菌种退化复壮与保藏
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菌种的保藏与复壮
(二)低温定期移植法
• 把培养好的斜面菌种放在低温干燥处保存，
定期移植，一般3～6个月移植一次(视菌种 特征而定)。也可以用穿刺培养，定期移植 法保藏细菌，其效果也较好。穿刺培养是 将含0.6％～0.8％的琼脂培养基装试管灭 菌后直立冷凝后，用接种针尖挑取少量菌 体，垂直刺入琼脂培养基中心，放在适当 温度下培养，待菌长好后即可放低温保存， 此法较斜面保存有利，大肠杆菌可保藏2年 以上不发生明显变异。
• (2)保护剂 不同种类的保护剂对不同
微生物的作用是不同的，如个别菌种在 脱脂乳作保护剂的情况下死亡率高达 99.99%，而采用葡聚糖等混和保护剂时 死亡率大大减少。一般情况下，那些容 易保存的菌种对保护剂的要求不很严格， 而不易保存的菌种对保护剂的要求却很 苛刻。因此，选择好的保护剂是冷冻干 燥保存菌种的关键因素。
(六)真空冷冻干燥法
• (3)菌种准备及分装 菌种要求为生长良好
的纯种，菌龄以处于稳定期为好，孢子是 新鲜的。每支长好的斜面加2～3ml保护剂， 用接种环将菌苔轻轻刮起(注意勿刮起培养 基)，制成菌悬液。如用液体培养的菌种， 则需经离心收集和用灭菌生理盐水洗涤细 胞，收集的菌体用保护剂悬浮制成菌悬液。 悬液中菌数要求达到10 8～10 10cfu/ml 为宜。悬液制备完成尽快分装和冻结。分 装安瓿时可用灭菌的长滴入安瓿管底部， 装量可依据冷冻干燥机效能而定。
(六)真空冷冻干燥法
• (4)预冻 分装好的安瓿管需要进行预冻，即放在-
30～40℃下冻结20～60min，也可以用干冰和无水 乙醇冻5～10min。
• (5)冷冻干燥 经预冻的安瓿放入干燥箱中开始
抽真空干燥。此时干燥箱温度控制在-30℃以下， 并尽快使真度达到66Pa以下。此后可还渐升温以加 速水分升华，但升温不宜过快，以免引起样品融化。 干燥时间视冻干机效率、样品装量及性质等而寂， 以样品最终水分含量达到1%～3%为准。具体操作时 是根据冻干样品呈酥块工松散片状；真空度接近空 载时最高真空；样品温度与管外温度接近。 完毕将安瓿管在真空下用火焰烧熔密封，并用高频 真空检测真空度。
菌种的衰退、复壮和保藏
课外学习资源
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微生物学
菌种的衰退、复壮和保藏（ 课时） 第八章 菌种的衰退、复壮和保藏（4课时）
食品教研室
性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本 要求，否则生产或科研都无法正常进行。 影响微生物菌种稳定性的因素：
a）变异； ）变异； b）污染； ）污染； c）死亡. ）死亡
一、菌种的衰退(degenration)
特点
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2.矿油保藏法
矿油 处理 灭菌：152kpa、30min 去水：40~50℃烘至无色透明
无菌检验 ？ 注入种管 口堵胶塞 淹没斜面约
3.自然基质保藏法
麦粒浸透、煮熟 基质的处理 麸皮拌湿 灭菌 接种 培养 装管
干燥器去水
防衰老 特点 保藏时间长 转接后生长旺 易污染，灭菌要彻底
使菌种 不降低或不丧失其优良性 原理 以尽量延长使用时间
创造不利于菌种生长的一切条件， 使其代谢处于休眠状态。
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低温
缺营养
不利 条件
干燥
无氧
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（二）常用保藏法（以CICC为例） 以母种形式保藏 1.斜面低温法 斜面菌种置4~6℃冰箱中（3~6个月） 简便 保藏时间短 易污染及退化 不适于草菇等菌类
b）通过寄主体进行复壮； 2. 有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，在日常的菌种 有意识地利用微生物会发生自发突变的特性， 维护工作中不断筛选“正变”个体(广义复壮 积极措施) 广义复壮， 维护工作中不断筛选“正变”个体 广义复壮，积极措施 。
纯种的分离方法
平板划线分离法 平板涂布分离法 平板倾注分离法 用“分离小室”进行单细胞分离 显微操纵器进行单细胞分离 菌丝尖端切割法进行单细胞分离
四节菌种退化复壮与保藏
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（3）利用不易衰退的细胞传代：霉菌、放线菌： 无性孢子或有性孢子
（4）采用有效的菌种保藏方法
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二. 菌种的复壮 rejuvenation
狭义复壮 在菌种已发生衰退
的情况下，通过纯种分离和 测定典型性状、生产性能等 指标，从已衰退的群体中筛 选出少数尚未退化的个体， 以达到恢复原菌株固有性状 的相应措施；
结（-25—-40℃）→抽真空（至0.01mmHg） → 真空封口 → 检 查真空度 → 保藏
措施：低温、干燥，缺氧，有保护剂 适用：各大类 保藏期：5-15年或更长
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5.甘油悬液低温冷冻保藏法 ▪ 方法：菌种培养 → 15-30%甘油缓冲液悬浮 → 加入保藏管中
→ 置 -70℃冰箱保藏 措施：低温（-70℃）、保护剂（15~50%甘油） 适用：细菌、酵母菌 保藏期：约10年 6.液氮保藏法 ▪ 方法：菌种培养 → 保护剂悬浮 → 加入保藏管中 → 置液氮瓶
中国工业微生物菌种保藏中心CICC(归口轻工业总会) 中国食品发酵工业研究所(IFFI)
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中国医学微生物菌种保藏中心CMCC(归口卫生部) 中国医学科学院皮肤病研究所(ID)，南京 卫生部药品生物制品检定所(NICPBP) 中国预防医学科学院病毒研究所
中国抗生素微生物菌种保藏中心CACC(国家医药管 理局) 中国医学科学院医药生物技术研究所 四川抗生素研究所(SIA)，四川 华北制药厂抗生素研究所(IANP), 石家庄
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三. 菌种的保藏
（一）目的 使微生物菌种保持原来的性状和活力不退化、
不死亡、不被污染，便于研究、交换和使用 。 （二）原理
挑选典型培养物（typical culture）的优良纯 种，并创造最有利于休眠的环境条件，使微生物处于 代谢不活泼、生长受抑制的休眠状态。
（3）利用不易衰退的细胞传代：霉菌、放线菌： 无性孢子或有性孢子
（4）采用有效的菌种保藏方法
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二. 菌种的复壮 rejuvenation
狭义复壮 在菌种已发生衰退
的情况下，通过纯种分离和 测定典型性状、生产性能等 指标，从已衰退的群体中筛 选出少数尚未退化的个体， 以达到恢复原菌株固有性状 的相应措施；
结（-25—-40℃）→抽真空（至0.01mmHg） → 真空封口 → 检 查真空度 → 保藏
措施：低温、干燥，缺氧，有保护剂 适用：各大类 保藏期：5-15年或更长
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5.甘油悬液低温冷冻保藏法 ▪ 方法：菌种培养 → 15-30%甘油缓冲液悬浮 → 加入保藏管中
→ 置 -70℃冰箱保藏 措施：低温（-70℃）、保护剂（15~50%甘油） 适用：细菌、酵母菌 保藏期：约10年 6.液氮保藏法 ▪ 方法：菌种培养 → 保护剂悬浮 → 加入保藏管中 → 置液氮瓶
中国工业微生物菌种保藏中心CICC(归口轻工业总会) 中国食品发酵工业研究所(IFFI)
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中国医学微生物菌种保藏中心CMCC(归口卫生部) 中国医学科学院皮肤病研究所(ID)，南京 卫生部药品生物制品检定所(NICPBP) 中国预防医学科学院病毒研究所
中国抗生素微生物菌种保藏中心CACC(国家医药管 理局) 中国医学科学院医药生物技术研究所 四川抗生素研究所(SIA)，四川 华北制药厂抗生素研究所(IANP), 石家庄
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三. 菌种的保藏
（一）目的 使微生物菌种保持原来的性状和活力不退化、
不死亡、不被污染，便于研究、交换和使用 。 （二）原理
挑选典型培养物（typical culture）的优良纯 种，并创造最有利于休眠的环境条件，使微生物处于 代谢不活泼、生长受抑制的休眠状态。
菌种的衰退、复壮和保藏
菌种的衰退、复壮和保藏1. 内容1.菌种的衰退：菌种退化是指由于自发突变的结果，而使某一物种有一系列生物学性状发生量变或质变的现象（群体中退化细胞在数量上占一定数值后，表现出菌种生产性能下降的现象）。
具体表现为：⏹原有的形态性状变得不典型了；⏹生长速度变慢，产生的孢子变少，或颜色改变，甚至变形；⏹代谢产物生产能力下降，在生理上常指产量的下降；⏹致病菌对宿主侵染力的下降；⏹对外界不良条件包括低温、高温或噬菌体侵染等抵抗能力的下降；等等。
2.衰退菌种的复壮狭义的复壮仅是一种消极的措施，指的是在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施。
广义的复壮则应是一项积极的措施，即在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状的测定工作，以期从中选择自发的正变个体。
（1）衰退的防止:⏹控制传代的次数⏹创造良好的培养条件⏹利用不易衰退的细胞传代⏹采用有效的菌种保藏方法（2）菌种的复壮⏹纯种分离法⏹通过宿主体复壮对于因长期在人工培养基上移种传代而衰退的病原菌，可接种到相应的昆虫或动、植物宿主体中，通过这种特殊的活的“选择性培养基”一至多次选择，就可从典型的病灶部位分离到恢复原始毒力的复壮菌株。
⏹淘汰已衰退的个体（3）菌种的保藏⏹原理人为地创造合适的环境条件，使微生物的代谢处于不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。
这些人工环境主要从低温、干燥、缺氧三方面设计。
⏹常用的方法：冷冻干燥保藏法、液氮保藏法、斜面保藏法、液体石蜡覆盖保藏法、载体保藏法、悬液保藏法、寄主保藏法等。
2. 练习一．填空1.某纯种微生物群体中的个别个体由于发生自发突变的结果，而使该物种原有一系列生物学性状发生衰退性的量变或质变的现象，叫做_____。
答案：衰退2. ______属于第三代的生物武器，包括高致病力的病原体和抗药菌等。
菌种的复壮与保藏(陈)
第二十八页，共四十六页。
➢石蜡油封藏法 • 措施：阻隔了空气，使菌体处于缺氧状态下，而
且又防止了水分挥发。
• 方法：液体石蜡150～170℃烘箱内灭菌lh；或121℃高压蒸
汽灭菌60～80min，再置于80℃的烘箱内烘干除去水分→倒入菌 种管中（高出1cm） → 4℃保存。
• 适用：霉菌、酵母菌、放线菌、好氧性细菌(xìjūn)等 • 保藏期：1～2年，或更长
常用的保护剂有脱脂牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等高 分子物质。
第三十四页，共四十六页。
复苏方法： —— 先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部， —— 将安瓿管顶部烧热， —— 用无菌棉签沾冷水，在顶部擦一圈，顶
部出现裂纹，用挫刀或镊子颈部轻叩一下， 敲下已开裂的安瓿管的顶端， —— 用无菌水或培养液溶解菌块，使用无菌 吸管移入新鲜培养基上，进行(jìnxíng)适温培养。
第二十九页，共四十六页。
➢ 砂土管干燥保藏法 • 措施(cuòshī)：无营养，缺氧，干燥 • 方法：孢子或芽孢悬液 → 加入无菌砂
土管中→ 干燥→ 封口 → 5℃保藏 • 适用：产孢子的丝状真菌、放线菌；有
芽孢的细菌 • 保藏期：1~10年或更长
第三十页，共四十六页。
沙土 管制作 (shātǔ)
另一方面，传代次数越多，群体中个别的衰退型细胞数量增加 并占据优势越快，致使群体表型出现衰退。
第六页，共四十六页。
3、不适宜的培养和保藏条件 不适宜的培养和保藏条件是加速菌种衰退的另一个重要原因。
不良的培养条件如营养成分、温度、湿度、pH值、通气(tōng qì)量 等和保藏条件如营养、含水量、温度、氧气等，不仅会诱发衰退 型细胞的出现，还会促进衰退细胞迅速繁殖，在数量上大大超过 正常细胞，造成菌种衰退。
➢石蜡油封藏法 • 措施：阻隔了空气，使菌体处于缺氧状态下，而
且又防止了水分挥发。
• 方法：液体石蜡150～170℃烘箱内灭菌lh；或121℃高压蒸
汽灭菌60～80min，再置于80℃的烘箱内烘干除去水分→倒入菌 种管中（高出1cm） → 4℃保存。
• 适用：霉菌、酵母菌、放线菌、好氧性细菌(xìjūn)等 • 保藏期：1～2年，或更长
常用的保护剂有脱脂牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等高 分子物质。
第三十四页，共四十六页。
复苏方法： —— 先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部， —— 将安瓿管顶部烧热， —— 用无菌棉签沾冷水，在顶部擦一圈，顶
部出现裂纹，用挫刀或镊子颈部轻叩一下， 敲下已开裂的安瓿管的顶端， —— 用无菌水或培养液溶解菌块，使用无菌 吸管移入新鲜培养基上，进行(jìnxíng)适温培养。
第二十九页，共四十六页。
➢ 砂土管干燥保藏法 • 措施(cuòshī)：无营养，缺氧，干燥 • 方法：孢子或芽孢悬液 → 加入无菌砂
土管中→ 干燥→ 封口 → 5℃保藏 • 适用：产孢子的丝状真菌、放线菌；有
芽孢的细菌 • 保藏期：1~10年或更长
第三十页，共四十六页。
沙土 管制作 (shātǔ)
另一方面，传代次数越多，群体中个别的衰退型细胞数量增加 并占据优势越快，致使群体表型出现衰退。
第六页，共四十六页。
3、不适宜的培养和保藏条件 不适宜的培养和保藏条件是加速菌种衰退的另一个重要原因。
不良的培养条件如营养成分、温度、湿度、pH值、通气(tōng qì)量 等和保藏条件如营养、含水量、温度、氧气等，不仅会诱发衰退 型细胞的出现，还会促进衰退细胞迅速繁殖，在数量上大大超过 正常细胞，造成菌种衰退。
食用菌育种学 第八章 菌种复壮与保藏
退化的可延缓性：要求菌种永远不退化是不可能的， 但积极采取措施，可使菌种优良特性延缓退化。
延缓退化的思路：在了解菌种退化原因后，减少传 代，科学保藏，经常纯化分离。
保藏方法通常有两，如低温保存法等
保藏方法的基本原理是抑制菌种的代谢活动，使之 停止繁殖，处于休眠状态。
“狭义复壮”：在菌种已发生退化的情况下，通过 纯化分离和测定生产性能等方法，从退化群体中找 出少数尚未衰退的个体，进一步繁殖，以达到恢复 该菌种原有典型性状的一种消极措施。
“广义复壮”：在菌种的生产性能尚未退化前就经 常有意识地进行纯种分离与生产性能的测定工作， 以保持菌种稳定的生产性状，甚至使其逐步提高的 一种积极措施。
简便有效，特别适合于非长期保藏的菌种以及不能 采用低温干燥方法保藏的菌种。
③缺点
A.存在自发突变：由于斜面含有营养和水分，菌种 生长繁殖未完全停止，代谢活动仍微弱进行。
B. 移植代数多：比其他保藏方法多，易发生变异和 引起退化；
C. 传代频繁：不仅影响菌种质量，也容易造成杂菌 污染；
D. 水分蒸发：造成浓度增高，渗透压加大，易引起 菌种退化甚至死亡。
三、菌种退化的防止
1. 尽量减少传代：减少自发突变的几率。 2. 菌种经常纯化： 3. 创造良好培养条件：适合原种的生长。 4. 用单核细胞移植传代：孢子。 5. 采用有效的菌种保藏方法：数量性状。
四、菌种的复壮及其方法
(一) 菌种复壮的原理
人们通过人工选择法分离筛选出那些原有优良性状的个体，使 菌种获得纯化，这一过程即复壮。
不良培养条件如营养成分温度湿度ph值通气量等和保藏条件如营养含水量温度氧气等不仅会诱发低产基因型菌株的出现而且会造成低产基因和高产基因细胞的数量比发生变化
延缓退化的思路：在了解菌种退化原因后，减少传 代，科学保藏，经常纯化分离。
保藏方法通常有两，如低温保存法等
保藏方法的基本原理是抑制菌种的代谢活动，使之 停止繁殖，处于休眠状态。
“狭义复壮”：在菌种已发生退化的情况下，通过 纯化分离和测定生产性能等方法，从退化群体中找 出少数尚未衰退的个体，进一步繁殖，以达到恢复 该菌种原有典型性状的一种消极措施。
“广义复壮”：在菌种的生产性能尚未退化前就经 常有意识地进行纯种分离与生产性能的测定工作， 以保持菌种稳定的生产性状，甚至使其逐步提高的 一种积极措施。
简便有效，特别适合于非长期保藏的菌种以及不能 采用低温干燥方法保藏的菌种。
③缺点
A.存在自发突变：由于斜面含有营养和水分，菌种 生长繁殖未完全停止，代谢活动仍微弱进行。
B. 移植代数多：比其他保藏方法多，易发生变异和 引起退化；
C. 传代频繁：不仅影响菌种质量，也容易造成杂菌 污染；
D. 水分蒸发：造成浓度增高，渗透压加大，易引起 菌种退化甚至死亡。
三、菌种退化的防止
1. 尽量减少传代：减少自发突变的几率。 2. 菌种经常纯化： 3. 创造良好培养条件：适合原种的生长。 4. 用单核细胞移植传代：孢子。 5. 采用有效的菌种保藏方法：数量性状。
四、菌种的复壮及其方法
(一) 菌种复壮的原理
人们通过人工选择法分离筛选出那些原有优良性状的个体，使 菌种获得纯化，这一过程即复壮。
不良培养条件如营养成分温度湿度ph值通气量等和保藏条件如营养含水量温度氧气等不仅会诱发低产基因型菌株的出现而且会造成低产基因和高产基因细胞的数量比发生变化
9-2菌种的衰退、复壮和保藏
衰退的原因： 大量群体中的自发突变
菌种衰退的表现
• 对产量性状来说，菌种的负变就是衰退。 • 其他原有的典型性状变得不典型时，也是衰退。 最易觉察到的是菌落和细胞形态的改变。 • 生长速度缓慢，产孢子越来越少。 • 代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降。 • 衰退还表现在抗不良环境条件（抗噬菌体、抗 低温等）能力的减弱等。
实践中复壮方法
• 1．纯种分离 。
• 2．通过宿主体内生长进行复壮 。
• 3．淘汰已衰退的个体
三、菌种的保藏
基本要求： 在一定时间内使菌种不死、不变、不乱
原理：
采用低温、干燥、缺氧、缺乏营养、添加保护剂或酸 度中和剂等方法，挑选优良纯种，最好时候它们的休 眠体，使微生物生长在代谢不活泼、生长受抑制的环 境中。
载体法
原理：使生长合适的微生物吸附在一定的载体上进行干燥。 常用的载体有土壤、砂土、硅胶、明胶、麸皮、磁珠 和滤纸片等。 操作方法（砂土管保藏法） （1）河砂处理 取河砂若干加入盐酸10% ，加热煮沸30min除去有机机质。 倒去盐酸溶液，用自来水冲洗至中性，最后一次用蒸镏水冲洗， 烘干后用40目筛子过筛，弃去粗颗粒，备用。 （２）土壤处理 取非耕作层不含腐殖质的痩黄土或红土，加自来水浸泡洗 涤数次，直至中性。烘干后碾碎，用100目筛子过筛，粗颗粒部 分丢掉。 (3)砂土混合 处理妥当的河砂与土壤按3：1的比例掺合(或根据需要而 用其他比例，甚至可全部作砂或土)均匀后，装入10x100mm的小 试管或安瓿管中，每管分装1g左右，塞上棉塞，进行灭菌(通常 采用间歇灭菌2--3次)，最后烘干。
从生长斜面制备菌悬液 从液体培养制备菌悬液
2．控速冷冻
致冷速度为1℃/min
(三)复苏
迅速将安瓿置于37-40℃水浴中，并轻轻摇动以加速解；用巴 氏吸管将安瓿中贮存培养物移接入含有2m1无菌液体培养 基的试管中，用同一支吸管反复抽吸数次，然后取0.10.2ml (约4、8滴)转接入琼脂斜面上。
菌种的衰退复壮和保藏
2、菌种保藏方法
1）斜面菌种低温保藏法---利用低温对微生 物生命活动有抑制作用的原理进行保藏。 把斜面菌种、固体穿刺培养物或菌悬液 等,直接放入4～5℃冰箱中。保藏时间一 般不超过3个月,到时必须进行移接传代, 再放回冰箱。
2）砂土管保藏法---将干燥砂粒与细土混合 后灭菌制成砂土管,然后接种保藏 。若把 砂土管放在低温或抽气后密封,效果更佳。 此法适用于产孢子及芽孢菌种的保藏。 保藏期1～10年 3）石蜡油封藏法---向培养好的菌种斜面上, 加入灭菌石蜡油,高出斜面1cm,然后蜡封 管口,放入冰箱。该法既可防止培养基水 分蒸发,又能使菌种与空气隔绝。保藏期 1～ 2年
美国的“美国典型菌种收藏所”(ATCC)，保藏 方式主要采用冷冻干燥和液氮超低温冻结法。
2、衰退的防止
（1）控制传代次数 （2）创造良好的培养条件 （3）利用不易衰退的细胞传代 （4）采用有效的菌种保藏方法
二、菌种的复壮
1、复壮的定义：
狭义复壮：指的是在菌种已在发生衰退的情况下，通 过纯种分离和测定典型性状，生产性能等指标，从 已衰退的群体中筛迁出少数尚未退化的个体，以达 到恢复原菌株固有的性状的相应措施。 广义的复壮：是一项积极的措施，即在菌种的典型特 征或生产性状尚未衰退前，主经常有意识地采服纯 种分离和生产性状的测定工作，以期众中选择到自 发的正变个体。
第五节 菌种的衰退、复壮和保藏
一、菌种的衰退及其防治 1、衰退：是指由于自发突变的结果，而使某种 原有一系列生物学性状发生量变或质变的现象。 如原有形态性状变得不典型了，生长速度变慢， 代谢产物生产能力下降，致病菌对宿主侵染力 的下降，对外界不良条件包括低温、高温或噬 菌体侵染等抵抗能力的下降等。
3、菌种保藏中心
我国由于1979年7月成立了中国微生物菌种 保藏管理委员会(CCCCM),
菌种的衰退、复壮和保藏
.
纯种的分离方法
平板划线分离法 菌落纯 平板涂布分离法
平板倾注分离法
细胞纯
用“分离小室”进行单细胞分离 显微操纵器进行单细胞分离 菌丝尖端切割法进行单细胞分离
.
三、菌种保藏
基本要求：
在一定时间内使菌种不死、不变、不乱
基本方法：
生活态
培养基传代培养 斜面、平板 寄主传代培养氮、低温冰箱 沙土管、冷冻真空干燥
.
2. 衰退的原因
1）根本原因在于基因自发突变； 2）传代次数的影响，使负突变株的比例逐渐占
了优势； 3）与培养条件有关。
衰退是发生在微生物细胞群体中的一 个由量变到质变的逐步演变的过程。
.
二、衰退的防止与复壮
（一）防止衰退的措施 p228
1. 减少传代次数； 2. 创造良好的培养条件； 3. 利用不易衰退的细胞传代 4. 采用有效的菌种保藏方法；
五、菌种的衰退、复壮与保藏 1. 菌种衰退的表现、原因与防止措施。 2. 菌种保藏的原理与常用的保藏方法。ATCC 和 CCCCM采用的菌种保藏法。
.
第九章 微生物的生态
生态学：
研究生物及其环境条件间相互作用规律的科学 。 根据生态学的研究对象和采用的研究方法不同, 生态学的 分类不同。
微生物生态学：
6. 筛选营养缺陷型突变株的主要步骤和方法， 淘汰野生型的方法
7. 抗生素高产突变株及抗性突变株的筛选方法。
8. 名词： 营养缺陷型，野生型，原养型，基本培养基， 完全培养基，补充培养基，点突变，转换， 颠换，移码突变，染色体畸变，光复活作用
.
三、基因重组与杂交育种 1. 了解原核生物和真核微生物基因重组的方式。 名词概念： 转化，转染，转导，普遍转导，局限转导， 低频转导，高频转导，双重溶源菌，接合，性导， Hfr菌株， 溶源转变。
纯种的分离方法
平板划线分离法 菌落纯 平板涂布分离法
平板倾注分离法
细胞纯
用“分离小室”进行单细胞分离 显微操纵器进行单细胞分离 菌丝尖端切割法进行单细胞分离
.
三、菌种保藏
基本要求：
在一定时间内使菌种不死、不变、不乱
基本方法：
生活态
培养基传代培养 斜面、平板 寄主传代培养氮、低温冰箱 沙土管、冷冻真空干燥
.
2. 衰退的原因
1）根本原因在于基因自发突变； 2）传代次数的影响，使负突变株的比例逐渐占
了优势； 3）与培养条件有关。
衰退是发生在微生物细胞群体中的一 个由量变到质变的逐步演变的过程。
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二、衰退的防止与复壮
（一）防止衰退的措施 p228
1. 减少传代次数； 2. 创造良好的培养条件； 3. 利用不易衰退的细胞传代 4. 采用有效的菌种保藏方法；
五、菌种的衰退、复壮与保藏 1. 菌种衰退的表现、原因与防止措施。 2. 菌种保藏的原理与常用的保藏方法。ATCC 和 CCCCM采用的菌种保藏法。
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第九章 微生物的生态
生态学：
研究生物及其环境条件间相互作用规律的科学 。 根据生态学的研究对象和采用的研究方法不同, 生态学的 分类不同。
微生物生态学：
6. 筛选营养缺陷型突变株的主要步骤和方法， 淘汰野生型的方法
7. 抗生素高产突变株及抗性突变株的筛选方法。
8. 名词： 营养缺陷型，野生型，原养型，基本培养基， 完全培养基，补充培养基，点突变，转换， 颠换，移码突变，染色体畸变，光复活作用
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三、基因重组与杂交育种 1. 了解原核生物和真核微生物基因重组的方式。 名词概念： 转化，转染，转导，普遍转导，局限转导， 低频转导，高频转导，双重溶源菌，接合，性导， Hfr菌株， 溶源转变。
菌种的衰退、复壮及保藏
第五节 菌种的衰退、复壮及保藏
一、菌种的衰退与复壮
1. 衰退 菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些 原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象。 衰退的原因：①基因突变 ②菌种不纯 ③ 培养条件不当 常见的衰退现象：
菌落和细胞形态的改变； 生长速度缓慢，产孢子越来越少； 代谢产物生产能力下降；
2. 原理： 选用优良的纯种（最好是休眠体，如分生孢子、芽胞
等），创造降低微生物代谢活动强度，生长繁殖受抑制，难 以发生突变的环境条件。（其环境要素是干燥、低温、缺氧、 缺营养 以及添加保护剂等）
3. 国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务 广泛收集科研和生产菌种、菌株，并加以妥善保管，使之达 到不死、不衰、不乱以及便于研究、交换和使用的目的。
菌种的复壮措施
①纯种分离：（平板划线法、涂布法、倾注法、单细胞挑 取法等）。 ②通过寄主体内生长进行复壮（如杀螟杆菌的复壮）； ③淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进行处理 ，以杀死生命力较差的已衰退个体）。 ④联合复壮，用高剂量的紫外线辐射和低剂量的亚硝基胍 联合处理
二、菌种保藏
1. 目的： ①存活，不丢失，不污染 ②防止优良性状丧失 ③随时为生产、科研提供优良菌种
2、 菌种的复壮
狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分 离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的 个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施； 广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经 常进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产 性能逐步提高。实际上是利用自发突变（正变）不断地从 生产中选种。
菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM) 美国的典型菌种保藏中心(ATCC) 英国国家典型菌种保藏所（NCTC） 法国里昂巴斯德研究所（IPL）
一、菌种的衰退与复壮
1. 衰退 菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些 原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象。 衰退的原因：①基因突变 ②菌种不纯 ③ 培养条件不当 常见的衰退现象：
菌落和细胞形态的改变； 生长速度缓慢，产孢子越来越少； 代谢产物生产能力下降；
2. 原理： 选用优良的纯种（最好是休眠体，如分生孢子、芽胞
等），创造降低微生物代谢活动强度，生长繁殖受抑制，难 以发生突变的环境条件。（其环境要素是干燥、低温、缺氧、 缺营养 以及添加保护剂等）
3. 国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务 广泛收集科研和生产菌种、菌株，并加以妥善保管，使之达 到不死、不衰、不乱以及便于研究、交换和使用的目的。
菌种的复壮措施
①纯种分离：（平板划线法、涂布法、倾注法、单细胞挑 取法等）。 ②通过寄主体内生长进行复壮（如杀螟杆菌的复壮）； ③淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进行处理 ，以杀死生命力较差的已衰退个体）。 ④联合复壮，用高剂量的紫外线辐射和低剂量的亚硝基胍 联合处理
二、菌种保藏
1. 目的： ①存活，不丢失，不污染 ②防止优良性状丧失 ③随时为生产、科研提供优良菌种
2、 菌种的复壮
狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分 离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的 个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施； 广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经 常进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产 性能逐步提高。实际上是利用自发突变（正变）不断地从 生产中选种。
菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM) 美国的典型菌种保藏中心(ATCC) 英国国家典型菌种保藏所（NCTC） 法国里昂巴斯德研究所（IPL）
菌种的复壮与保藏
基本程序
• 1安瓿管的处理
• 2 保护剂
直径8~10mm，长度不小于 100mm，洗净高压备用。 低分子和高分子化合物，如氨基酸、糖类、 蛋白质等。常用的是脱脂奶和血清。 最适培养条件、生长后期。产孢子的 微生物须适当延长培养时间以获得成熟的孢子。一般细菌 24~48h，酵母72h，放线菌和丝状真菌7~10d。
半固体穿刺保藏法 • 穿刺接种适宜半固体→培养→4℃保藏 • 适用：好气性细菌，酵母等 • 保藏期：6~12个月
用接种针从原菌种斜面上挑取少量菌体，从柱状 培养基中心自上而下刺入，至培养基的1/2处，待 微生物生长良好后覆盖2~3mm无菌液体石蜡.石蜡 可防止培养基失水又隔绝氧气,降低代谢.但不适用 于可以石蜡为碳源的微生物.如固氮菌、分枝杆菌 等。
常用的有蒸馏水、0.25MPBS或生理盐水，关 键是试管应密封好，以防水分蒸发。
低温保藏法 •方法：-20℃ •适用：无芽孢厌气菌，放线菌等 •保藏期：1年或更长
注意：融化后的菌种不能再用低温保存，要 重新移种后在冷藏。
三、菌种保藏的注意事项
• 菌种在保藏前所处的状态：孢子或芽孢 • 菌种保藏所用的基质：碳源 • 操作过程对细胞结构的损害
创造良好的培养条件
1)结构类似物抗性菌株在保藏培养基中应添加 相应药物，及时淘汰回复突变细胞。 2)基因工程菌添加抗生素于培养基中防止质粒 的丢失
采用有效的菌种保藏方法
从菌种管理的措施上考虑
菌种复壮
二、菌种的复壮
侠义的复壮 ：菌种已经发生衰退后，再通过纯
种分离和性能的测定等方法，从衰退的群体中 找出尚未衰退的少数个体，以达到恢复该菌种 原有典型性状的一种措施。
•低温保藏法
斜面保藏法 • 接种适宜斜面培养基 →培养→4℃保藏 • 适用：各大类 • 保藏期：3~6个月 • 缺点：保存期短，传代多，易退化
菌种保藏与复壮
学习情景2-4
菌种保藏与复壮
一、菌种保藏
（一）保藏目的及原理 （二）常用保藏法 （三）保藏注意
二、菌种复壮
(一）菌种的衰退 （二）复壮方法 （三）防衰措施
返回本章
一、菌种保藏
（一）保藏目的及原理 目的 不死亡 不生长 不污染 使菌种 不降低或不丧失其优良性 原理
以尽量延长使用时间
创造不利于菌种生长的一切条件， 使其代谢处于休眠状态。
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口堵胶塞 淹没斜面约1cm
用时转管再转管
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3.自然基质保藏法
麦粒浸透、煮熟 基质的处理 麸皮拌湿 装管
灭菌
接种
培养
干燥器去水
防衰老 特点 保藏时间长 转接后生长旺 易污染，灭菌要彻底
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（三）保藏注意
用保种培养基
及时保藏（菌丝占斜面2/3）
最好换胶塞 用时活化
严防棉塞受潮
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二、菌种的复壮
概念 确保或恢复菌种优良性能的措施
（一）菌种的衰退 表现 形态改变、生长慢、 抗逆性差、产量及质量下降 内因 菌种的遗传物质发生了负变 外因 传代过多，条件不适宜
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根源
（二）复壮法 组织分离 母种 孢子分离
1.繁殖交替法
再生 母种
栽培
子实体
2. 经常改变培养条件 3.转管时只取Leabharlann 端菌丝返回本节低温
缺营养
不利 条件
干燥
无氧
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（二）常用保藏法 以母种形式保藏 1.斜面低温法 斜面菌种置4~6℃冰箱中（3~6个月） 简便 保藏时间短 易污染及退化 不适于草菇等菌类
特点
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菌种保藏与复壮
一、菌种保藏
（一）保藏目的及原理 （二）常用保藏法 （三）保藏注意
二、菌种复壮
(一）菌种的衰退 （二）复壮方法 （三）防衰措施
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一、菌种保藏
（一）保藏目的及原理 目的 不死亡 不生长 不污染 使菌种 不降低或不丧失其优良性 原理
以尽量延长使用时间
创造不利于菌种生长的一切条件， 使其代谢处于休眠状态。
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口堵胶塞 淹没斜面约1cm
用时转管再转管
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3.自然基质保藏法
麦粒浸透、煮熟 基质的处理 麸皮拌湿 装管
灭菌
接种
培养
干燥器去水
防衰老 特点 保藏时间长 转接后生长旺 易污染，灭菌要彻底
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（三）保藏注意
用保种培养基
及时保藏（菌丝占斜面2/3）
最好换胶塞 用时活化
严防棉塞受潮
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二、菌种的复壮
概念 确保或恢复菌种优良性能的措施
（一）菌种的衰退 表现 形态改变、生长慢、 抗逆性差、产量及质量下降 内因 菌种的遗传物质发生了负变 外因 传代过多，条件不适宜
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根源
（二）复壮法 组织分离 母种 孢子分离
1.繁殖交替法
再生 母种
栽培
子实体
2. 经常改变培养条件 3.转管时只取Leabharlann 端菌丝返回本节低温
缺营养
不利 条件
干燥
无氧
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（二）常用保藏法 以母种形式保藏 1.斜面低温法 斜面菌种置4~6℃冰箱中（3~6个月） 简便 保藏时间短 易污染及退化 不适于草菇等菌类
特点
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第十三章 工业微生物菌种复壮和保藏
通过物理、化学的方法处理菌体(或孢子)，使大 部分死亡(80%以上)，存活的菌多为生长健壮者，可 从中选出优良菌种来。
3. 宿主体内复壮法
对于寄生性微生物如苏云金杆菌、白僵菌、多角体 病毒等，由于长期使用，其毒力会下降，导致杀虫效率 降低待衰退现象。这时可以用菌种却感染菜青虫幼虫等， 然后从致死的虫体上重新分离，经过几次重复感染与分 离，就可以逐步恢复和提高毒力。
3、干燥保藏法
（1）砂土管保藏法
常采用的保藏方法之一，创造和大自然一样的环境， 在低温、干燥、缺氧、缺营养条件下保藏。主要用于保 藏产孢子的放线菌、霉菌及产芽孢的细菌。
（2） 滤纸条保藏法
将菌体细胞或孢子吸附在湿的无菌滤纸上，再干燥后 置于低温保藏。适合霉菌、酵母和细菌的保藏。
3. 无水硅胶保藏法
三、菌种保藏机构
（一）国内重要菌种保藏机构
（二）国外重要菌种保藏机构
思考题
1、 简答菌种保藏的基本原理和原则。 2、 如何防止菌种退化？ 3、 常用的工业微生物菌种保藏技术有哪些？
（二）连续移代
菌种移接代数越多，发生突变的概率就越高。
（三）培养和保藏条件的影响
不良的培养条件，如培养基组成、pH值、通气等和 保藏条件如营养、培养基含水量，温度、氧气等，不仅 会诱导低产基因型菌株的出现，而且会造成低产基因和 高产基因细胞的数量比发生变化。
二、菌种退化的防止
要采用减少传代、经常纯化、创造良好的培养条 件，用单细胞移植传代以及科学的保藏方法等措施， 不但可以使菌种保持优良的生产能力，而且还能使 已退化的菌种得到恢复提高。
第十三章 工业微生物菌种复壮无法正常进行。 影响微生物菌种稳定性的因素： a）变异； b）污染； c）死亡。
第一节 菌种的退化与复壮
3. 宿主体内复壮法
对于寄生性微生物如苏云金杆菌、白僵菌、多角体 病毒等，由于长期使用，其毒力会下降，导致杀虫效率 降低待衰退现象。这时可以用菌种却感染菜青虫幼虫等， 然后从致死的虫体上重新分离，经过几次重复感染与分 离，就可以逐步恢复和提高毒力。
3、干燥保藏法
（1）砂土管保藏法
常采用的保藏方法之一，创造和大自然一样的环境， 在低温、干燥、缺氧、缺营养条件下保藏。主要用于保 藏产孢子的放线菌、霉菌及产芽孢的细菌。
（2） 滤纸条保藏法
将菌体细胞或孢子吸附在湿的无菌滤纸上，再干燥后 置于低温保藏。适合霉菌、酵母和细菌的保藏。
3. 无水硅胶保藏法
三、菌种保藏机构
（一）国内重要菌种保藏机构
（二）国外重要菌种保藏机构
思考题
1、 简答菌种保藏的基本原理和原则。 2、 如何防止菌种退化？ 3、 常用的工业微生物菌种保藏技术有哪些？
（二）连续移代
菌种移接代数越多，发生突变的概率就越高。
（三）培养和保藏条件的影响
不良的培养条件，如培养基组成、pH值、通气等和 保藏条件如营养、培养基含水量，温度、氧气等，不仅 会诱导低产基因型菌株的出现，而且会造成低产基因和 高产基因细胞的数量比发生变化。
二、菌种退化的防止
要采用减少传代、经常纯化、创造良好的培养条 件，用单细胞移植传代以及科学的保藏方法等措施， 不但可以使菌种保持优良的生产能力，而且还能使 已退化的菌种得到恢复提高。
第十三章 工业微生物菌种复壮无法正常进行。 影响微生物菌种稳定性的因素： a）变异； b）污染； c）死亡。
第一节 菌种的退化与复壮
食用菌生产技术 第十一章 菌种的退化、复壮和保藏
菌 种 保 藏 方 法
连续在培养基上（内）移种
生活态
传代培养保藏法 固体斜面 湿法
连续在活宿主上（内）移种
半固体琼脂柱 液体介质（蒸馏水、糖液、其它溶液） 藏在玻璃管内 吸附在合适的载体上
休眠态 干法
干法保藏菌种的方法
藏在玻璃管内 滴入小试管（在放入大试管干燥器中） 封入安培瓶 菌液直接真空干燥法（L-干燥法） 冷冻真空干燥法 细粒状载体（土壤、沙粒、土壤+沙粒） 球块状载体（硅胶、瓷球） 有机基质（曲料、麦粒） 滤纸片 薄片状载体 明胶小片（滴在蜡纸板上干燥而成） 血清蛋白小片（…乙烯薄膜… ）
微生物而言，通常采用稳定的单核孢子进行接种。
பைடு நூலகம்
④采用有效的菌种保藏方法
二、菌种的复壮
复壮——狭义的复壮 ——狭义的复壮 狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况
下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰 退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌 原有典型性状的措施； 广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有 广义的复壮 意识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工 作，以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利 用自发突变（正变）不断地从生产中选种。
2、通过宿主体内生长进行复壮(即寄主复壮) 通过宿主体内生长进行复壮(即寄主复壮) 淘汰已衰退的个体(即遗传育种) 3、淘汰已衰退的个体(即遗传育种)
以退化菌株作为出发菌株,重新进行遗传育种, 以退化菌株作为出发菌株,重新进行遗传育种,从中 选出高产菌株;采用比较激烈的理化条件进行处理， 选出高产菌株;采用比较激烈的理化条件进行处理， 以杀死生命力较差的已衰退个体
3、防止菌种退化的措施 、 3、防止退化的措施 ①控制传代次数 控制传代次数（一般在DNA的复制过程中， 碱基的错配率是5×10-4，自发突变的频率为 10-8～10-9，采用良好的菌种保藏方法，可以 减少移种和传代的次数） ②创造良好的培养条件 ③利用不同类型的细胞进行移种传代。对丝状 利用不同类型的细胞进行移种传代。
发酵工程——菌种的衰退、复壮和保藏
植物离体种质库； 稀有濒危特有植物种质库； 海洋生物种质库。 其中菌株13000株。 现藏培养物16000个株系，
国外菌种保藏机构 1）美国典型菌种保藏中心（ATCC）
位于马里兰州，现藏细菌8000株，丝状真菌
4400株，酵母菌606株及其他菌种千余株。保藏 方法主要以冷冻干燥和液氮超低温冻结法。 2）荷兰真菌中心收藏所（CBS） 位于荷兰巴尔恩市，现藏细菌1000株，丝状
斜面保藏法
• 因此要求在基本培养基上传代为好，目的是能 淘汰突变株；同时转接菌量应保持较低水平。 • 斜面培养物应在密闭容器中于4℃保藏，以防止 培养基脱水并能降低代谢活性。 • 保存期2个月到6个月
穿刺保藏法 • 斜面保藏法的改进 • 常用于好气性细菌的保藏，真菌、放线菌等 • 1~2cm高的穿刺培养物上覆盖2 ~3mm的液体 石蜡
举例： 产链霉素放线菌菌种分离（从退化菌 种中筛选）
取工业发酵液（含孢子）样品1环 放入带玻璃珠的装有10ml 无菌水的小三角瓶中，摇匀
采用稀释法制平板，获取单菌落
斜面保藏
高产菌恢复
根据高产菌的特点，选择目的菌落
放大培养，发酵液性能测试
三、 菌种保藏的原理和方法
菌种保藏的意义 菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本材 料，特别是利用微生物进行有关生产如抗生素、 氨基酸、酿造等工业，更离不开菌种。所以菌种 保藏是进行微生物学研究和微生物育种工作的重 要组成部分。其任务首先是使菌种不致死亡，同 时还要尽可能设法把菌种的优良特性保持下来而 不致向坏的方面转化。
国内菌种保藏机构 2）林业微生物菌种保藏中心 1985年成立，由林科院负责，侧重林业微生物
的菌种保藏，现保藏菌种690余株；
国内菌种保藏机构 3）中国科学院典型培养物保藏管理中心
国外菌种保藏机构 1）美国典型菌种保藏中心（ATCC）
位于马里兰州，现藏细菌8000株，丝状真菌
4400株，酵母菌606株及其他菌种千余株。保藏 方法主要以冷冻干燥和液氮超低温冻结法。 2）荷兰真菌中心收藏所（CBS） 位于荷兰巴尔恩市，现藏细菌1000株，丝状
斜面保藏法
• 因此要求在基本培养基上传代为好，目的是能 淘汰突变株；同时转接菌量应保持较低水平。 • 斜面培养物应在密闭容器中于4℃保藏，以防止 培养基脱水并能降低代谢活性。 • 保存期2个月到6个月
穿刺保藏法 • 斜面保藏法的改进 • 常用于好气性细菌的保藏，真菌、放线菌等 • 1~2cm高的穿刺培养物上覆盖2 ~3mm的液体 石蜡
举例： 产链霉素放线菌菌种分离（从退化菌 种中筛选）
取工业发酵液（含孢子）样品1环 放入带玻璃珠的装有10ml 无菌水的小三角瓶中，摇匀
采用稀释法制平板，获取单菌落
斜面保藏
高产菌恢复
根据高产菌的特点，选择目的菌落
放大培养，发酵液性能测试
三、 菌种保藏的原理和方法
菌种保藏的意义 菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本材 料，特别是利用微生物进行有关生产如抗生素、 氨基酸、酿造等工业，更离不开菌种。所以菌种 保藏是进行微生物学研究和微生物育种工作的重 要组成部分。其任务首先是使菌种不致死亡，同 时还要尽可能设法把菌种的优良特性保持下来而 不致向坏的方面转化。
国内菌种保藏机构 2）林业微生物菌种保藏中心 1985年成立，由林科院负责，侧重林业微生物
的菌种保藏，现保藏菌种690余株；
国内菌种保藏机构 3）中国科学院典型培养物保藏管理中心