复合物，然后进行SDS-PAGE及Western blotting分析。
但这种方法有两个缺陷：一是两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；二是必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。
02pull-down技术蛋白质相互作用的类型有牢固型相互作用和暂时型相互作用两种。
牢固型相互作用以多亚基蛋白复合体常见，最好通过免疫共沉淀(Co-IP) 、Pull-down技术或Far-western法研究。
Pull-down技术用固相化的、已标记的饵蛋白或标签蛋白(生物素-、PolyHis-或GST-)，从细胞裂解液中钓出与之相互作用的蛋白。
通过Pull-down技术可以确定已知的蛋白与钓出蛋白或已纯化的相关蛋白间的相互作用关系，从体外传路或翻译体系中检测出蛋白相互作用关系。
03酵母双杂交系统酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。
其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。
将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。
在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。
蛋白质相互作用技术
蛋白质相互作用技术1. 引言蛋白质是生物体内最基本的功能分子之一，它们参与了几乎所有生物过程的调控和实施。
蛋白质相互作用是指不同蛋白质之间的相互作用，它在细胞信号传导、代谢调控、基因表达等许多生物过程中发挥着重要作用。
研究蛋白质相互作用可以揭示细胞内分子网络的结构和功能，有助于理解疾病的发生机制，并为药物设计提供新的靶点。
在过去的几十年中，科学家们开发了许多蛋白质相互作用技术，以帮助他们研究这个复杂而重要的领域。
本文将介绍几种常见的蛋白质相互作用技术，并讨论它们的原理、应用和优缺点。
2. Yeast Two-Hybrid (Y2H) 技术Yeast Two-Hybrid (Y2H) 技术是一种常见且广泛应用于蛋白质相互作用研究的方法。
它利用酵母细胞内的转录激活子域和DNA结合域之间的相互作用来检测蛋白质之间的相互作用。
Y2H技术包括两个关键步骤：构建表达融合蛋白的酵母菌株和检测蛋白质相互作用。
在构建菌株的过程中，目标蛋白质被连接到转录激活子域上，而可能与之相互作用的蛋白质被连接到DNA结合域上。
如果两个融合蛋白质发生相互作用，则可以观察到报告基因（如LacZ或His3）的表达。
Y2H技术具有许多优点，如高通量性、可定量性和对未知配体的筛选能力。
然而，它也存在一些限制，如假阳性和假阴性结果的可能性以及只能在酵母细胞内进行实验等。
3. 共免疫沉淀 (Co-IP) 技术共免疫沉淀 (Co-IP) 技术是一种通过抗体选择性地富集特定蛋白质复合物的方法。
它基于抗体的高特异性和亲和力，可以用于检测蛋白质与其他分子（如蛋白质、DNA或RNA）之间的相互作用。
Co-IP技术包括以下几个步骤：细胞裂解、抗体结合和沉淀。
首先，细胞被裂解以释放蛋白质复合物。
然后，目标蛋白质与特异性抗体结合形成免疫复合物。
最后，通过沉淀技术将免疫复合物从样品中富集出来，并进行进一步的分析。
Co-IP技术是一种较为简单且有效的方法，可以用于鉴定蛋白质相互作用伙伴、研究蛋白质复合物的组成和功能等。
常用蛋白质相互作用研究技术的种类及基本原理
常用蛋白质相互作用研究技术的种类及基本原理蛋白质相互作用的本质其实是三种力，氢键，分子间作用力（范德华力）和疏水力，因为这三种力的作用距离都非常的短，所以相互作用的蛋白我们通常认为它们必定相互接近。
荧光共定位，在过去，这个技术一般用于细胞内辅助证明蛋白相互作用，前些年，如果是其他物种的蛋白质，你应用酵母双杂交系统验证了它们的相互作用，可能是假阳性。
白融合表达于原物种细胞当中，在高分辨显微镜下，如果两种荧光出现在同一位置，那么就证明它们空间上较为接近，很有可能产生了相互作用。
该研究方法首先将TAP 标签整合于该蛋白质的一端,标签由一个钙调蛋白结合多肤(CBP)与蛋白标签组成,并将 TEV 蛋白酶切位点插入二者之间,之后用带有TAP 标签的基因置换内源的蛋白基因并表达，且可与特定蛋白进行识别和结合裂解细胞,提取细胞总蛋白，并将所获总蛋白加入 IgG 亲和柱。
亲和柱上的 IgG 可与TAP 标签的ProA 端特异性结合，之后用洗脱液洗脱大多数非特异性结合蛋白,依次在洗脱液(合TEV 蛋白酶)洗脱和钙离子的协助下,获得高纯度的目的蛋白复合体。
经上述步骤所得的蛋白质复合体再进行SDS-PAGE 电泳分离及质谱分析,进而可发现其中的新组分或新蛋白复合物。
此种研究方法不仅能保持复合物结构的完整性,并且能够得到纯度较高的特异性。
因该技术的灵敏性、可靠性和特异性都优于传统的
酵母双杂交技术,尤其适用于研究蛋白质在生理条件下的相互作用。
但是,该技术在对高等真核细胞进行研究时却因原位蛋白标记难在真核细胞内进行，且易受内源蛋白的干扰等因素而具局限性。
蛋白互作常用的研究方法
蛋白互作常用的研究方法
蛋白质互作常用的研究方法包括酵母双杂交技术、免疫共沉淀和GST pull-down实验。
1. 酵母双杂交技术：主要用来进行互作蛋白的筛选，缺点就是假阳性较高，所以需要进行结果验证，一般可采用免疫共沉淀或GST-pull down实验进
行验证。
2. 免疫共沉淀：是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
是确定两种蛋白质在完整细胞内相互作用的有效方法。
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。
当用预先固化在argarose beads上的蛋白质A 的抗体免疫沉淀A蛋白，那么与A蛋白在体内结合的蛋白质B也能一起沉
淀下来。
再通过蛋白变性分离，对B蛋白进行Western blot检测，进而证明两者间的相互作用。
3. GST pull-down实验：是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试
验技术。
其基本原理是先构建靶蛋白-GST融合蛋白载体，然后进行体外表
达及纯化。
但是也存在一定局限性。
这些方法各有优缺点，应根据研究目的和具体情况选择合适的方法。
蛋白质相互作用 方法
蛋白质相互作用方法
有多种方法可以研究蛋白质相互作用。
以下是一些常见的方法：
1. 质谱法（Mass spectrometry）：通过测量蛋白质的质量和电荷比，可以确定蛋白质之间的相互作用。
这种方法常用于鉴定蛋白质与其配体的相互作用。
2. 亲和层析法（Affinity chromatography）：通过利用特定配体固定在固相材料上，可以将感兴趣的蛋白质从复杂样品中分离出来。
这种方法常用于鉴定蛋白质与配体的特异性相互作用。
3. 蛋白质组学法（Proteomics）：通过大规模鉴定和分析蛋白质样品中的蛋白质，可以揭示蛋白质之间的相互作用网络。
这种方法常用于研究整个蛋白质组的相互作用。
4. 核磁共振法（Nuclear Magnetic Resonance, NMR）：通过测量蛋白质分子在核磁共振场中的行为，可以确定蛋白质之间的相互作用模式。
这种方法常用于研究蛋白质的三维结构和动态变化。
5. 晶体学法（X-ray crystallography）：通过测量蛋白质晶体中的X射线衍射图像，可以确定蛋白质的高分辨率结构。
这种方法常用于研究蛋白质的空间构型以及与配体的相互作用。
6. 光谱法（Spectroscopy）：通过测量蛋白质在不同波长的光线下吸收、散射或发射的特性，可以确定蛋白质分子的结构和相互作用。
这种方法常用于研究蛋白质的构象变化和相互作用机制。
以上是一些常见的蛋白质相互作用研究方法，不同方法有不同的优缺点和适用范围，研究者常常结合多种方法来全面揭示蛋白质之间的相互作用。
请简述常用蛋白质相互作用研究技术的种类及基本原理。
请简述常用蛋白质相互作用研究技术的种类及基本原理。
蛋白质相互作用研究在生物学领域有着重要的作用。
得益于不断发展的技术，研究者们可以研究蛋白质的结构和功能，以及不同蛋白质间的相互作用关系。
目前，常用的蛋白质相互作用研究技术种类有质谱技术、原位免疫沉淀技术、二硫键蛋白质结合技术、蛋白质组学技术、荧光生物学技术、生物物理技术等，下面将对这些技术的基本原理做简要介绍：
1、质谱技术：质谱技术是利用质谱仪检测蛋白质结合位点或者其他化学变化，判断蛋白质之间的交互作用。
该技术可以检测蛋白质之间结合的Kd值，从而获取相关信息。
2、原位免疫沉淀技术：原位免疫沉淀技术是利用抗体对指定的蛋白质进行免疫定位，获取蛋白质的结合信息。
其原理是当抗体结合指定的蛋白质时，二者就会形成稳定的复合物，这种复合物会凝结沉淀，使得活动的蛋白质被相互定位。
3、二硫键蛋白质结合技术：二硫键蛋白质结合技术是利用二硫键修饰技术，使指定的蛋白质之间形成一种化学键，从而检测两个蛋白质之间的结合及相关结构信息。
4、蛋白质组学技术：蛋白质组学技术是利用分子杂交技术，以及高通量的测序技术，研究基因组中蛋白质的表达量及结构特征，以及它们之间的相互作用关系。
5、荧光生物学技术：荧光生物学技术是利用多种荧光探针，检测蛋白质之间的结合及其相关信息。
6、生物物理技术：生物物理技术是利用生物物理学测量原理，研究蛋白质结合及相关结构及动力学信息。
以上就是常用蛋白质相互作用研究技术的种类及基本原理，帮助研究者们更好地分析蛋白质及蛋白质之间的相互作用关系。
研究蛋白质相互作用的技术
研究蛋白质相互作用的技术蛋白质相互作用是生命体系中非常重要的一环，对于理解细胞的生物学功能、疾病的发生和治疗等具有重要的意义。
随着科技的发展和创新，研究蛋白质相互作用的技术也在不断地更新和完善。
本文将介绍一些目前常用的蛋白质相互作用研究技术，并探讨它们的优缺点以及在科学研究中的应用。
1. 酵母双杂交技术酵母双杂交技术是最早用于蛋白质相互作用研究的技术之一。
通过将目标蛋白质与酵母双杂交体系中的另一个蛋白质进行融合，可以检测它们是否发生相互作用。
该技术的优点在于操作简单，对大规模筛选具有较高的效率。
酵母双杂交技术也存在一些局限性，例如在体内可能并不真实反映蛋白质相互作用的情况，以及可能存在假阳性和假阴性结果。
2. 共免疫共沉淀技术共免疫共沉淀技术利用抗体对蛋白质进行特异性结合，然后通过沉淀来寻找蛋白质之间的相互作用。
这项技术可以在原核细胞和真核细胞中进行，能够检测细胞内、细胞间以及细胞外的蛋白质相互作用。
但是该技术也存在一些局限性，比如需要高质量的特异性抗体、较长时间和较高技术要求等。
3. 质谱联用技术质谱联用技术已成为蛋白质相互作用研究的重要手段之一。
例如蛋白质质谱分析技术（Protein-Protein Interaction Mass Spectrometry，PPI-MS）能够对蛋白质的相互作用进行高通量分析。
通过将免疫沉淀后的蛋白质进行质谱分析，可以鉴定蛋白质相互作用的配体。
质谱联用技术的优势在于高灵敏度、高特异性和高通量性，但需要高质量的蛋白质组学数据。
4. 荧光共振能量转移技术荧光共振能量转移技术（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET）是一种基于蛋白质间距离的技术，通过激发体系中的一个荧光蛋白（供体）来激发接受体系中的另一个荧光蛋白，从而检测蛋白质之间的相互作用。
该技术具有实时性、高灵敏度和高分辨率的特点，但也存在由于受到光源、色素、环境等外界因素影响的缺点。
蛋白质相互作用多种方法
蛋白质相互作用多种方法蛋白质是生物体中非常重要的分子，参与了多种生物学过程，包括信号转导、基因调控、代谢调节等。
蛋白质的相互作用对于维持生命活动的正常进行至关重要。
蛋白质相互作用是指两个或多个蛋白质之间通过各种方式进行的非共价结合，包括物理相互作用、化学相互作用和/或电荷引力相互作用。
现代生命科学研究中，为了解蛋白质之间的相互作用，常用以下多种方法。
1. Yeast two-hybrid (酵母双杂交实验)酵母双杂交实验是一种广泛应用于识别蛋白质相互作用的方法。
该方法利用酵母细胞内的转录活性（由分别附着于两个蛋白质相互作用区域的两个报告基因激活启动子的结合而引起），来检测蛋白质-蛋白质间的相互作用。
通过酵母双杂交实验，可以筛选出与感兴趣蛋白质相互作用的蛋白质。
2. Co-immunoprecipitation (共免疫沉淀)共免疫沉淀是一种直接检测蛋白质相互作用的方法。
通过将蛋白质与特定抗体结合，然后利用该抗体与约束于固体支持基质上的蛋白A/G结合，来获得目标蛋白及其相互作用伙伴的复合物。
之后将这些复合物进行洗涤、脱附以及分析，以确定相互作用的蛋白质。
3. Pull-down assay (下拉实验)下拉实验是一种筛选蛋白质相互作用的方法。
通过将目标蛋白质与特定的亲和素结合，然后将亲和素结合蛋白质附着于亲和素上，之后通过洗涤和分析来确定与目标蛋白质相互作用的蛋白质。
4. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (蓝原生聚丙烯酰胺凝胶电泳)蓝原生聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用于研究蛋白质复合物的方法。
利用这种电泳技术，可以在原生条件下分离和分析蛋白质复合物。
通过与其他检测方法（如共免疫沉淀）相结合，可以进一步确定复合物中各个亚基的相互作用关系。
5. Fluorescence resonance energy transfer (荧光共振能量转移)荧光共振能量转移是一种测量蛋白质之间相互作用的方法。
研究蛋白互作的七种方法总结
研究蛋白互作的七种方法总结蛋白互作方法总结蛋白质间的相互作用构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分，蛋白-蛋白互作网络与转录调控网络对调控细胞及其信号有重要意义。
本文总结了七种蛋白质相互作用的方法。
01免疫共沉淀技术免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
其基本原理是：细胞裂解液中加入抗体，与抗原形成特异免疫复合物，经过洗脱，收集免疫复合物，然后进行SDS-PAGE及Western blotting分析。
但这种方法有两个缺陷：一是两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；二是必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。
02pull-down技术蛋白质相互作用的类型有牢固型相互作用和暂时型相互作用两种。
牢固型相互作用以多亚基蛋白复合体常见，最好通过免疫共沉淀(Co-IP) 、Pull-down技术或Far-western法研究。
Pull-down技术用固相化的、已标记的饵蛋白或标签蛋白(生物素-、PolyHis-或GST-)，从细胞裂解液中钓出与之相互作用的蛋白。
通过Pull-down技术可以确定已知的蛋白与钓出蛋白或已纯化的相关蛋白间的相互作用关系，从体外传路或翻译体系中检测出蛋白相互作用关系。
03酵母双杂交系统酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。
其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。
将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。
在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。
蛋白质与蛋白质相互作用的技术
蛋白质与蛋白质相互作用的技术
蛋白质与蛋白质相互作用的技术主要包括酵母双杂交技术、免疫共沉淀技术、荧光能量转移技术、噬菌体展示技术等。
这些技术可用于研究蛋白质之间的相互作用，从而深入了解生命活动的机制。
1.酵母双杂交技术：这是一种有效的筛选蛋白质相互作用的方法，尤其适用
于大规模蛋白质之间相互作用的研究。
通过将目标蛋白与报告基因连接，在酵母细胞中检测报告基因的表达，可以确定目标蛋白与其他蛋白的相互作用。
2.免疫共沉淀技术：利用抗体与抗原之间的特异性结合，将目标蛋白与其他
相关蛋白一起沉淀下来，然后通过Western blot等技术对沉淀的蛋白质进行分析。
通过这种方法可以检测到目标蛋白与其他蛋白质的直接相互作用或者间接相互作用。
3.荧光能量转移技术：一种高灵敏度的检测蛋白质相互作用的方法。
该技术
利用荧光物质标记目标蛋白，通过检测荧光物质之间的能量转移，来间接检测蛋白质之间的相互作用。
4.噬菌体展示技术：将外源基因插入噬菌体外壳蛋白基因的技术，使外源基
因编码的蛋白质与噬菌体外壳蛋白融合，并在噬菌体表面展示出来。
通过该技术可以筛选与目标蛋白相互作用的蛋白质，并对相互作用进行定量分析。
蛋白质相互作用的研究方法
蛋白质相互作用的研究方法蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）研究方法可以分为生化方法、细胞生物学方法、生物物理化学方法和计算方法等多个方面。
以下将详细介绍几种常用的研究方法。
1. 酵母双杂交法（Yeast Two-Hybrid, Y2H）酵母双杂交法是一种广泛应用的PPI研究方法。
该方法利用酵母细胞中两个蛋白质结合后的活性报告基因表达，从而实现对蛋白质相互作用的筛选和鉴定。
该方法的优点是操作简单、高通量性能强，但也存在一些局限性，如可能存在假阳性结果和只能检测胞内相互作用。
2. 免疫共沉淀法（Immunoprecipitation, IP）免疫共沉淀法是一种常用的生化方法，用于鉴定蛋白质相互作用。
该方法基于抗体的特异性，将靶蛋白及其结合蛋白共同沉淀下来，通过蛋白质分析技术（如质谱分析）鉴定共沉淀的蛋白质。
该方法适用于研究细胞内和细胞间的蛋白质相互作用，但需要针对每个靶蛋白制备特异性抗体。
3. 原位近距离显微镜法（Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET）FRET是一种用于研究蛋白质相互作用的生物物理化学方法。
该方法通过将两个蛋白质分别与一对荧光染料标记，根据能量转移来检测蛋白质间的相互作用。
FRET可以在活细胞和组织中进行，具有高时空分辨率，但需要合适的显微镜设备和特定的染色体系。
4. 表面等离子体共振传感器法（Surface Plasmon Resonance, SPR）SPR是一种用于检测蛋白质相互作用的生物物理化学方法。
该方法通过检测表面等离子体共振信号的变化来定量分析蛋白质间的结合动力学和亲和性。
SPR具有高灵敏度和实时监测能力，可用于定量研究蛋白质相互作用，但需要具备专业的设备和表面修饰技术。
5. 结构生物学方法结构生物学方法包括X射线晶体学、核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance, NMR）和电子显微镜（Electron Microscopy, EM）等。
蛋白质相互作用的研究与应用
蛋白质相互作用的研究与应用近年来，随着人们对生命科学的深入研究，生物分子间的相互作用成为了学术界的热门话题。
其中，蛋白质相互作用作为一种重要的生物学现象，引起了广泛的关注。
本文将从研究蛋白质相互作用的方法、应用以及存在的问题三个方面进行探讨。
一、研究蛋白质相互作用的方法研究蛋白质相互作用的方法非常多样，其中较为常见的方法包括蛋白质亲和层析、双杂交、荧光共振能量转移技术、质谱等。
1.蛋白质亲和层析蛋白质亲和层析是一种早期用于研究蛋白质相互作用的方法。
通过将待测蛋白质与另一蛋白质或蛋白质结合部位的亲和柱相结合，在柱中的固定相上发生吸附分离。
它具有分离效率高、结合选择性好、操作简便等优点。
它所分离得到的蛋白质，不仅可以用于评估蛋白质内在生物学功能，也有可能成为未来的新药研究的有用样品。
2. 双杂交技术双杂交技术是一种通过识别两个相互作用蛋白质的方法，它提供了一种构建蛋白质相互作用网络图的方便而有效的工具。
该技术可以快速高效的筛选出和特定蛋白质发生交互作用的蛋白质，并且该技术不会影响蛋白质的活性。
随着技术的不断发展，双杂交技术正在被应用到许多疾病的研究中，并为药物设计提供了重要的参考。
3.荧光共振能量转移技术荧光共振能量转移技术是有利于研究细胞内蛋白质相互作用的一种方法，也是革命性的发展成为生物分子相互作用的一个广泛应用领域。
该技术可以无损地跟踪两个蛋白质分子间的相互作用，因此其具有无标记的优点。
该方法的使用因效率高和准确性高而变得日益普及。
4.质谱质谱法主要用于快速鉴定蛋白质异构体、翻译后修饰及与其他蛋白质的相互作用等。
它可以优化生命科学的知识并创建新的科学领域，如蛋白质组学和代谢组学。
它的应用已变得越来越广泛，可帮助研究人员对蛋白质的结构和功能作出更精确的解释。
二、蛋白质相互作用的应用研究蛋白质相互作用的应用非常广泛，其中包括蛋白质相互作用网络构建、药物设计和生物技术的应用。
1.蛋白质相互作用网络的构建生物体内可以通过成千上万的蛋白质相互作用形成复杂的细胞内环境。
文献分享 蛋白之间的相互作用的检测方法
蛋白质是细胞生命活动的重要组成部分，它们通过相互作用形成复杂的信号传导网络，调控细胞内外的生物学过程。
研究蛋白质之间的相互作用对于理解生物学功能具有重要意义。
随着科学技术的不断发展，人们提出了许多方法来检测蛋白质之间的相互作用。
本文将介绍几种常用的蛋白质相互作用检测方法，希望能对广大科研工作者提供一些参考。
一、酵母双杂交法酵母双杂交法是一种常用的蛋白质相互作用检测方法。
其基本原理是将待测蛋白与转录因子的DNA结合结构域融合，构建成自激活基因的表达体系，并将该体系转化到毕赤酵母中。
利用这种方法可以鉴定出与待测蛋白相互作用的蛋白质。
二、蛋白质芯片技术蛋白质芯片技术是利用微阵列技术将大量的蛋白质固定在载玻片上，然后与待测蛋白进行相互作用，再通过荧光染色或其他方法来检测蛋白质间的相互作用情况。
该技术具有高通量、高灵敏度和快速的特点，适用于大规模蛋白质相互作用的筛选。
三、质谱技术质谱技术是一种通过测定待测蛋白的质量和结构来研究蛋白质相互作用的方法。
常用的质谱技术包括表面增强拉曼光谱（SERS）和质谱成像等。
通过这些技术可以直接观察到蛋白质之间的相互作用情况，从而揭示蛋白质相互作用的机制。
四、结合免疫沉淀和免疫印迹技术结合免疫沉淀和免疫印迹技术是一种通过蛋白质抗体特异性识别技术，通过特异性识别待测蛋白质与其相互作用的靶蛋白质。
其基本原理是将待测蛋白质进行免疫沉淀，然后用抗体进行免疫印迹检测。
该方法具有较高的特异性和灵敏度，适用于研究蛋白质间的相互作用。
五、荧光共振能量转移技术荧光共振能量转移技术是一种利用两种荧光蛋白之间的能量转移来研究蛋白质相互作用的方法。
其原理是将一个荧光蛋白作为供体，另一个荧光蛋白作为受体，当它们之间的距离在合适的范围内时，能够发生能量转移。
通过测定其荧光的增强或减弱来确定蛋白质的相互作用情况。
通过上述介绍，我们可以看出，蛋白质之间的相互作用检测方法有多种多样，每种方法都有其适用的范围和特点。
研究蛋白质相互作用的九种方法，写标书用得上
研究蛋白质相互作用的九种方法，写标书用得上寒风凛冽，又到了一年一度写标书的季节，你开始准备了么？在分子机制的研究中，蛋白和蛋白之间的互作研究可以说是非常经典了，研究蛋白互作的方法有很多，今天我们来介绍九种。
1、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）CoIP其实就是两个蛋白相互的IP（免疫沉淀反应）实验，在已知蛋白B和C之间有相互作用的前提下，这种前提一般需要有一个酵母双杂实验或者Pulldown实验来作为支持。
IP就是用来验证蛋白C和蛋白B之间相互作用的。
如果在Agarose珠上的Protean A/G所结合的抗体，可以结合并拉下蛋白B，那用Western Blot即可检测出蛋白C的表达，反之亦然，通过这种相互间免疫共沉淀的实验，就可以明确地验证出，B与C之间的相互作用了。
比如这份标书：PYK2促进肝癌细胞迁移的一个新的分子机制研究：结合并磷酸化E-cadherin？（百度检索题目可查到全文）2、Pull-down实验这个实验跟免疫共沉淀实验很像，不同的是免疫共沉淀是在细胞里进行的，在众多的蛋白里，拉住A蛋白的同时,把B蛋白也给拉出来了，这还不能证明是直接的结合，很有可能是A 拉住了C，而C拉住了B，这样拉住A蛋白的同时也能把B蛋白也给拉出来。
要证明直接的结合就是Pull-down实验。
提纯所要研究的两个蛋白（一般是在BL21等菌种表达提纯），这两个蛋白带上不同的标签（提纯蛋白一般带GST或者HIIS标签），然后将他们放在同一个体系里，使用GST-beads或者NI-beads,把其中一个蛋白拉下来，用WB检测另一个蛋白的存在。
比如这份标书：恶性肿瘤的发生、发展的细胞表观遗传学机制。
（同样可以百度检索到全文）3、免疫荧光（Immunofluorescence，IF）——共定位将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。
由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。
小资料：蛋白质相互作用研究技术
蛋白质相互作用研究技术简介垂钓技术分为体内和体外两种。
体内一般叫亲和纯化或coIP，体外叫pulldown。
基本原理是把要研究相互作用的诱饵蛋白和一段标签序列融合表达，这段标签能与柱材料上的配体特异性结合。
通过这个标签把蛋白挂到柱子上，然后洗去杂蛋白，洗脱。
与蛋白有物理结合能力的相互作用蛋白就会一起被挂到柱子上，最后被洗下来。
洗下来的诱饵蛋白+互作蛋白成分跑胶，把相互作用蛋白的条带切下来打质谱鉴定。
偶联的配体与配体结合的标签蛋白体内和体外的区别在于蛋白表达和形成互作复合体的方式的区别。
体内方法是直接在要研究的细胞里表达诱饵蛋白，在胞内形成复合体，然后把细胞裂解液过柱纯化。
优点是得到的互作信息比较真实，缺点是构建麻烦，而且诱饵蛋白的量不容易做得很大。
体外是先把基因克隆到表达载体上在大肠杆菌或者真核细胞里表达，纯化蛋白后与野生型菌株（要研究的那个菌）的总蛋白混合，在体外重新组成复合体。
然后用柱子把复合体纯化出来。
技术操作比较简单，比较容易拿到灵敏度高的结果，但最大缺点是复合体在非生理状态下重组，可靠性低，后续一对一验证要求比较高。
典型的体内和体外垂钓流程体内：1.构建表达菌株或细胞株，可以使用native启动子，也可以用OE启动子。
构建的时候要在蛋白的N端或者C端（一般放在蛋白功能不那么重要的一端）加上一段能和柱子结合的亲和标签序列。
2.抗标签westernblot验证蛋白表达。
3.培养细胞，裂解细胞，提取总蛋白。
（选择适当的lysis buffer成分，能裂解细胞但不破坏相互作用。
）4.总蛋白过柱，此时诱饵蛋白，相互作用蛋白和部分杂蛋白被结合在柱上。
5.wash buffer洗去杂蛋白。
（性质温和的缓冲液，能除去非特异结合但不破坏蛋白互作）6.elusion buffer洗脱目标蛋白。
（含有能使标签蛋白从柱子上解离下来的成分）7.洗脱组分跑SDS-PAGE，考染或银染。
8.胶上一般可见较浓的诱饵蛋白的主带和较弱的相互作用带，切取相互作用带送去打质谱。
蛋白互作研究技术
蛋白互作研究技术
蛋白互作是一种重要的生物学研究，而蛋白互作研究技术则是在此研
究中一项核心技术。
以下是常见的蛋白互作研究技术：
一、蛋白质组学技术
1.蛋白质组分析：采用二级离心法进行蛋白质组分析，用于确定包含特定蛋白的蛋白质组成；
2.蛋白质组谱：通过富集特定蛋白质和全蛋白组比较，以确定蛋白质组学差异；
3.蛋白质交互作用分析：通过重组蛋白质的凝集和转换，以及生物标记技术，来分析蛋白质的相互作用关系。
二、单细胞转录组技术
1.基因检测：通过RT-qPCR技术进行基因表达分析，以及对mRNA和lncRNA进行全面评估；
2.基因编辑技术：如基因敲除、表达修饰和CRISPR/Cas9基因编辑等，用于研究转录因子的调控机制。
三、质谱技术
1.偶氮质谱：用于蛋白质的鉴定、定量和结构分析，并且可以用来分析蛋白质和复合体的结构和功能。
2.离子图谱：可以用于分析蛋白质的如重链、修饰、底物修饰等，以及蛋白质的二级和三级结构；
3.质谱分子图谱：可以用于分析蛋白质和复合体的结构，以及蛋白质的聚集和相互作用。
四、生物信息学技术
1.基因组学：通过大数据分析，对基因序列、转录因子结构及蛋白质的相互作用进行全面的考察与解析；
2.计算机模拟：根据蛋白质的结构和运动特性，建立蛋白质结构模型并进行分析；
3.昆虫学：通过实验分析不同转录因子向细胞内位置的作用以及相互作用，研究蛋白质功能和表达规律。
以上就是蛋白互作研究技术的具体内容，可以帮助研究者更好地研究蛋白质的相互作用关系，为解决生物学问题提供更多的线索。
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bait
proteinX
cDNAforX
DNAb in d in g d o m a in transfection tran s fo rm e d
yeast
X
yeast plasmid expression vector
predator
unknow
tis s u e
b a it
predator
X
Y
does X bind with a protein?
to tal m R N A re v e rs etra n s c rip ta s e
cDNA y e a s t p l a s m i d e x p r e s s i o n v e c t o r
transfection
activation domain
三、免疫共沉淀原理
• 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原 之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经 典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用 的有效方法。
• 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多 蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。当用预先固 化在argarose beads上的蛋白质A的抗体免疫沉淀A蛋白， 那么与A蛋白在体内结合的蛋白质B也能一起沉淀下来。 再通过蛋白变性分离，对B蛋白进行检测，进而证明两者 间的相互作用。
二、谷胱苷肽-S-转移酶沉淀试验 (GST-pull down）原理
GST-融合蛋白 + 谷胱甘肽-琼脂糖球珠 X GST
Y 细胞裂解物
4℃下孵育2h tube
X GST Y
GST pull down实验流程
（1） Glutathione 琼脂糖珠预处理。 （2） GST融合蛋白挂柱：取适量GST-融合蛋白与10μl已经
transfection
e x t r a c t p la s m id s
re-transformed yeast
X
Y
?
agar plate
positive yeast containing
bait plus predator!
th e fishing was good!
end of slide show
处理过的beads置于1.5ml离心管中， 4℃, 摇床孵育过夜。 （3） 孵育过夜的蛋白质与beads的混合液于4℃,500g离心
5min，上清收集，观察融合蛋白是否饱和地挂在beads上， 用1ml冰冷的细胞裂解缓冲液洗三次beads。 （4） 将菌体用溶菌酶处理，之后破碎细菌壁，最大转速 4℃离心20min,收集上清液。 （5） 将细胞裂解液上清加入beads中，混匀，4℃，摇床3h。 （6） 3h后，用冰冷的细胞裂解缓冲液洗三次。 （7） 加15μl 2×SDS上样缓冲液，煮沸5min. （8） SDS-PAGE,Western Blot或质谱仪分析。
• 组成部分：（1）与BD融合的蛋白表达载体，被表 达的蛋白称诱饵蛋白（bait）；（2）与AD融合的 蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白 （prey）；（3）带由一个或多个报告基因的宿主 菌株。
F i s h i n g w i t h t h e y e a s t t w o - h y b r i d s y s t e m
（4） 将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗 体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h，使抗 体与protein A琼脂糖珠偶连。
（5） 免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 rpm 速度离心3 min，将琼脂糖珠离心至管底。将上清小心吸去，琼脂糖 珠用1ml裂解缓冲液洗3－4次。最后加入15μl的2×SDS 上样缓冲液，沸水煮5分钟。
• 酵母激活因子 GAL4：N端：147个氨基酸组成的 DNA结合域(BD)， C端：113个氨基酸组成的转录 激活域(AD)。GAL4分子的DNA结合域可以和上游激 活序列(upstream activating sequence，UAS)结 合，而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转 录。
Two-hybrid system 是90年代初发展起来的新 方法，可用于分离能与已知靶蛋白质（target protein）相互作用的基因。 基本原理：
真核生物的转录因子大多是由两个结构上分 开、功能上独立的结构域组成的,如GAL4 （酵母 转录激活蛋白Gal4的基因）。这两个结构域各具 功能，互不影响。但一个完整的激活特定基因表 达的激活因子必须同时含有这两个结构域ey
transcription machinery lac 2
-galactosidase
X-gal
blue color
NH2
Gal4
BD
A
+
Gal4
NH2 AD B
COOH 共转化
Gal4
B AD
COOH
Gal4
BD
A
Promoter
Reporter
举例
酵 母 双 杂 交 基 本 过 程
三、免疫共沉淀原理
免疫共沉淀实验流程
（1）将菌体用溶菌酶处理，冰上裂解30min,之后破碎细菌 壁，最大转速4℃离心30min,收集上清液。冰上裂解30min,
（2） 取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液加 1μg相应的抗体加入到细菌裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过 夜。
（3） 取10μl protein A 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗 3 次，每次3,000 rpm离心3 min。
蛋白质相互作用研究技术
汇报人: 布沙热木.阿布力孜 玛伊热.努热艾合买提 夏尤普.玉苏甫 阿布力米提.莫明
常用蛋白质相互作用的研究技术
酵母双杂交 谷胱苷肽-S-转移酶沉淀试验(GST-pull down） 免疫共沉淀 双分子荧光互补技术(BIFC) 生物发光共振能量转移（ＢＲＥＴ）技术
一、细菌双杂交系统
（6） SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪分析.
四、双分子荧光互补技术( bimolecular fluorescence complementation , BIFC)
BiFC技术是将荧光蛋白（GFP、YFP、CFP） 分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别 与目标蛋白连接。如果两个目标蛋白因为有相互 作用而接近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在 空间上相互靠近，重新形成活性的荧光基因而发 出荧光。在荧光显微镜下，就能直接观察到两目 标蛋白是否具有相互作用，对研究蛋白质相互作 用有重要意义。