PEGFP-C1质粒图谱
质粒图谱查询方法
3.google scholar: / 有些质粒是经过改造的，所以通过上述方法不能查询到相应信息。这时，可以在google scholar中输入质粒名称，可以直观地看哪些学者在何文章中使用了该质粒，从而可了解到质粒的来源;或者籍此向作者咨询或索取。 4.尝试从各大生物公司，例如invitrogen网站查询. 5. 这个网站收录了大量图谱： http://www.embl-hamburg.de/~geerlof/webPP/vectordb/bact_vectors/table.html
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0099--pGE-1—Stratagene--RNAi载体 0100--pSUPER.p53—OligoEngine--RNAi载体 0101--palter-ex1--promega 0102--pACYCDuet-1--NOVAGEN 0103--pEX lox(+) Vector—NOVAGEN--原核表达 0104--质粒名称：pBACgus-8 Transfer Plasmid—NOVAGEN--CHUANSUO 0105--pSCREEN?-1b(+) Vector Map—novagen--筛选 0106--PGEX-2T--BD Co--pDsRed2--Clontech 0107--pbgal-Basic—Clontech--mammalian reporter vector 0108—pBI—Clontech--express two genes of interest from a bidirectional tet-responsive promoter 0109--质粒名称：pbgal-Control—Clontech--mammalian reporter vector 0110-- pGEX-5X-1--原核表达 0111--pBI-EGFP—Clontech--pBI-EGFP-- coexpress 0112--pBI-G—Clontech--pBI-G--express b-galactosidase 0113--pBI-GL—Clontech--pBI-GL --express luciferase and b-galactosidase 0114--pCMS-EGFP—Clontech--mammalian expression vector 0115--pd2EYFP-1—Clontech--启动子测定 0116--质粒名称--pd2EYFP-N1—Clontech--融合表达 0117--pd4EGFP-Bid—Clontech--融合表达 Bid 0118--pDNR-CMV—Clontech--pDNR-CMV 0119--pDNR-EGFP Vector—Clontech 0120--pDNR-LacZ –Clontech 0121--pECFP-Endo—Clontech--真核表达0122--pECFP-ER—Clontech--真核表达0123--pEGFP-Actin—Clontech--真核表达0124--pGAD GH--Clontech--酵母表达 0125--pGADT7-Rec –Clontech--酵母表达 0126--pGADT7-RecAB—Clontech--酵母表达 0127--pGADT7-Rec2—Clontech--酵母表达 0128--pGBKT7—Clontech--酵母表达 0129--pHAT 10/11/12—Clontech 0130--pHAT20—Clontech 0131—pHygEGFP—Clontech 0132—pLacZi—Clontech 0133—pM—Clontech--pM is used to generate a fusion of the GAL4 DNA-BD 0134--pPKCa-EGFP—Clontech 0135--pPKCb-EGFP—Clontec 0136--pSIREN-DNR Vector—Clontech--RNAi 0137--pSIREN-DNR-DsRed-Express Vector—Clontech--RNAi 0138--pSIREN-RetroQ—Clontech--RNAi 0139--pIRES-EYFP—Clontech--RNAi 0140--pSRE-Luc—Clontech--RNAi 0141--pTK-neo—novagen--原核表达 0142--pZsGreen Vector—Clontech--pZsGreen is a pUC19-derived prokaryotic expression vector 0143--pTandem-1—novagen--原核表达 0144--pZsGreen1-C1Vector—Clontech----真核表达 0145--质粒名称：M13mp18—novagen--原核表达 0146--pZsGreen1-DR Vector—Clontech--真核表达 0147--PZsGreen1-N1 Vector—Clontech --真核表达 0148--T7Select415-1b—novagen----真核表达 0149--pZsYellow Vector—Clontech --真核表达 0150—pTimer—Clontech --真核表达 0151--pTA-Luc—Clontech --真核表达 0152--pTAL-Luc—Clontech --真核表达 0153--pTA-SEAP—Clontech --真核表达 0154--pTAL-SEAP—Clontech --真核表达 0155--pTet-On—Clontech --真核表达 0156--pTet-Off—Clontech --真核表达 0157--pTet-ATF—Clontech --真核表达 0158--pTet-CREB—Clontech --真核表达
质粒大全及质粒图谱
一.九种表达载体Pllp-OmpA, pllp-STII, pMBP-P, pMBP-C,pET-GST, pET-Trx, pET-His, pET-CKS, pET-DsbA二.克隆载体pTZ19R DNApUC57 DNAPMD18TPQE30pUC18pUC19pTrcHisApTrxFuspRSET-ApRSET-BpVAX1PBR322pbv220pBluescript II KS (+)L4440pCAMBIA-1301pMAL-p2XpGD926三.PET系列表达载体Protein Expression ? Prokaryotic Expression ? pET Dsb Fusion Systems 39b and 40b Protein Expression ? Prokaryotic Expression ? pET Expression System 33bProtein Expression ? Prokaryotic Expression ? pET Expression SystemsProtein Expression ? Prokaryotic Expression ? pET Expression Systems plus Competent CellsProtein Expression ? Prokaryotic Expression ? pET GST Fusion Systems 41 and 42 Protein Expression ? Prokaryotic Expression ? pET NusA Fusion Systems 43.1 and 44Protein Expression ? Prokaryotic Expression ? pET Vector DNAProtein Purification ? Purification Systems ? Strep?Tactin Resins and Purification Kits四.PGEX系列表达载体T EcoR?pGEX-1 I/BAPpGEX-2TpGEX-2TKpGEX-3XpGEX-4T-1pGEX-4T-2pGEX-4T-3pGEX-5X-1pGEX-5X-2pGEX-5X-3pGEX-6P-1pGEX-6P-2pGEX-6P-3五.PTYB systemPTYB1PTYB2PTYB11PTYB12六.真核表达载体pCDNA3.1(-)pCDNA3.1(+)pPICZ alpha ApGAPZαAPYES2.0pBI121pEGFP-N1pEGFP-C1pPIC9KpPIC3.5K如何阅读分析质粒图谱载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。
如何阅读质粒图谱_0
---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------如何阅读质粒图谱标题：质粒图谱大全如何阅读质粒图谱(ZT) 2008-08-09 20:24:09 基因酷质粒图谱 /bbs/forum-38-1 .html，收藏了将近 800 种质粒的图谱及相关信息特向大家推荐，介绍及使用方法见：/bbs/thread-41 7-1 -1 .html 质粒图谱信息一.九种表达载体Pllp-OmpA, pllp-STII, pMBP-P, pMBP-C, pET-GST, pET-Trx, pET-His, pET-CKS, pET-DsbA 二.克隆载体 pTZ1 9R DNA pUC57 DNA PMD1 8T PQE30 pUC1 8 pUC1 9 pTrcHisA pTrxFus pRSET-A pRSET-B pVAX1 PBR322 pbv220 pBluescript II KS (+) L4440 pCAMBIA-1 301 pMAL-p2X pGD926 三.PET 系列表达载体 Protein Expression ? Prokaryotic Expression ? pET Dsb Fusion Systems 39b and 40b Protein Expression ? Prokaryotic Expression ? pET Expression System 33b Protein Expression ? Prokaryotic Expression ? pET Expression Systems Protein Expression ? Prokaryotic Expression ? pET Expression Systems plus Competent Cells Protein Expression ? Prokaryotic Expression ? pET GST Fusion Systems 41 and 42 Protein Expression ? Prokaryotic Expression ? pET NusA Fusion Systems 43.1 and 44 Protein Expression ? Prokaryotic Expression ? pET Vector DNA Protein Purification ? Purification Systems ?1 / 7Strep?Tactin Resins and Purification Kits 四.PGEX 系列表达载体 T EcoR?pGEX-1 I/BAP pGEX-2T pGEX-2TK pGEX-3X pGEX-4T-1 pGEX-4T-2 pGEX-4T-3 pGEX-5X-1 pGEX-5X-2 pGEX-5X-3 pGEX-6P-1 pGEX-6P-2 pGEX-6P-3 五.PTYB system PTYB1 PTYB2 PTYB1 1 PTYB1 2 六.真核表达载体pCDNA3.1 (-) pCDNA3.1 (+) pPICZ alpha A pGAPZA PYES2.0 pBI1 21 pEGFP-N1 pEGFP-C1 pPIC9K pPIC3.5K 如何阅读分析质粒图谱载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒 DNA 是一种新的非病毒转基因载体。
质粒图谱
)质粒图谱登记号：00012)质粒名称：pIRES3)来源：BD Co4)用途：真核双表达5)是否可以提供更详细资料：可以6)是否可以共享：7)联系方式：PM)质粒图谱登记号：00022)质粒名称：pECFP-C13)来源：BD Co4)用途：检测真核表达5)是否可以提供更详细资料：可以6)是否可以共享：7)联系方式：pm1)质粒图谱登记号：00032)质粒名称：pShuttle3)来源：4)用途：5)是否可以提供更详细资料：6)是否可以共享：7)联系方式：2)pShuttle MCS很多人用pEGFP-C1，我也来发一个)质粒图谱登记号：00042)质粒名称：pSBR322、pUC183)来源：4)用途：5)是否可以提供更详细资料：6)是否可以共享：7)联系方式：1)质粒图谱登记号：00052)质粒名称：pcDNA3.1(+)/CAT3)来源：invitrogen4)用途：真核表达5)是否可以提供更详细资料：可以6)是否可以共享：无偿7)联系方式：PM1)质粒图谱登记号：00062)质粒名称：pQEx3)来源：Qiagen4)用途：原核表达5)是否可以提供更详细资料：可以6)是否可以共享：交换7)联系方式：PM2)1)质粒图谱登记号：00072)质粒名称：pIVEX2.33)来源：Rocho4)用途：体外转录翻译5)是否可以提供更详细资料：可以6)是否可以共享：交换7)联系方式：PM质粒图谱登记号：0008质粒名称：pIRES-EGFP来源：用途：是否可以提供更详细资料：是否可以共享：否联系方式：1)质粒图谱登记号：00092)质粒名称：pET-28a（+）3)来源：Novagen4)用途：原核表达5)是否可以提供更详细资料：可以6)是否可以共享：交换7)联系方式：PM1)质粒图谱登记号：00112)质粒名称：pET-32a(+)3)来源：novagen4)用途：原核表达5)是否可以提供更详细资料：6)是否可以共享：7)联系方式：pm1)质粒图谱登记号：00132)质粒名称：pcDNA3.1/Zeo (+)3)来源：invitrogen4)用途：原核表达5)是否可以提供更详细资料：可以6)是否可以共享：交换7)联系方式：PM)质粒图谱登记号：00132)质粒名称：pEGFP-N33)来源：clontech4)用途：真核表达5)是否可以提供更详细资料：可以6)是否可以共享：交换7)联系方式：PM)质粒图谱登记号：00142)质粒名称：pcDNA33)来源：invitrogen4)用途：真核表达5)是否可以提供更详细资料：可以6)是否可以共享：交换7)联系方式：PM)质粒图谱登记号：00152)质粒名称：pfastbac13)来源：invitrogene4)用途：昆虫表达5)是否可以提供更详细资料：不可以6)是否可以共享：不可以7)联系方式：PM)质粒图谱登记号：00162)质粒名称：pEGFP-C33)来源：clontech4)用途：真核表达5)是否可以提供更详细资料：可以6)是否可以共享：交换7)联系方式：PMwangjun2002274 edited on 2004-06-22 00:041)质粒图谱登记号：00172)质粒名称：pSecTag23)来源：Invitrogen4)用途：真核表达5)是否可以提供更详细资料：可以6)是否可以共享：交换7)联系方式：PM)1质粒图谱登记号：00192)质粒名称：pET20b3)来源：NOVAGEN4)用途：原核表达5)是否可以提供更详细资料：可以6)是否可以共享：交换7)联系方式：PM1)质粒图谱登记号：00222)质粒名称：pThioHisA3)来源：invitrogen4)用途：原核表达5)是否可以提供更详细资料：4.365kb , HP-thioredoxin fusion proteinexpressionvector, trc promoter, Ampr, a EK cleavage site lies between HP-thioredoxin and MCS宿主菌TOP10（基因型为：F-mcrA △（mrr-hsd RMS-mcrBC）Ф80 lacZ M15 △lacX74 deoR recAl araD139 △（ara-leu）7697 galU galK rpsL endAl nupG6)是否可以共享：交换或其它7)联系方式：PM2)3)1)质粒图谱登记号：00242)质粒名称：pcDNA3.1-Myc-His-A-3)来源：invitrogen4)用途：真核核表达4))质粒图谱登记号：00252)质粒名称：pSUPER.neo3)来源：4)用途：siRNA5)是否可以提供更详细资料：可以6)是否可以共享：交换7)联系方式：PM)质粒图谱登记号：00312)质粒名称：pSilencer1.0-siRNA3)来源：Ambion4)用途：RNAi5)是否可以提供更详细资料：/techlib/Documents.html?fkResSxn=7&fkSub Sxn=236)是否可以共享：实验结束后，可提供含shRNA模板的质粒7)联系方式：pm5) )质粒图谱登记号：00322)质粒名称：pSilencer2.0-U6siRNA 3)来源：Ambion4)用途：RNAi ，与1.0相比，可以建立稳转株5)更详细资料：/techlib/prot/fm_7209.pdf 6)是否可以共享：交换 7)联系方式：pm6)会员名：mlluoE-mail：*************可提供试验资源名称和简要介绍：pSilencer 3.1-H1 neo Vector，是Ambion公司目前最高版本的shRNA 载体，为扩增此载体我已插入目的片段，如有战友需要，将此片段双酶切再连上自己的片段即可。
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（转载）一. 九种表达载体Pllp-OmpA, pllp-STII, pMBP-P, pMBP-C,pET-GST, pET-Trx, pET-His, pET-CKS, pET-DsbA二. 克隆载体pTZ19RDNApUC57DNAPMD18TPQE30pUC18pUC19pTrcHisApTrxFuspRSET-ApRSET-BpVAX1PBR322pbv220pBluescriptIIKS( )L4440pCAMBIA-1301pMAL-p2XpGD926三.PET 系列表达载体ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETDsbFusionSystems39band40b ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystem33b ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystems ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystemsplusCompetentCells ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETGSTFusionSystems41and42 ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETNusAFusionSystems43.1and44 ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETVectorDNAProteinPurification?PurificationSystems?Strep?TactinResinsandPurificationKits四.PGEX 系列表达载体TEcoR?pGEX-1I/BAPpGEX-2TpGEX-2TKpGEX-3XpGEX-4T-1pGEX-4T-2pGEX-4T-3pGEX-5X-1pGEX-5X-2pGEX-5X-3pGEX-6P-1pGEX-6P-2pGEX-6P-3五.PTYBsystemPTYB1PTYB2PTYB11PTYB12六. 真核表达载体pCDNA3.1(-)pCDNA3.1( )pPICZalphaApGAPZα APYES2.0pBI121pEGFP-N1pEGFP-C1pPIC9KpPIC3.5K如何阅读分析质粒图谱载体主要有病毒和非病毒两大类, 其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。
pEGFP-C1-MCH真核表达载体的构建及其在HEK293细胞系中的表达
pEGFP-C1-MCH真核表达载体的构建及其在HEK293细胞系中的表达徐婧;侯赋园;王德彬;李竣;胡鑫;杨光忠【摘要】目的:构建pEGFP-C1-MCH真核表达载体,并将其转染入 HEK293细胞中,筛选阳性细胞克隆,为研究MCH基因在能量代谢中的功能及机制提供细胞模型. 方法:提取脑组织总RNA,反转录为cDNA,参照Genbank中提供的序列设计引物扩增MCH基因全长.再将该基因全长cDNA克隆至质粒pEGFP-C1,经菌落PCR筛选及双酶切和DNA测序鉴定,成功构建了含有目的基因MCH的重组质粒pEGFP-C1-MCH. 并利用脂质体2000介导其转染HEK293细胞,用荧光显微镜和RT-PCR 检测EGFP和MCH在细胞中的表达.结果:克隆的pEGFP-C1-MCH质粒序列中的MCH与GenBank相符;细胞转染72 h后,转染成功的细胞在荧光显微镜下表达较强的绿色荧光,MCH基因稳定表达.结论:pEGFP-C1-MCH真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的稳定表达,为研究MCH基因在能量代谢中的功能及作用机制提供了实验模型.【期刊名称】《中南民族大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2018(037)003【总页数】4页(P28-31)【关键词】黑色素聚焦激素;绿色荧光蛋白;pEGFP-C1;转染;HEK293【作者】徐婧;侯赋园;王德彬;李竣;胡鑫;杨光忠【作者单位】中南民族大学药学院,武汉430074;中南民族大学药学院,武汉430074;中南民族大学药学院,武汉430074;中南民族大学药学院,武汉430074;中南民族大学药学院,武汉430074;中南民族大学药学院,武汉430074【正文语种】中文【中图分类】Q786黑色素聚集激素(MCH)最初于1983年从大马哈鱼(Oncorhynchus keta)垂体分离获得，因通过黑色素细胞中的黑色素聚集来调节硬骨鱼类的皮肤颜色而得名[1].MCH参与机体多种生理功能的调节，包括摄食调节、下丘脑-垂体-肾上腺轴、能量平衡、生殖和感官感知等[2]，其中最受关注的是其在调节摄食和能量代谢中的作用[3].在大鼠与小鼠脑室内短期或长期注射MCH，均会引起摄食增加，进而导致肥胖[4]，MCH过表达的转基因小鼠可表现为进食增多，最终导致肥胖[5]；敲除MCH基因的小鼠中MCH基因水平的降低可以导致进食减少和代谢增强，进而导致小鼠体重减轻、体型瘦小[6].这些研究结果表明：MCH在哺乳动物中可能发挥着增强食欲、降低代谢的作用.本文通过构建MCH基因的绿色荧光蛋白表达载体，并使其在HEK293细胞系中稳定表达，为探讨MCH在能量代谢中的作用及机制提供细胞模型.1 材料与方法1.1 材料和仪器胎牛血清(杭州四季青)，高糖DMEM培养基(Gibco-BRL)，DNA Marker(广州东胜)，DNA凝胶回收试剂盒(Axygen)，限制性内切酶(TAKARA)，引物合成、DNA测序(武汉擎科)，脂质体Lipofectamine 2000(Invitrogen)，质粒提取试剂盒(Axygen)，大肠杆菌DH5α和HEK293(本室保存).冷冻离心机(Eppendorf 5417R台式，德国)，高压双稳电泳仪(DYY-4C型，北京六一)，水平电泳槽(DYCP-31D型，北京六一)，自动凝胶图像分析仪(JS380，上海培清)，核酸蛋白紫外测定仪(GenenQuant Ⅱ,ciences).1.2 pEGFP-C1的大量获取按标准方法将pEGFP-C1质粒转化入DH5α中，将菌液涂布于LB固体培养基(含50 μg/mL卡那霉素).挑出阳性菌落扩大培养于37 ℃含50 μg/mL卡那霉素的LB 液体培养基中，130 r/min转速.收集细菌，提取质粒.经Nhe I单酶切，1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定.1.3 MCH基因编码区的克隆从脑组织中提取总RNA，将RNA逆转录为cDNA[7].参照Genbank中MCH基因的全长序列，设计引物：上游引物5′-GATCAGATCTGAACCACTGAAGAAACACTCG-3′(引入BgI Ⅱ酶切位点，下划线部分)，下游引物5′-GATCCTGCAGCAACACTGGATTACAGAAAA-3′(引入Pst I 酶切位点，下划线部分).PCR反应体系为：0.25 μL TaKaRa Ex Taq(5 U/ μL)，5 μL 10×Ex Taq Buffer(Mg2+ Plus)，4 μL dNTP Mixture(各2.5 mM)，2 μL模板cDNA，上下引物各1 μL(10 μM)，加双蒸水至50 μL.反应程序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，35 cycles；72 ℃ 5 min.反应产物于1.2 %琼脂糖凝胶电泳鉴定，割胶回收PCR产物.1.4 pEGFP-C1-MCH真核表达载体的构建将pEGFP-C1双酶切，双酶切反应为：5 μL 质粒，2 μL 10×H Buffer，Pst I与BgI Ⅱ各1 μL，11 μL双蒸水.于37 ℃反应1 h后1.2 %电泳鉴定后割胶回收.取pEGFP-C1及MCH双酶切产物，加入1 μL T4 DNA ligase，1 μL 10×T4 DNA ligase buffer，加水至10 μL，于22 ℃反应4 h，按1.2将重组质粒转入DH5α菌株.挑取阳性菌落做菌落PCR，扩大培养含MCH片段的菌群.提取质粒，琼脂糖凝胶电泳鉴定产物大小，并送重组质粒测序鉴定.1.5 pEGFP-C1-MCH重组质粒的转染转染前24 h，将HEK293细胞铺板于六孔板中，使用DMEM完全培养基，于37 ℃、5% CO2饱和湿度中培养.待其汇合度为70% ～ 80%时，吸弃原培养液，PBS洗3次，加入1.5 mL无血清无抗生素DMEM培养基.分别取适量重组质粒pEGFP-C1-MCH及5 μL Lipofectamine 2000稀释于50 μL无抗生素无血清的DMEM培养基，轻轻摇晃混匀，5 min后静置20 min.逐滴加入六孔板中，混匀，转染6 h后更换完全培养基[8].1.6 转染后倒置荧光显微镜观察细胞转染24, 48, 72 h后于荧光倒置显微镜在488 nm波长紫外光激发下观察荧光蛋白表达情况.1.7 重组质粒在转染细胞中的表达检测pEGFP-C1-MCH转染细胞24 h后，消化收集细胞，利用半定量RT-PCR技术检测该质粒在HEK293细胞中的表达.先利用Trizol试剂提取细胞总RNA，再使用RNA逆转录试剂盒以2 μg细胞总RNA为模板合成cDNA第一条链，再各取2μL cDNA 作为模板DNA用PCR技术分析MCH基因表达情况，以β-actin基因作为内参. MCH 的上游引物为5′-GATCAGATCTGAACCACTGAAGAAACACTCG-3′，下游引物为5′-GATCCTGCAGCAACACTGGATTACAGAAAA-3′，β-actin的上游引物为5′-GGGTATGGAGTCTTGCG G-3′，下游引物为5′- TTTCATTGTGCTGGGGG-3′，扩增条件均为94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35 cycles；72 ℃ 5 min.2 结果与分析2.1 pEGFP-C1-MCH重组载体的酶切鉴定大量制备的载体及MCH片段分别经BgI Ⅱ，Pst I双酶切及电泳检测后，产物大小正确，分别为4.7 kb和477 bp(见图1).将载体片段和目的片段连接、转化，挑取阳性克隆，提取质粒DNA后，重组质粒分别经单酶切(BgI Ⅱ)，双酶切(BgI Ⅱ与Pst I)检测，产物大小分别约为5.2，4.7 kb，与原载体及插入片段大小匹配.由于插入片段过小，在重组质粒双酶切产物电泳图中未能显示477 bp的条带(见图2).1) 1 kb Marker; 2)载体片段4.7 kb; 3) 目的片段477 bp图1 制备载体和目的片段DNA的制备Fig.1 Preparation of the vector and target DNA1)阳性克隆的BgI Ⅱ酶切; 2) 阳性克隆BgI Ⅱ+Pst I双酶切; 3) 1 kb Marker图2 阳性克隆酶切鉴定Fig.2 Identification of the positive clone2.2 重组载体的测序鉴定挑取有插入片段的阳性克隆测序.双向测序结果表明：重组克隆中插入了相应的MCH基因目的片段.经Blast序列比对显示，插入片段大小、方向正确，证明目的片段MCH基因正确地插入了pEGFP-C1质粒.2.3 pEGFP-C1-MCH质粒在HEK293细胞中的表达重组质粒pEGFP-C1-MCH质粒DNA转入HEK293细胞后，将转染细胞置于倒置荧光显微镜下观察，在48 h 可观察到部分细胞表达EGFP；72 h后，表达的EGFP的细胞数量逐渐增多，细胞中有较强的荧光蛋白表达(见图3)，EGFP均匀分布在胞质中.图3 EGFP在转染pEGFP-C1-MCH的HEK293细胞中的表达Fig.3 EGFP expression in HEK293 cells transfected by pEGFP-C1-MCH2.4 RT-PCR鉴定重组细胞中MCH的表达RT-PCR检测重组细胞中MCH基因的表达水平，结果显示：pEGFP-C1-MCH转染HEK293细胞24 h后，MCH基因在重组细胞中稳定表达(见图4).1)DL 2000 Marker; 2)pEGFP-C1的β-actin mRNA; 3) pEGFP-C1 的MCH mRNA;4)阴性对照; 5)pEGFP-C1-MCH的β-actin mRNA; 6)pEGFP-C1-MCH 的MCH mRNA.图4 重组细胞中MCH mRNA的表达水平Fig.4 mRNA expression level of MCH gene in recombinant cells3 讨论生物的物质和能量代谢是维持机体生命活动的重要基础，能量代谢是人体代谢的最基本形式，下丘脑在维持机体能量稳态中发挥着重要作用.在下丘脑中有许多刺激或抑制进食的下丘脑肽，如Leptin，Kisspeptin等.最近研究发现，下丘脑肽MCH在调节能量代谢的过程中扮演着重要角色.人类中的神经肽MCH由19个氨基酸组成，在脊椎动物的进化中高度保守，从大马哈鱼(Oncorhynchus tschawytscha)[9]、银鲑(O. kisutsh) [10]、罗非鱼(Oreochromis mossambicus) [11]、金鱼(Carassius auratus)[12]等中分离得到的MCH由17个氨基酸组成，其中两个Cys位点间形成的分子内二硫键使MCH 呈环状结构.MCH前体蛋白(proMCH)基因由3个外显子组成，编码生成165个氨基酸的多肽.proMCH在人和啮齿类中除经剪切生成MCH外，还生成另外两种生理功能不明的多肽：含有13个氨基酸NEI和含有19个氨基酸的NGE [13].MCH 主要分布于下丘脑侧面和未定带区域，发挥着许多生理功能：包括调节硬骨鱼类皮肤的颜色；调节下丘脑-垂体-肾上腺轴；刺激大鼠神经垂体分泌催产素等.最近研究发现MCH在调节体重方面发挥着重要的作用：转基因小鼠中过表达MCH将抵抗胰岛素且患有肥胖症；在脑室内注射MCH的大鼠进食过多，最终引发肥胖；基因工程肥胖鼠(ob/ob)以及禁食小鼠下丘脑中的MCH表达水平增高；MCH水平降低的小鼠食量减少，代谢率增高，最终导致体重减轻和脂肪含量下降[14].为了研究整个MCH的功能，本研究克隆了MCH前体蛋白基因.pEGFP-C1载体具有容易转染真核细胞，对目的蛋白的生物学功能和宿主细胞的生长无影响等特点，其中的报告基因绿色荧光蛋白有利于示踪和检测所克隆的目的基因，并且荧光蛋白稳定表达.该载体全长4.7 kb，其中含有的CMV启动子和SV 40 polyA加尾信号具有高效的转录调控作用，多克隆位点有利于外源基因的插入，抗性基因可用于克隆或真核表达时的筛选.本研究将MCH基因克隆入pEGFP-C1载体，经酶切和测序鉴定，克隆的MCH质粒序列和预期相符，真核表达载体pEGFP-C1-MCH克隆成功.通过脂质体2000介导真核表达载体pEGFP-C1-MCH转染HEK293细胞，获得了高表达MCH的细胞株，该细胞株形态与生长速度与野生型HEK293细胞无差别，倒置荧光显微镜下观察以及RT-PCR结果显示，EGFP-MCH融合蛋白在细胞中稳定表达.该细胞模型的成功构建为后续研究MCH基因在能量代谢方面的功能创建了一个较好的细胞平台.参考文献【相关文献】[1] Kawauchi H,Kawazoe I,Tsubokawa M,et al.Characteri-zation of melanin-concentrating hormone in chum salmon pituitaries [J]. 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（转载）一.九种表达载体Pllp-OmpA, pllp-STII, pMBP-P, pMBP-C,pET-GST, pET-Trx, pET-His, pET-CKS, pET-DsbA二.克隆载体pTZ19RDNApUC57DNAPMD18TPQE30pUC18pUC19pTrcHisApTrxFuspRSET-ApRSET-BpVAX1PBR322pbv220pBluescriptIIKS( )L4440pCAMBIA-1301pMAL-p2XpGD926三.PET系列表达载体ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETDsbFusionSystems39band40b ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystem33b ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystems ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystemsplusCompetentCells ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETGSTFusionSystems41and42 ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETNusAFusionSystems43.1and44 ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETVectorDNAProteinPurification?PurificationSystems?Strep?TactinResinsandPurificationKits四.PGEX系列表达载体TEcoR?pGEX-1I/BAPpGEX-2TpGEX-2TKpGEX-3XpGEX-4T-1pGEX-4T-2pGEX-4T-3pGEX-5X-1pGEX-5X-2pGEX-5X-3pGEX-6P-1pGEX-6P-2pGEX-6P-3五.PTYBsystemPTYB1PTYB2PTYB11PTYB12六.真核表达载体pCDNA3.1(-)pCDNA3.1( )pPICZalphaApGAPZαAPYES2.0pBI121pEGFP-N1pEGFP-C1pPIC9KpPIC3.5K如何阅读分析质粒图谱载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。
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pEGFP-c-fos重组质粒的构建及其在赤潮毒素检测中的初步应用
pEGFP-c-fos重组质粒的构建及其在赤潮毒素检测中的初步应
用
目的：构建一个含c-fos启动子和EGFP报告基因的pEGFP-c-fos重组质粒载体。
体外转染膀胱癌BIU-87细胞后，利用赤潮毒素作用后细胞表达绿色荧光蛋白的变化来检测赤潮毒素，初步建立一种以细胞为基础受体水平的赤潮毒素检测方法。
方法：VspI、EcoRI分别双酶切pEGFP质粒和PCR扩增的c-fos启动子片断后，用T4-DNALigase连接，构建pEGFP-c-fos重组质粒载体，并测序鉴定。
利用脂质体法将重组质粒pEGFP-c-fos转入BIU-87细胞中，通过G418筛选得到抗性克隆，加入Na~+通道激活剂乌头碱诱导绿色荧光蛋白表达。
加入不同浓度的赤潮毒素GTX，荧光显微镜下拍摄采集不同毒素水平下绿色荧光蛋白的表达图像，利用美国Image-pro Plus专业图像分析软件对图像进行荧光强度定量分析，绘出绿色荧光表达强度与不同浓度GTX毒素的关系曲线。
结论：成功构建了pEGFP-c-fos重组质粒载体，筛选得到抗性克隆并建立
pEGFP-c-fos-BIU-87细胞株。
经诱导，抗性细胞发出较强的绿色荧光，表明重组质粒pEGFP-c-fos在BIU-87细胞中成功表达。
建立了绿色荧光表达强度与不同浓度GTX毒素的关系曲线，为构建一种以细胞为基础的赤潮毒素检测方法奠定基础。
人源pEGFP-C1-p38γ真核表达质粒的构建及其功能研究
・97 •安徽医科大学学报 Acta Unwersitath Medicinalit An,aui 2028 Jo ；56(8)网络出版时间：2020 -10 -9 O ：/) 网络出版地址：https ：//kus. cnkd uePkcms/dxWl/34. 1065. R ； 20201208. 091). 033. html人源pEGFP-C1-2337真核表达质粒的构建及其功能研究胡 爽*8，杨 莉8，陈 晨8,潘林鑫2,李良云8,杨俊发8,周 焕6，徐 涛82225 -08 -10 接收基金项目：国家自然科学基金(编号:81779522-安徽省自然科学基金(编号：00085 MH235)作者单位:安徽医科大学8药学院、、生命科学学院，合肥2369348蚌埠医学院第一附属医院国家药物临床试验机构，蚌埠233794作者简介:胡爽，女,硕士研究生；周焕，男,副教授，硕士生导师，责任作者,E-mail ： zhhuhuankest@ 163. com ；徐 涛，男，副教授，硕士生导师，责任作者,E-mail ： xxtoc@ abmu. eXu. cn摘要目的构建人源pEGFP-L)-p33Y 表达质粒，并观察其对乙醇刺激的L0-2肝细胞的增殖和凋亡及炎症因子分泌的影响。
方法 在人源L0O 肝细胞中提取RNA 并且逆转录 为cDNA,同时将引物稀释到10 pnol/L ,其余作为储液备用。
采用PCR 技术扩增p 38y 并鉴定，使用AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒进行PCR 产物的纯化回收，再对PCR 产物及载体进行酶切回收，酶切片段连接后,进行连接产物的转化、 挑菌、摇菌、质粒小抽。
酶切鉴定后，进行测序鉴定。
将构建好的质粒转染至乙醇刺激的人源L0-2细胞中，通过MTT 实验和流式细胞术检测对其增殖和凋亡的影响，并用Westernblot 技术检测炎症因子白细胞介素O((P-9)和肿瘤坏死因子-c(TNF-c )在L0C 肝细胞中的表达。
pEGFP-C1质粒图谱介绍
(PR29971; published 03 October 2002)Restriction Map and Multiple Cloning Site (MCS) of pEGFP-C1. All restriction sites shown are unique. The Xba I and Bcl I sites (*) are methylated in the DNA provided by BD Biosciences Clontech. If you wish to digest the vector with these enzymes, you will need to transform the vector into a dam – host and make fresh DNA.DescriptionpEGFP-C1 encodes a red-shifted variant of wild-type GFP (1–3) which has been optimized for brighter fluorescence and higher expression in mammalian cells. (Excitation maximum = 488 nm;emission maximum = 507 nm.) pEGFP-C1 encodes the GFPmut1 variant (4) which contains the double-amino-acid substitution of Phe-64 to Leu and Ser-65 to Thr. The coding sequence of the EGFP gene contains more than 190 silent base changes which correspond to human codon-usage preferences (5). Sequences flanking EGFP have been converted to a Kozak consensus translation initiation site (6) to further increase the translation efficiency in eukaryotic cells. The MCS in pEGFP-C1 is between the EGFP coding sequences and the SV40 poly A. Genes cloned into the MCS will be expressed as fusions to the C-terminus of EGFP if they are in the same reading frame as EGFP and there are no intervening stop codons. SV40 polyadenylation signals downstream of the EGFP gene direct proper processing of the 3' end of the EGFP mRNA. The vector backbone also contains an SV40 origin for replication in mammalian cells expressing the SV40 T-antigen. A neomycin resistance cassette (Neo r ), consisting of the SV40 early promoter, the neomycin/kanamycin resistance gene of Tn5, and polyadenylation signals from the Herpes simplex virus thymidine kinase (HSV TK) gene, allows stably transfected eukaryotic cells to be selected using G418. A bacterial promoter upstream of this cassette expresses kanamycin resistance in E. coli . The pEGFP-C1backbone also provides a pUC origin of replication for propagation in E. coli and an f1 origin for single-stranded DNA production.pEGFP-C1 Vector Information PT3028-5GenBank Accession #: U55763Catalog #6084-1(1642)(2577)Ase I(597) I (601)Eco (3854)G I (1323)TCC GGA CTC AGA TCT CGA GCT CAA GCT TCG AAT TCT GCA GTC GAC GGT ACC GCG GGC CCG GGA TCC ACC GGA TCT AGA TAA CTG ATC AHin d III Xho I Apa I Bsp 120 I Kpn I Asp 718 I Bam H I Xba I* Xma I Sma ISac II Sal I Acc I Sac I Ecl 136 II Eco R I Pst I Bsp E I Bgl II Bcl I*UseFusions to the C terminus of EGFP retain the fluorescent properties of the native protein allowing the localization of the fusion protein in vivo. The target gene should be cloned into pEGFP-C1 so that it is in frame with the EGFP coding sequences, with no intervening in-frame stop codons. The recombinant EGFP vector can be transfected into mammalian cells using any standard transfection method. If required, stable transformants can be selected using G418 (7). pEGFP-C1 can also be used simply to express EGFP in a cell line of interest (e.g., as a transfection marker). Location of features•Human cytomegalovirus (CMV) immediate early promoter: 1–589Enhancer region: 59–465; TATA box: 554–560Transcription start point: 583C→G mutation to remove Sac I site: 569•Enhanced green fluorescent protein geneKozak consensus translation initiation site: 606–616Start codon (ATG): 613–615; Stop codon: 1408–1410Insertion of Val at position 2: 616–618GFPmut1 chromophore mutations (Phe-64 to Leu; Ser-65 to Thr): 805–810His-231 to Leu mutation (A→T): 1307Last amino acid in wild-type GFP: 1327–1329•MCS: 1330–1417•SV40 early mRNA polyadenylation signalPolyadenylation signals: 1550–1555 & 1579–1584; mRNA 3' ends: 1588 & 1600•f1 single-strand DNA origin: 1647–2102 (Packages the noncoding strand of EGFP.)•Bacterial promoter for expression of Kan r gene–35 region: 2164–2169; –10 region: 2187–2192Transcription start point: 2199•SV40 origin of replication: 2443–2578•SV40 early promoterEnhancer (72-bp tandem repeats): 2276–2347 & 2348–241921-bp repeats: 2423–2443, 2444–2464, & 2466–2486Early promoter element: 2499–2505Major transcription start points: 2495, 2533, 2539 & 2544•Kanamycin/neomycin resistance geneNeomycin phosphotransferase coding sequences:Start codon (ATG): 2627–2629; stop codon: 3419–3421G→A mutation to remove Pst I site: 2809C→A (Arg to Ser) mutation to remove Bss H II site: 3155•Herpes simplex virus (HSV) thymidine kinase (TK) polyadenylation signalPolyadenylation signals: 3657–3662 & 3670–3675•pUC plasmid replication origin: 4006–4649Primer Locations•EGFP-N Sequencing Primer (#6479-1): 679–658•EGFP-C Sequencing Primer (#6478-1): 1266–1287Propagation in E. coli•Suitable host strains: DH5α, HB101, and other general purpose strains. Single-stranded DNA production requires a host containing an F plasmid such as JM109 or XL1-Blue.•Selectable marker: plasmid confers resistance to kanamycin (30 µg/ml) to E. coli hosts.• E. coli replication origin: pUC•Copy number: ≈500•Plasmid incompatibility group: pMB1/ColE1References1.Prasher, D. C., et al. (1992) Gene 111:229–233.2.Chalfie, M., et al. (1994) Science263:802–805.3.Inouye, S. & Tsuji, F. I. (1994) FEBS Letters 341:277–280.4.Cormack, B., et al. (1996) Gene 173:33–38.5.Haas, J., et al. (1996) Curr. Biol. 6:315–324.6.Kozak, M. (1987) Nucleic Acids Res. 15:8125–8148.7.Gorman, C. (1985) In DNA Cloning: A Practical Approach, Vol. II, Ed. Glover, D. M. (IRL Press, Oxford, UK) pp. 143–190.Note: The attached sequence file has been compiled from information in the sequence databases, published literature, and other sources, together with partial sequences obtained by BD Biosciences Clontech. This vector has not been completely sequenced.Notice to PurchaserUse of BD Biosciences Clontech’s Living Colors™ products containing DNA sequences coding for mutant Aequorea victoria green fluorescent protein (GFP) variants or proteins thereof requires a license from Amersham Biosciences under U.S. Patent Nos. 5,625,048; 5,777,079; 6,054,321 and other pending U.S. and foreign patent applications. In addition, certain BD Biosciences Clontech products are made under U.S. Patent No. 5,804,387 licensed from Stanford University.Not-For-Profit research institutes or entities are granted an automatic license with the purchase of this product for use in non-commercial internal research purposes, the terms of which are disclosed in detail in the license that accompanies the shipment of this product. Such license specifi-cally excludes the right to sell or otherwise transfer this product or its components to third parties.For-Profit research institutes or entities must obtain a license from Amersham Biosciences. E-mail: gfp@Please contact BD Biosciences Clontech directly for any other assistance, including purchasing and technical support. All companies and institutions purchasing Living Colors™ products will be included in a quarterly report to Aurora Biosciences, as required by the BD Biosciences Clontech/Aurora Biosciences license agreement.This product is intended to be used for research purposes only. It is not to be used for drug or diagnostic purposes nor is it intended for human use. BD Biosciences Clontech products may not be resold, modified for resale, or used to manufacture commercial products without written approval of BD Biosciences Clontech.© 2002, Becton, Dickinson and Company。
质粒图谱查询方法
By
0099--pGE-1—Stratagene--RNAi载体 0100--pSUPER.p53—OligoEngine--RNAi载体 0101--palter-ex1--promega 0102--pACYCDuet-1--NOVAGEN 0103--pEX lox(+) Vector—NOVAGEN--原核表达 0104--质粒名称：pBACgus-8 Transfer Plasmid—NOVAGEN--CHUANSUO 0105--pSCREEN?-1b(+) Vector Map—novagen--筛选 0106--PGEX-2T--BD Co--pDsRed2--Clontech 0107--pbgal-Basic—Clontech--mammalian reporter vector 0108—pBI—Clontech--express two genes of interest from a bidirectional tet-responsive promoter 0109--质粒名称：pbgal-Control—Clontech--mammalian reporter vector 0110-- pGEX-5X-1--原核表达 0111--pBI-EGFP—Clontech--pBI-EGFP-- coexpress 0112--pBI-G—Clontech--pBI-G--express b-galactosidase 0113--pBI-GL—Clontech--pBI-GL --express luciferase and b-galactosidase 0114--pCMS-EGFP—Clontech--mammalian expression vector 0115--pd2EYFP-1—Clontech--启动子测定 0116--质粒名称--pd2EYFP-N1—Clontech--融合表达 0117--pd4EGFP-Bid—Clontech--融合表达 Bid 0118--pDNR-CMV—Clontech--pDNR-CMV 0119--pDNR-EGFP Vector—Clontech 0120--pDNR-LacZ –Clontech 0121--pECFP-Endo—Clontech--真核表达0122--pECFP-ER—Clontech--真核表达0123--pEGFP-Actin—Clontech--真核表达0124--pGAD GH--Clontech--酵母表达 0125--pGADT7-Rec –Clontech--酵母表达 0126--pGADT7-RecAB—Clontech--酵母表达 0127--pGADT7-Rec2—Clontech--酵母表达 0128--pGBKT7—Clontech--酵母表达 0129--pHAT 10/11/12—Clontech 0130--pHAT20—Clontech 0131—pHygEGFP—Clontech 0132—pLacZi—Clontech 0133—pM—Clontech--pM is used to generate a fusion of the GAL4 DNA-BD 0134--pPKCa-EGFP—Clontech 0135--pPKCb-EGFP—Clontec 0136--pSIREN-DNR Vector—Clontech--RNAi 0137--pSIREN-DNR-DsRed-Express Vector—Clontech--RNAi 0138--pSIREN-RetroQ—Clontech--RNAi 0139--pIRES-EYFP—Clontech--RNAi 0140--pSRE-Luc—Clontech--RNAi 0141--pTK-neo—novagen--原核表达 0142--pZsGreen Vector—Clontech--pZsGreen is a pUC19-derived prokaryotic expression vector 0143--pTandem-1—novagen--原核表达 0144--pZsGreen1-C1Vector—Clontech----真核表达 0145--质粒名称：M13mp18—novagen--原核表达 0146--pZsGreen1-DR Vector—Clontech--真核表达 0147--PZsGreen1-N1 Vector—Clontech --真核表达 0148--T7Select415-1b—novagen----真核表达 0149--pZsYellow Vector—Clontech --真核表达 0150—pTimer—Clontech --真核表达 0151--pTA-Luc—Clontech --真核表达 0152--pTAL-Luc—Clontech --真核表达 0153--pTA-SEAP—Clontech --真核表达 0154--pTAL-SEAP—Clontech --真核表达 0155--pTet-On—Clontech --真核表达 0156--pTet-Off—Clontech --真核表达 0157--pTet-ATF—Clontech --真核表达 0158--pTet-CREB—Clontech --真核表达