第四章 昆虫分子科学

一、生物技术在昆虫分类中的应用 一、转基因抗虫育种的发展概况
许多边界口岸水果和蔬菜中那些检疫性、危险性害虫, 如: 桔小实蝇、地中海 实蝇等, 其主要以幼虫危害, 它们的外部形态比较相似, 借助常规方法从外部 形态上很难鉴别区分, 把它们饲养为成虫, 是一个既费时又花费人力和物力的 过程。又由于水果和蔬菜在保存上容易腐烂变质的特殊性, 利用分子生物技 术可以提供便利, 它既可以缩短鉴定分类时间, 又节省大量的人力和物力。
桔小实蝇除柑桔外，尚能为害芒果、番石榴、 番荔枝、阳桃、枇杷等200余种果实。
一、生物技术在昆虫分类中的应用 一、转基因抗虫育种的发展概况
地中海实蝇有250多种寄主，主要危害柑桔、 苹果、梨等水果和茄科蔬菜。
一、生物技术在昆虫分类中的应用 一、转基因抗虫育种的发展概况
现代遗传学研究表明, 一切物种的遗传性状 都是由基因决定。基因的变异不仅体现在外 部形态的变异上, 还体现在体内蛋白质分子 结构的变化上。而基因的变异取决于DNA 分 子碱基序列的变异。在生物分类和系统的发 展中, 采用分子生物学技术, 从DNA 水平进行 分类研究, 解决形态分类上不能解决的问题。
第四章 昆虫分子科学
昆虫学的研究成果导致了分子生物学的 迅猛发展（果蝇分子生物学、转基因抗虫作物等在现代分子生物
学和生物技术中占有非常的地位。）
分子生物学及生物技术的发展，也有利 的促进了昆虫学在分子和细胞水平上的 基础研究。（昆虫分类学、利用昆虫生物反应器生产药物等。）
昆虫学和分子生物学相互交融而形成的 交叉学科----昆虫分子科学已成为当前昆 虫学发展的前沿学科。
一、生物技术在昆虫分类中的应用
二、转基因抗虫育种的发展概况
三、转基因昆虫的应用
一、生物技术在昆虫分类中的应用
长期以来, 昆虫分类都是以外部形态为依据, 因为形态特征较 直观, 容易掌握。分类中将昆虫几个大的主要形态作为分类的标 准, 如, 翅脉、口器、触角、生殖器、足及其跗节等。这些分类 依据在目等分类单元中可以很好的反映物种的分类地位; 但在小 的分类单元, 如属、种内则不容易确定物种的分类地位, 再到种 群、生态型则更难确定分类地位。为此, 必须寻找更细的形态特 征, 如某些部位毛片的形态、分布等, 但这些特征容易受非遗传 稳定性的影响。
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目前PCR 技术在昆虫学方面被广泛应用。如康 巧华等( 1998) 用低G/ C% 含量引物, 用PCR 技 术扩增了家蝇细胞色素P450的cDNA。徐卫华, 王永杰( 2000) 等 在研究昆虫滞育激素(DH) 时 利用RAPD- PCR 技术从高温催青家蚕卵中克隆 得到DHc DNA , 进行测序证明催青温度与DH 基 因表达的关系。李正西, 沈佐锐( 2002) 利用 PCR 扩增及电泳对澳洲赤眼蜂、甘蓝夜蛾赤眼 蜂、食胚赤眼蜂、广赤眼蜂和松毛赤眼蜂等6 个地理种群进行分类鉴定。
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目前RAPD技术已成为昆虫遗传图谱构建中的一种普遍方法, 该技术一出现, 就被用于蚊虫的分子系统学研究 。吴厚永, 赵 彤言( 2000) 利用RAPD技术从DNA 分子水平研究了尖音库蚊 复合组4 个亚种的分化, 最终结果表明尖音库蚊是原始的类群, 而倦库蚊和淡色库蚊是最为进化的类群。Black IV( 1992) 等 首先将RAPD 技术用于四种蚜虫的鉴定比较, 另外还用该技术 检测和鉴定了蚜虫体内的两种寄生蜂。孙珊, 李绍文( 1999) 等 应用RAPD 技术对黑龙江、新疆、云南、陕西、浙江、北 京等6 个地区的玉米螟种群进行研究分析。杨效文( 1999) 应 用RAPD 技术较好的分析了不同地理种群烟蚜的分化。夏庆 友, 周泽扬等( 1998) 应用RAPD技术从DNA 分子水平上对不同 类型的59个家蚕和野蚕之间的遗传差异进行研究, 结果证明 一化性四眠种为最早从野蚕中分化出来的系统。
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由此可见, RAPD技术用于对群体遗传多样性的分析更为有利。 目前一般认为, RAPD 技术的取样大小对结果的统计分析影响 不大。增加个体数只是个体间的比较增加, 它实用于个体的 分类研究、品系及品种的分化研究 。RAPD 技术具有简便、 快捷、灵敏、多态性检出率高、所需DNA 量少等特点, 被迅 速用于个体和品系鉴定、基因的多态分析、基因定位、构建 遗传图谱、标记辅助选择和种间遗传分析等领域的研究。对 于亲缘关系较近的群体间的分析, 则可用混合DNA 池作为样 本, 其DNA 池包含个体数的多少没有严格要求。
一、生物技术在昆虫分类中的应用
3 核酸序列分析技术
核酸序列分析技术是通过测定核酸分子一级结构中核苷酸序列来比 较同分子之间的相互关系, 从而阐明基因组DNA 一级结构上的遗传 信息如何控制生物三维形态发育和复杂性不断增加的动态过程,并从 遗传学角度对生物的分类、系统发育和进化作出解释。目前在昆虫 分子进化和分子系统方面, 用核酸序列分析技术测定昆虫特定DNA 和RNA 核苷酸序列, 比较不同昆虫类群个体的核苷酸顺序( 同源核酸) 据此推断不同昆虫类群之间的演化关系。在种内或近缘种的系统发 育关系的确定, 通常用进化较快的mtDNA 核苷酸片段。在科、属等 高级分类阶元的系统发育研究时, 用进化较慢的rDNA 和rRNA 核苷酸 片段。到目前为止, 直翅目的蝗虫、膜翅目的蜜蜂、双翅目的果蝇 等的mtDNA 已经清楚了。因为rRNA 在昆虫中容易分离, 却进化速度 慢, 因此, 用不同昆虫rRNA 的序列分析能拓宽到科、属等高级分类阶 元的系统发育研究。
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2. 1 RAPD 技术
RAPD( random amplified polymorphic DNA) 技术是由美国杜邦公 司的科学家J. G. K.Williams和加利福尼亚生物研究所J. Welsh 两个 研究小组在1900 发展起来的以PCR 为基础的一项DNA 分子水平 上的大分子多态检测技术。其原理是: RAPD标记的产生是基于一 种可能性, 即一段与某一单一引物(RAPD 一般用10 聚体引物) 同 源的DNA 序列, 有可能在DNA 模板另一条链上的不同位置上出现, 这些位置之间的距离又处于通过PR 进行扩增的长度范围, 因此, 当条件满足时, 单个寡核苷酸引物就可以在PCR 反应中介导DNA 呈几何级数扩增。经RAPD 检测, 则大多表现为某一个扩增产物 出现或消失。这意味着RAPD通常可用作显性标记 。用相同引物 对个体及个体所在的群体的混合DNA 池的扩增结果可见, 在个体 扩增产物中出现弱带, 在群体的扩增产物中则出现较强的带, 有些 在个体的扩增产物中未出现的带, 在群体的扩增中产物中出现。 由混合DNA 池所得到的扩增结果可见, 其带数较个体扩增产物的 带数普遍增加, 带型明显清晰易辨, 即群体扩增产物出现的多态性 比个体的更为丰富明显。
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随着昆虫生态学、行为学、分子生物学的发展, 在同一形态种内可 能发现多个行为种、近缘种。直翅目中有些形态种根据它们的鸣 声频率可以分成许多行为种、近缘种, 因为直翅目昆虫依靠鸣声的 频率寻找配偶, 因此造成生殖隔离 。这些问题是形态分类力所不 及的。另外, 根据外部形态在幼虫期的鉴定分类比较困难, 即使鉴 定出来也具有不准确性, 通常是把幼虫在室内饲养为成虫再进行分 类鉴定, 这只是针对一般的昆虫。
一、生物技术在昆虫分类中的应用
问题与展望
现在对昆虫的分类鉴定处于分类学的低水平阶段, 分子领 域的研究很少, 利用分子生物技术对昆虫分类研究, 使研 究方式由表及里, 由宏观转向微观。但目前我国生物技术 只是小部分分类学者掌握应用, 研究队伍的整体水平不高。 相对于遗传育种、植物生理生化研究而言, 生物技术在昆 虫分类方面的应用较少, 还处于起步阶段。随着人类的认 识和科学技术的不断发展, 昆虫分类学将成为一门多学科 交叉的综合性学科。昆虫分类学在利用外部形态的基础 上, 可以利用解剖学、遗传学、分子生物学、生物化学来 缩短分类鉴定所需时间, 提高效率。随着分子生物学的快 速发展, 人们对蛋白质、DNA、RNA 等生命活动必不可少 的物质认识的逐步加深, 更多的生物技术将应用于昆虫分 类的研究。
一、生物技术在昆虫分类中的应用 一、转基因抗虫育种的发展概况
1 酯酶同工酶电泳技术
从上世纪70 年代开始, 同工酶的研究已成为鉴定物种和种间亲缘关系等方
面的重要方法。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术, 对不同分类单元之间的昆虫 进行酯酶同工酶的研究, 可以利用其生化特征的差异来推测不同分类单元间
物种在基因水平上的不同, 以此来推断它们的血缘关系和进化地位。李绍文
雄个体的酶谱不同, 可用于分类。
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2 PCR 技术
聚合酶链式反应( polymerase chain reaction , PCR) 是一项体外特异复 制特定DNA 片段的核酸合成技术。该技术自Kary ullis( 1985) 及其同பைடு நூலகம்事Saiki 等( 1988) 发明以来, 其意义和影响甚至比限制性内切酶等更 为深远, 是分子生物学领域的一次创举, 在一定程度上替代了传统的 DNA 克隆方法。PCR 从无数的DNA 分子群中有选择性地复制一段有 特异性的DNA 序列, 使某种DNA 片段把特异性扩增。PCR 扩增DNA 片段通常在PCR 自动扩增仪中进行, 对于PCR 循环条件来说, 一般30~ 35 个循环足以得到目的产物, 其中退火温度的选择至关重要, 原则上 退火温度过低, 会造成非特异性产物量增加, 过高会无扩增产物。
( 1987) 对膜翅目昆虫7 个总科、蜜蜂总科9 个属、蜜蜂属6 个种和西方蜜蜂 4 个种样品的酯酶同工酶进行了比较研究, 发现总科代表间的酶谱的差异大
于总科内各属间的差异, 属内各种间的酶带很接近,但每个种都有其特有的
酶带, 彼此容易区分。杨秀芬等( 1991) 对异色瓢虫的10 种色斑进行酯酶同 工酶研究表明同一生态环境下异色瓢虫不同色斑型的酶带位置明显不同,雌
一、生物技术在昆虫分类中的应用
目前, Crozier ( 1992) 对意大利蜜蜂工蜂线粒体 DNA(mtDNA) 进行测序。曹功杰( 1988) 对7 种 昆虫的5SrRNA 结构进行比较研究。Chapco ( 1994) 应用核酸序列分析技术对直翅目11 种蝗 虫的进化关系进行了研究。罗晨, 姚远( 2002) 等 利用mtDNA COI 基因段片标记, 采用序列分析的 方法, 从分子生态角度研究近年来我国暴发危害 的烟粉虱5 个种群的生物型, 结果表明我国烟粉 虱实验种群的生物型与Texas- B 型和Arizona- B 型种群为同一生物型B。
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2. 2 探针杂交技术
核酸的分子杂交技术是现在分子生物学研究中常用的方法之 一, 它和克隆技术密不可分, 并且在基因表达、条控以及在物 种亲缘关系的研究中具有重要作用。探针杂交技术的基本原 理是核酸分子杂交具有一定同缘性的DNA 单链或者DNA 单链 分子与RNA 分子, 经其互补的片段在除弃变性条件后又可以 恢复形成双链DNA 分子或者DNA/ RNA 异质双链分子。最基 本的分子杂交技术包括原位杂交技术、Northern 分子杂交技 术和Southern 分子杂交技术。在昆虫学研究主要应用核酸分 子技术检测起遗传的多态性、DNA 的同缘性和mRNA 的差异 来鉴别昆虫的近缘种以及地理种群。该方法已被牛玲玲 ( 1992) 用于中华按蚊以及嗜人按蚊的分类。又如ollins( 1987) 用DNA 探针杂交方法把按蚊属近缘种进行了鉴定分类。