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2、非接合型质粒(不能自我转移):虽然带有自我复制所必需的遗传信息, 但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因,因此不能从一个细胞转移到另一
个细胞。如R质粒(抗生素抗性质粒)和Col质粒(大肠杆菌素colicin )。符合 基因工程的安全要求。
大肠杆菌素是大肠杆菌分泌的一类细菌素(bacteriocin),对于其他不能分泌特异性大肠 杆菌素免疫蛋白(Immunity protein)的细菌具有杀灭作用,现在一般认为有调节菌群数 量的作用。 大部分大肠杆菌素由质粒编码,其中最著名的没过于pColE1 。
第三章 基因工程载体
生物科学与技术学院
基因工程载体的概念
把一个有用的基因(目的基因——研究或应用基因)通过基因 工程手段送到生物细胞(受体细胞),需要运载工具(交通工 具)携带外源基因进入受体细胞,这种运载工具就叫载体。作 为基因工程载体,质粒至少应该具备复制的起始区、选择标记 基因区、多克隆位点等部分。
之、ocDNA最慢。
质粒的类型:
在大肠杆菌中的质粒,可以分为:
1、接合型质粒(能自我转移):除了带有自我复制所必需的遗传信息外还带 有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。如:F质粒(性质粒、或F因子)。 甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。不 符合基因工程的安全要求。
质粒的空间构型:
1. 共价闭合环状DNA(Covalent close circular DNA,cccDNA),呈超螺旋 (SC)(super coil)
2. 开环DNA(open circular,ocDNA), 一条链上有一至数个缺口
3. 线形DNA(linear,lDNA)
质粒空间构型与电泳速率: 同一质粒尽管分子量相同,不同的构型电泳迁移率不同,scDNA最快、lDNA次
人工构建的质粒载体的类型
高拷贝数的质粒载体 pColE1、pMB1派生质粒具有高拷贝数的特点。在没有菌体蛋白质合成的条件下 (蛋白质合成抑制剂,氯霉素等存在下)仍能复制,达到每个细胞的拷贝数 1000—3000个。适合大量增殖克隆基因、或需要表达大量的基因产物。 低拷贝数的质粒载体 由pSC101派生来的载体特点是分子量小,拷贝数低,不适合大量扩增DNA用。但 当有些被克隆的基因的表达产物过多时会严重地影响寄主菌的正常代谢活动,导 致寄主菌死亡时,就需要低拷贝的载体。如pLG338、pLG339、pHSG415等。 失控的质粒载体 温度敏感型复制控制质粒,温度低于37度,拷贝数很少; 温度增加,大于40度 时,拷贝数会很快增加到1000个以上。B. E. Uhlin于1979年构建的载体如pBEU1、 pBEU2等。
1、分子量大,拷贝数低,第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101,分子长 9.1 kb。但只 有一个EcoR I切点充当克隆位点,Tetr 作为筛选标志。EColR I 酶切位点位于Tetr 基因外 部,外源基因插入不会引起筛选基因失活,因此无法区别重组体和野生型质粒。 2、天然质粒ColE1质粒,长度为6.3 kb,唯一的EcoRI酶切位点位于筛选标志基因大肠杆 菌素E1(colicin E1)内部。colicin E1能杀死不含ColE1 质粒的菌,形成“噬菌斑”。可 以通过插入失活筛选。但细菌群体容易自发突变出抗colicin E1的细胞。
质粒的命名 用小写字母p代表质粒(plasmid),在p字母后用两个大写字母代表发现这一质 粒的作者或实验室名称,再加上质粒编号。如:pBR322:p表示一种质粒,而 “BR”则是分别取自该质粒的两位主要构建者F. Bolivar和R. L. Rodriguez,322 为编号。
质粒载体的构建
天然质粒的局限性
插入失活型质粒载体 载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。如pDF41、pDF42、pBR329。
正选择的质粒载体 直接选择转化后的细胞。只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生
长。如pUR2、pTR262等。目前通用的绝大部分质粒载体都是正选择载体。 表达型质粒载体
Apr转化子 Tcr转化子
影印到Tc平板上 影印到Ap平板上
Apr TcS为重组子 ApS Tcr为重组子
Apr Tcr为原载体
即为非重组子
Ampr
Tc
1)限制酶切 2)DNA重组
无DNA插入
Ampr Tcr
转化
有DNA插入 外源DNA
Ampr Tcs
Ampr Tcr
Ampr Tcs
无菌落
筛选重组子
利用抗生素抗性基因筛选重组子的过程
pBR322 外源DNA
BamHI片段(Tcr) PstI(Apr)片段 PstI片段 BamHI片段
重组分子Ⅱ (Aps Tcr)
重组分子I (Apr Tcs)
重组分子I
(Apr Tcs)
重组分子Ⅱ (Aps Tcr)
分别转化E.coli (ApS TcS)
涂布Ap平板 涂布Tc平板
主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。注意启动子的性质,终止子、起始密码、终 止密码的阅读正确。如果在大肠杆菌里表达,必须把所克隆的真核生物的基因置于大肠杆
菌的转录—翻译信号控制之下。
克隆质粒载体
专Leabharlann Baidu于基因和DNA片段无性繁殖的质粒载体。纯粹的获取基因和DNA片段。
常用的质粒载体 pBR322
1、元件来源 复制起点 ori pMB1系列(来源于ColE1)的高拷贝型复制起点 Ampr基因 pSP2124质粒的Ampr基因 Tetr基因 pSC101的Tetr 基因。 2、长度 4363bp 3、选择标记 氨苄青霉素和四环素抗性 4、克隆位点 24个克隆位点,其中9个会导致Tetr基因失活(如BamH I、Hind Ⅲ、Sal I); 3个会导致Ampr基因失活(Sca I、PvuI、Pst I)。
质粒的复制过程 质粒的复制主要是通过θ型复制和滚环复制两种方式之一进行的,其中以θ型
复制为主。在θ型复制中,有单向半保留复制和双向半保留复制。
θ型复制
Ori复制起点
滚环复制
在革兰氏阳性细菌中大多数质粒是以滚环方式复制。
复制起点(ori)区的功能 复制起点是一段特定的DNA序列,长约几百碱基对,在其相关的调控元件中 含有由质粒或宿主染色体编码的、参与DNA合成起始调控因子的结合位点。 在大多数质粒中,与复制有关的蛋白质基因位于ori序列附近,因此ori位点周 围的小范围DNA是质粒复制所必需的。 如果质粒DNA的大部分区域被去掉,而只保留质粒的ori序列,而且质粒是环 状的,则质粒仍然能进行复制。 将ori区克隆到一个不能自主复制的环状双链DNA分子上并引入到原核细胞后, 该重组DNA具有自主复制能力。分子克隆中常用的质粒载体就是以这种方法构建 的,同时用这种方法可以确定哪部分DNA是ori区并研究ori区的功能。 ori区域常决定了质粒的许多特性,如质粒的寄主范围和质粒的拷贝数。
2长度4363bp3选择标记氨苄青霉素和四环素抗性4克隆位点24个克隆位点其中9个会导致tet基因失活如bamhihindsal基因失活scaipvuipst17171818利用抗生素抗性基因筛选重组子的过程利用抗生素抗性基因筛选重组子的过程bamhi片段tcpbr322pstiap片段重组分子appsti片段外源dnabamhi片段重组分子iap分别转化ecoliap重组分子ap影印到tc平板上ap为原载体即为非重组子影印到ap平板上重组分子iap涂布ap平板ap转化子涂布tc平板tc转化子ap为重组子ap19192020pbr322的优点双抗菌素抗性选择标记没有获得载体的寄主细胞在amp或tet中都死亡
理想质粒载体必须具备的基本条件:
1、具有复制起点(ORI) 2、具有抗菌素抗性基因:是筛选的标志。理想的载体应该有两种抗菌素抗性 基因。 3、若干限制性内切酶的单一位点:用来插入外源DNA片断。且插入后不影响 复制功能。 4、具有较小的分子量和较高的拷贝数。
质粒的选择标记及其工作原理:
抗菌素抗性
复制的起始区:能在宿主细胞内进行独立和稳 定的自我复制。 选择标记基因区:可以筛选重组体。 多克隆位点:方便外源基因的插入。
第一节 质粒载体
质粒(plasmid):是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。 广泛存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。
质粒 染色体
质粒的一般生物学特性: 分子大小差异大:1—200 kb 编码基因少:2—3个中等大小的蛋白质。如抗菌素抗性、代谢特征等,赋予细 菌一些额外的特性(非必须)。 形状:双链环状DNA;线性双链DNA;超螺旋等。
3、克隆位点 10个连续的单一限制酶切位点,位于lacZ’基因的5`端。 4、选择标记 PUC系列质粒载体的选择标记是Ampicillin 抗性和 lacZ的a肽互补(蓝白斑)相结合。
乳糖操纵子调节机制
乳糖操纵子(lac operon)的结构
β-半乳糖苷酶
-半乳糖苷酶和Xgal的显色反应
-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断(11-41氨基酸),也叫-肽( lacZ’ ) 。
绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记.
氨苄青霉素抗性(Ampr):青霉素的衍生物。氨苄青霉素通过干扰细菌细胞壁合成的末端反应,杀死 生长的细菌。 Ampr基因编码-内酰胺酶,特异地切割氨苄青霉素的-内酰胺环。 卡那霉素抗性(Kanr) :卡那霉素通过与70S核糖体结合,导致mRNA发生错读,从而杀死细菌。Kanr 编码的氨基糖苷磷酸转移酶,对卡那霉素进行修饰,阻断其与核糖体结合作用。 四环素抗性(Tetr):四环素通过于30S核糖体亚基结合,干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。 杀死生长的细菌。Tetr 编码特异性蛋白质,对细菌的膜结构进行修饰,组止四环素通过细胞膜进入细 菌细胞内。 链霉素抗性(Strr) :链霉素通过与30S核糖体亚基结合,导致mRNA错译,从而杀死细菌。Strr 编码 一种氨基糖苷磷酸转移酶对链霉素进行修饰,阻断其与核糖体30S亚基结合作用。 氯霉素抗性(Cmlr):氯霉素通过与50S核糖体亚基结合,干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。 杀死生长的细菌。Cmlr 编码乙酰转移酶,特异地使氯霉素乙酰化而失活。
pBR322的缺点
保留了转移蛋白(mob)的作用位点。能够被pColK质粒编码的mob蛋白识别, 如果再有F质粒的参与,就有可能转移!
pBR322的改良
删除mob识别位点 如pAT153,pBR322的改造衍生质粒,除去了mob识别位点,同时增加质粒的
拷贝数。 改造EcoR I 位点
如pBR325,使EcoRI 也成为插入失活型位点。在pBR322位点上接入一段来 自噬菌体PICm的HaeII酶切片断(带有氯霉素抗性基因cmlr)。 cmlr上也带一个 EcoRI位点。
阳性菌落
Ampr Tcs
影印
提取DNA 电泳
重组DNA
pBR322的优点
双抗菌素抗性选择标记 没有获得载体的寄主细胞在Amp或Tet中都死亡。获得载体的寄主细胞在 Amp或Tet其中之一中死亡。 分子小,克隆能力大 载体越小越好。 >10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。 高拷贝数 氯霉素扩增之后,每个细胞可达1000~3000copy。 安全 失去了转移蛋白基因mob(mobilization)。不能通过接合转移。
质粒的复制类型
严紧型质粒(stringent plasmid):拷贝数少,只有1—3份拷贝。(接合型质 粒分子量大,一般属严紧型)。
松弛型质粒(relaxed plasmid):拷贝数多,有10—60份拷贝。(非接合型 质粒分子量小,一般属松弛型)。
质粒的不相容性
又称质粒的不亲和性,在没有选择压力的情况下,两种亲缘关系密切的不同 质粒,不能够在同一个寄主细胞系中稳定共存,这一现象称为质粒的不相容性, 又称质粒的不亲和性。
cmlr
常用的质粒载体 pUC系列
University of California的J. Messing和J. Vieria于1978年,在pBR322的基础上改造 而成。属正选择载体。如pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19。 1、元件来源 复制起点ori---pBR322的 ori Ampr 基因---pBR322的Ampr基因 大肠杆菌β -半乳糖基因(lacZ’基因) 多克隆位点(MCS)区段---位于lacZ’基因 中的靠近5`-端。 2、长度 约2.7kb
质粒载体的发展概况
第一阶段(1977年前):天然质粒和重组质粒的利用,如pSC101, colE1, pCR, pBR313 和pBR322。 第二阶段:增大载体容量(降低载体长度),建立多克隆位点区和新的遗传标记基因,如 pUC系列载体。 第三阶段:完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求,如M13mp系列载体,含T3, T7,sp6启动子载体,表达型载体及各种探针型载体。
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